高精度PCR技術在肝病診療中的價值課件

PCR技術在肝病診療中的價值

病毒性肝炎感染世界性流行，是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。據世界衛(wèi)生組織報道，全球60億人口中，約20億人曾感染過或正感染HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有60萬人死于與HBV感染相關的肝病。近年來，我國在慢性乙型肝炎（乙肝）防治領域取得了重要進展。“十一五”重大傳染病專項計劃病毒性肝炎重大研究專項啟動2009年，我國病毒性肝炎領域最重要的進展是國家“十一五”重大傳染病專項計劃:“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項啟動（見表1）。這是“十一五”期間與“載人航天與探月工程、大型飛機”等相平行的16個重大專項計劃之一。主要內容臨床對高靈敏度乙肝病毒核酸定量的需求我國乙肝病毒核酸定量PCR檢測技術現狀艾迪康提供兩種高靈敏度病毒核酸檢測血清HBVDNA水平是臨床上評價HBV復制情況的“金標準”HBVDNAHBVDNA貫穿感染者的終生ALT正常增高或者波動正常增高或者波動免疫耐受期免疫清除期非活動或低（非）復制期再活動期肝組織學無明顯異常,或輕度炎癥纖維化中度或嚴重炎癥、纖維化快速進展無炎癥或僅有輕度炎癥中度或嚴重炎癥、肝纖維化臨床診斷慢性HBV攜帶者HBeAg陽性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化非活動性HBsAg攜帶者HBeAg陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化LokAS,etal.Hepatology.2009;50:661-662LiawYF,LiverInternational,2009,29(s1):100-1-72012：HBVDNAdetectionandHBVDNAlevelmeasurementareessentialforthediagnosis,decisiontotreatandsubsequentmonitoringofpatients(A1).Follow-upusingrealtimePCRquantificationassaysisstronglyrecommendedbecauseoftheirsensitivity,specificity,accuracyandbroaddynamicrange[38–41](A1).2009：Recently,HBVDNAassaysthatutilizereal-timePCRtechnologywithimprovedsensitivity(5-10IU/mL)andwiderdynamicrange(upto8-9log10IU/mL)havebecomeavailable乙肝治療指南：美國和歐洲Hepatology,2009JHepatol,2012HepatolInt，2012乙肝治療共識：2012亞太(1)HepatolInt，2012乙肝治療共識：2012亞太(3)HBVDNA載量檢測在治療優(yōu)化路線圖中的作用抗病毒治療前病毒基線的準確測定：—適宜抗病毒治療患者選擇、抗病毒治療方案的確定、抗病毒療效的預測與后續(xù)療效比對抗病毒治療過程中療效的評估和方案優(yōu)化、耐藥突變檢測和治療終點的確認抗病毒優(yōu)化治療停藥后隨訪及復發(fā)再治的判斷隱匿性病毒性肝炎的診斷高靈敏度核酸定量檢測的臨床意義HBV核酸定量PCR檢測的國際指南要求超敏感性（Hypersensitivity）—HBV最低檢測限＜10-15IU/ml寬線性范圍（widerdynamicrange）—涵蓋101~109IU/ml高特異性（Highspecificity）可重復性好（Repeatability）主要內容臨床對高靈敏度乙肝病毒核酸定量的需求我國乙肝病毒核酸定量PCR檢測技術現狀艾迪康提供兩種高靈敏度病毒核酸檢測HBVDNA檢測臨床應用斑點雜交（Dot-blothybridization）非定量PCR（Non-PCRbasedquantitativeHBVDNAassays定量PCR-basedquantitativeHBVDNAassays1980s1990s2000s血清HBVDNA定量目前多以熒光實時PCR技術作為檢測手段；HBVDNA定量的表達多以拷貝/毫升（copies/ml）或國際單位/毫升（IU/ml）表達，二者之間粗略的換算方法為1IU/ml=5copies/ml。血清HBVDNA定量檢測的發(fā)展方向為更高敏感性（sensitivity）和更寬的動態(tài)范圍（dynamicrange）。國產HBVDNAPCR試劑性能現狀中華檢驗醫(yī)學雜志，2012現有的國產試劑在檢測靈敏度、線性范圍、可重復性等方面無法滿足臨床上日益增加的對HBVDNA定量準確性和靈敏度的要求

部分試劑缺乏內參，影響定量準確性

主要內容臨床對高靈敏度乙肝病毒核酸定量的需求我國乙肝病毒核酸定量PCR檢測技術現狀艾迪康提供兩種高靈敏度病毒核酸檢測20例患者組成特點--9例服用ETV、11例服用ADV（48周）--10例大三陽、8例小三陽患者、2例小二陽患者檢測試劑病例數HBVDNA分布范圍國產HBV20例<1000copies/mlCAP/CTMHBV11例8例*

1例TargetNotDetected103~104copies/ml104~105copies/ml*包括1例服用ETV患者高靈敏度HBVDNA檢測及時判斷病毒突破、及時調整治療決策高靈敏核酸檢測與普通核酸檢測比較數據來源：北京大學人民醫(yī)院普通PCR法“假陰性”率高達45%(9/20)以核苷類藥物為基礎的治療：

用藥24周時（拉米夫定/替比夫定）或48周時（阿德福韋）出現病毒學應答（HBVDNA檢測不到），則可預測耐藥的發(fā)生率低，亦即持續(xù)病毒學應答的機會得到提高，并且HBeAg陽性患者抗HBe血清學轉換的機會更高。乙肝治療期應答的預測因素：HBVDNA高靈敏度檢測方法在治療中的應用以NAs為基礎的治療HBeAg陽性患者NAs有限療程治療:1.應每6個月檢測HBeAg和抗HBe，在治療期間每3-6個月通過敏感的PCR方法檢測HBVDNA;2.抗HBe血清學轉換之后，應每間隔12個月檢測HBsAgNAs長期治療：1.理想上，應達到HBVDNA下降至實時PCR檢測不到的水平（即低于10–15IU/ml）以避免耐藥，因而HBVDNA監(jiān)測是檢測治療失敗的關鍵;2.在第3個月時應檢測HBVDNA水平以查明病毒學應答情況，然后每3-6個月檢測。摘自2012年《EASL臨床實踐指南：慢性乙肝病毒感染管理》

2.監(jiān)測治療高靈敏度檢測方法在治療中的應用3.P區(qū)耐藥監(jiān)測和判斷條件高靈敏度檢測方法在治療中的應用抗病毒治療后HBV從病毒變異到臨床耐藥原發(fā)無應答病毒學（部分）應答臨床耐藥小結1.高靈敏度乙肝DNA檢測：羅氏Cobas/磁珠法：靈敏度高、線性范圍廣，檢測結果準確，滿足國際標準。2.P區(qū)耐藥：用藥無進展或治療效果反彈，考慮檢測P區(qū)耐藥。高靈敏度丙肝RNA檢測病毒學反應定義SVR(持續(xù)病毒學應答)治療停止后24周血清HCV-RNA檢測陰性(<50IU/mL)RVR(快速病毒學應答)治療4周時，HCVRNA轉陰(<50IU/mL)EVR(早期病毒學應答)cEVR(完全EVR)治療12周時，HCVRNA轉陰（低于檢測低限(<50IU/mL）pEVR(部分EVR)治療12周時，HCVRNA陽性，但是相對于治療前基線下降≥2log10非EVR(非早期病毒學應答)治療12周時，HCVRNA下降<2log10

值病毒學應答的檢測及定義摘自2012年《EASL臨床實踐指南：丙肝病毒感染管理》

高靈敏度丙肝RNA檢測治療開始第4周、12周和24周進行血清病毒載量測定有助于調整治療方案；（這些時間點發(fā)生HCVRNA病毒消失直接與SVR呈正比）必須要進行治療結束后病毒學應答和治療結束24周的SVR評估；非合并肝硬化而達到SVR患者，治療后48周和96周要檢測ALT和HCVRNA，以確保ALT正常同時血清病毒呈陰性；可能出現疾病復發(fā)：患者達到了治療結束時的病毒學應答(治療結束時血清HCVRNA病毒未檢出)，但是隨后病毒學指標惡化，未達SVR。

標準治療方案的復發(fā)率介于15%-25%，數值的變化取決于治療期間HCVRNA轉陰時間。摘自2012年《EASL臨床實踐指南：丙肝病毒感染管理》

診斷與監(jiān)測治療高靈敏度丙肝RNA檢測

“應選擇靈敏的檢測法進行HCVRNA定性和定量檢查(檢測限的低限值≤50IU/ml)，理想的病毒學檢測方法是RT-PCR法，檢測結果的單位應為IU/ml?！盓ASL（歐洲肝臟研究學會）指南1“治療HCV感染的期望臨床終點是清除病毒，即采用最敏感的方法也無法檢測到血清HCV病毒RNA，因此實驗室內部檢測應采用real-timePCR的方法對病毒進行檢測”APASL（亞太肝臟研究協會年會）標準2高靈敏度丙肝RNA檢測數據來源：北京大學人民醫(yī)院※高靈敏HCVRNA檢測更準確，國產普通檢測較容易造成錯誤治療決策。RVR：快速病毒學應答cEVR：完全早期病毒學應答高靈敏度丙肝RNA檢測※高靈敏度HCV-RNA檢測：靈敏度高，不會造成停藥過早，導致復發(fā)率高高靈敏度丙肝RNA檢測基因分型乙肝基因分型（建議做）2012年《EASL臨床實踐指南：慢性乙肝病毒感染管理》指出：與HBV基因型為D和C比較，基因型為A和B的抗HBe血清學轉換率與HBsAg消失率更高;2010年中國《慢性乙型肝炎防治指南》更新版指出：HBV基因型和疾病進展和干擾素α治療效果有關。與C基因型感染者相比，B基因型感染者較早出現HBeAg血清學轉換，較少進展為慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌。乙肝基因分型

EASL（歐洲肝臟研究學會）指南1“HCVRNA基因分型結果有助于判定治療的難易程度及制定抗病毒治療的個體化方案。治療前應進行HCVRNA基因分型和血中HCVRNA定量，以決定抗病毒治療的療程和利巴韋林的劑量”中國（丙型肝炎防治指南）標準2“HCV患者持續(xù)病毒學應答（SVR）的最佳預測因子為IL-28B基因多態(tài)性、基因型及肝纖維化分期。”丙肝基因分型（必須做）：1.決定治療路線；2.決定用藥劑量。丙肝基因分型基因1型（包括4型）患者

病毒應答指導的抗病毒治療摘自2012年《EASL臨床實踐指南：丙肝病毒