多糖分離純化

關(guān)于多糖分離純化第一頁，共十九頁，2022年，8月28日柱層析技術(shù)(chromatography)

柱層析技術(shù)(chromatography)又稱柱色譜技術(shù)，主要原理是根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復分配將組分分離開來。第二頁，共十九頁，2022年，8月28日柱層析測定多糖分子分布量原理

多糖為單糖的天然聚合物,多糖的性質(zhì)和藥理作用與其分子量大小,分子量分布及其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。多糖的分子量不是均一的,具多分散性,需要用統(tǒng)計方法表征其平均分子量及其分子量分布。高效凝膠色譜法測定多糖的分子量及其分布,具有快速,重現(xiàn)性好等優(yōu)點,在國內(nèi)外得到了廣泛的應用第三頁，共十九頁，2022年，8月28日案例分析：多花黃精多糖云芝多糖蟲草多糖第四頁，共十九頁，2022年，8月28日高效凝膠色譜法測定多花黃精多糖分子量與分子量分布

多花黃精多糖為水溶性多糖,針對其單糖組成和空間結(jié)構(gòu)與葡聚糖相似,在色譜柱的選擇上傾向于更適合于水溶性多糖分離測定用的ShodexOHPakSB-803HQ系列(對葡聚糖的排阻極限為1×105)第五頁，共十九頁，2022年，8月28日操作流程1.色譜條件色譜柱為ShodexOHPakSB-803HQ,流動相為0.71%硫酸鈉溶液(內(nèi)含0.02%疊氮鈉),柱溫:35℃,示差折光檢測器(檢測器溫度35℃),流速0.5ml·min-1,取供試品溶液及對照品溶液各20μl注入液相色譜儀。2.標準曲線的制備及樣品測定取數(shù)個已知分子量的葡聚糖對照品，制成每1ml中各含10mg的溶液作為對照品溶液，分別進樣，由GPC專用軟件繪制標準曲線,根據(jù)GPC專用軟件繪制的標準曲線及供試品的保留時間采用GPC專用軟件計算樣品各組分的重均分子量及其分子量分布。供試品溶液配置：多花黃精多糖適量,加流動相制成每1ml中約含10mg的溶液,振搖,室溫放置過夜第六頁，共十九頁，2022年，8月28日操作流程3.精密度試驗取同一供試品連續(xù)測定5次，表明該系統(tǒng)測定樣品分子量的精密度良好。4.重復性試驗取同一批號樣品制作5份供試品分別測定，表明該分析方法測定樣品分子量精密度良好。3.精密度試驗取同一供試品連續(xù)測定5次，表明該系統(tǒng)測定樣品分子量的精密度良好。第七頁，共十九頁，2022年，8月28日操作流程5穩(wěn)定性實驗取同一供試品，在配置完成后不同時間段進樣（0h、2h、4h、8h、12h….），表明供試品在配置后一定時間內(nèi)穩(wěn)定。6.樣品測定取不同批號的多花黃精多糖樣品，制備供試品溶液，并進行分子量及分子量分布的測定。第八頁，共十九頁，2022年，8月28日高效凝膠色譜法測定云芝多糖的分子量及其分布云芝多糖能激活人體內(nèi)巨噬細胞，從而具有增強人體免疫功能的作用，臨床上用于治療慢性乙型肝炎、免疫功能低下等疾病。第九頁，共十九頁，2022年，8月28日1.云芝多糖的純化取云芝多糖原料約5g，加水25ml，微熱振搖使溶餌，用Sevage法去蛋白，即加入等量氯仿一正丁醇(4：1)充分振搖，離心，棄下層凝膠樣物，取上層溶液同法處理，直至下層溶液不再出現(xiàn)凝膠樣物質(zhì)。取上層溶液加入4倍體積的無水乙醇，振搖，離心，棄溶液，取沉淀物，加水10ml振搖使溶解，再加入4倍體積的無水乙醇，振搖，離心，同法處理兩次。取沉淀60~C減壓干燥4h，取干燥物研細，備用。操作流程第十頁，共十九頁，2022年，8月28日2.色譜條件色譜柱：TSK—GELG3000PWxl，TSK—GELGuradPWxl；流動相：0．05mol／LNa2SOd[(含0．05NaN。)，流速：0．6ml／min；檢測器衰減：1／4，檢測器溫度25¨C(由RM6超級恒溫水浴循環(huán)水控制)；數(shù)據(jù)采集時間：22min。操作流程第十一頁，共十九頁，2022年，8月28日3.測定方法取純化后的樣品以流動相制成10mg／ml溶液，取右旋糖苷分子量對照品以流動相制成5mg／ml溶液，分別用0．5gm微孔濾膜過濾，各取20l注入色譜儀。4.標準曲線取重均分子量分別為200000、133800、84400、41100、21400、10000、4600和2500Da的右旋糖苷分子量對照品溶液進樣測定，記錄峰值保留時間，標定色譜柱。以保留時間對分子量的對數(shù)作線性回歸，得回歸方程。操作流程第十二頁，共十九頁，2022年，8月28日蟲草多糖的柱層析分離純化蟲草多糖為白色粉末，無異味，易溶于水，蟲草多糖是蟲草體內(nèi)含量最豐富、最重要的生物活性物質(zhì)之一，具有諸多藥理作用。第十三頁，共十九頁，2022年，8月28日一、蟲草多糖的柱層析分離純化操作流程第十四頁，共十九頁，2022年，8月28日操作流程第十五頁，共十九頁，2022年，8月28日二、分部收集及多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法測定每管收集洗脫液的吸光值，繪制蟲草多糖各柱層析過程的蟲草多糖洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線合并每個波峰相應波寬長度的洗脫管數(shù)，定容后測定多糖含量。操作流程第十六頁，共十九頁，2022年，8月28日三.標準曲線繪制將葡聚糖標準品系列分別用流動相配成濃度為1.0mg/ml的標準樣品液，進樣量為20ul，采集色譜圖，繪制曲線相關(guān)度較好的葡聚糖GPC校正曲線方程。色譜條件：TSK-GELG-5000PWxlcolumn（7.8mm×300mm）與TSK-GELG-3000PWxlcolumn（7.8mm×300mm）串聯(lián)；流動相0.02mol/LKH2PO4溶液，Ph6.0；流速0.6ml/min，柱溫35℃，進樣量20μl操作流程第十七頁，共十九頁，2022年，8月28日四.分子量測定收集各多糖組分，經(jīng)濃縮，透析，真空干燥后，用流動相配成濃度為1.0mg/ml的樣液，高速離心（10000r/min，10min）后，取1.0ml上清液，過0.45um水相微孔濾膜，進樣量為20ul，采集色譜圖，根據(jù)上述所得葡聚糖G