核酸的提取與純化課件

第二章基因工程操作的基本技術(shù)第二節(jié)核酸的提取與純化第二章基因工程操作的基本技術(shù)第二節(jié)核酸的提取與純化1

核酸的發(fā)現(xiàn)核酸是1869年米歇爾(F.Miescher)在膿液的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，他當(dāng)時(shí)稱之為核素。阿爾特曼(R.Altmann)于1889年認(rèn)識(shí)其酸性后，定名為核酸。核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。核酸概述

2核酸的種類和分布核酸按戊糖分為兩大類：脫氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid核糖核酸（RNA）RibonucleicAcid*rRNA（ribosomalRNA）80%*tRNA（transferRNA）15%*mRNA（mesengerRNA）5%

種類核酸的種類和分布核酸按戊糖分為兩大類：種類3核酸分布

真核細(xì)胞原核細(xì)胞

DNA細(xì)胞核（95%）：線型雙鏈，一般與組蛋白結(jié)合成染色體線粒體、葉綠體（5%）：環(huán)狀雙鏈線型雙鏈主要集中于核區(qū)質(zhì)粒DNA：染色體外DNARNA細(xì)胞質(zhì)（75%）線粒體、葉綠體（15%）細(xì)胞核（10%）

主在細(xì)胞質(zhì)核酸分布真核細(xì)胞原核細(xì)胞4核酸的理化性質(zhì)RNA的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。核酸的理化性質(zhì)RNA的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色5DNA提取一般思路裂解細(xì)胞（破細(xì)胞壁和細(xì)胞膜）——內(nèi)容物釋放分離出核酸——去除蛋白質(zhì)和多糖及雜質(zhì)沉淀并吸附DNA,去除RNA溶解DNA,并保存DNA提取一般思路裂解細(xì)胞（破細(xì)胞壁和細(xì)胞膜）——內(nèi)容物釋放6DNA提取一般原則保持DNA結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。純度高——盡量排除其他大分子的污染（蛋白質(zhì)、多糖、及RNA等），保證樣品中不含有有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。得率好——選用合適的方法獲得足夠的樣品DNA提取一般原則保持DNA結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。7由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。第一節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等8

9大腸桿菌基因組DNA大腸桿菌基因組DNA10一、質(zhì)粒DNA的提取一、質(zhì)粒DNA的提取11plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.GenomicDNAplasmidDNAThegenomicDNAof12質(zhì)粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb）的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。常常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等質(zhì)粒的復(fù)制：嚴(yán)緊型復(fù)制（1~n個(gè)）松弛型復(fù)制（20個(gè)以上）質(zhì)粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb13堿變性法提取質(zhì)粒的原理堿變性法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異：在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)；將pH調(diào)至中性并有高濃度鹽存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。由于操作原因，提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。堿變性法提取質(zhì)粒的原理堿變性法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒14質(zhì)粒提取的思路質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質(zhì)：蛋白基因組DNA脂類及小分子雜質(zhì)RNA三個(gè)基本步驟：細(xì)菌的生長(zhǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增菌體的收集裂解及質(zhì)粒DNA的分離質(zhì)粒DNA的純化質(zhì)粒提取的思路質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA三15閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強(qiáng)堿中性閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理116染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。變性染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)17堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟

SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟SolutionI的配制：18溶液II破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）溶液II破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白19上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的無(wú)水乙醇。第五步：純化DNA上清液過(guò)柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA第七步：70%乙醇洗滌DNA第八步：干燥后，DNA懸浮于TE或去離子水中上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積201.LB培養(yǎng)基detail2.溶液Idetail3.溶液Ⅱdetail4.溶液IIIdetail5.TE(pH8.0)detail質(zhì)粒DNA－堿裂解法

所用試劑的生化作用

1.LB培養(yǎng)基detail質(zhì)粒DNA－堿裂解法21Solution（溶液）Ⅰ50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)、10mmol/LEDTA(pH8.0)高壓滅菌后，4℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)加入：4-5mg/ml溶菌酶及

RNaseA

Solution（溶液）Ⅱ(現(xiàn)用現(xiàn)配制)

0.2mol/LNaOH、1%SDS

Solution（溶液）Ⅲ（100ml）5mol/LKAc60ml、冰醋酸11.5ml、水28.5ml配制成的溶液Ⅲ含3mol/L鉀鹽、5mol/L醋酸（pH4.8）。質(zhì)粒DNA－堿裂解法(溶液配方)Solution（溶液）Ⅰ質(zhì)粒DNA－堿裂解法(溶液配方)22

LB培養(yǎng)基

back

配制1升培養(yǎng)基，應(yīng)在去離子水中加入：細(xì)菌培養(yǎng)基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g細(xì)菌培養(yǎng)基用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl10g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，5mol/LNaOH(約0.2ml)調(diào)節(jié)pH值至7.0,加入去離子水至總體積為1L，高壓下蒸汽滅菌121℃，20分鐘。LB培養(yǎng)基back配制1升培養(yǎng)基，應(yīng)在去離子水中加入：23溶液I

back50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在高壓下蒸汽滅菌20分鐘，保存于4℃。

溶菌酶:能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。葡萄糖:增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。EDTA:Mg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。RNaseA：降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。使用時(shí)加入：4-5mg/ml溶菌酶RNaseA溶液Iback50mmol/L葡萄糖溶菌酶:能水解菌24溶液II

back0.2mol/LNaOH(從5mol/L貯存液中現(xiàn)用稀釋)1%SDS作用：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。NaOH：強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS:溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)脂類和蛋白，并結(jié)合成“蛋白—SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。溶液IIback0.2mol/LNaOH(從5mo25溶液III

back5mol/L醋酸鈉（醋酸鉀） 冰醋酸 作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS＋線性DNA沉淀，K＋可中和DNANaAc-HAc緩沖液：冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。用來(lái)中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。溶液IIIback5mol/L醋酸鈉（醋酸鉀） N26TE(pH8.0)

back10mmol/LTris·Cl(pH8.0)

1mmol/LEDTA(pH8.0)作用：穩(wěn)定ＤＮＡ

TE緩沖液：DNA保存液，由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。TE(pH8.0)back10mmol/LTris·C27蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。酚-氯仿以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。異戊醇:異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過(guò)程中泡沫的產(chǎn)生。同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定?，F(xiàn)在普遍用:酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但28核酸相Protein變性相有機(jī)相核酸的提取與純化課件29

(1）使用注意酚通常是透明無(wú)色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。(2）安全操作酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。使用酚時(shí)應(yīng)注意(1）使用注意使用酚時(shí)應(yīng)注意30核酸的沉淀

沉淀是濃縮核酸最常用的方法。

優(yōu)點(diǎn)：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。31

有機(jī)沉淀劑（1）乙醇優(yōu)點(diǎn)：

對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：需要量大，一般要求低溫操作。（2）異丙醇優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。缺點(diǎn)：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。有機(jī)沉淀劑（1）乙醇（2）異丙醇32質(zhì)粒DNA提取的其它方法

質(zhì)粒DNA－煮沸法

原理：染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開。

氯化銫密度梯度離心法質(zhì)粒DNA提取的其它方法質(zhì)粒DNA－煮沸法氯化銫密度梯33第二節(jié)基因組或其他DNA的提?。ㄑa(bǔ)充）

一般過(guò)程及原理：

1.細(xì)菌基因組DNA的制備（1）細(xì)胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37oC溫育。不用NaOH!（2）DNA純化CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。第二節(jié)基因組或其他DNA的提?。ㄑa(bǔ)充）一般過(guò)程及原理：34

一般過(guò)程及原理：動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）組織粉碎2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提一般過(guò)程及原理：動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)350.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC溫育。（2）細(xì)胞裂解（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。（5）除去RNA污染用RNase。用2倍體積的無(wú)水乙醇。（4）沉淀DNA（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC溫育。（36植物各個(gè)部位都可用作總DNA抽提的材料，常用的材料一般為植物幼葉。先用機(jī)械的方法使組織和細(xì)胞破碎，然后加入SDS、CTAB等離子型表面活性劑，溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使細(xì)胞膜和核膜破裂。再加入酚和氯仿等表面活性劑，使蛋白變性。最后加入無(wú)水乙醇或異丙醇沉淀DNA；沉淀的DNA即為植物總DNA，溶于TE溶液或超純水中保存?zhèn)溆谩?.從植物組織中制備DNA植物各個(gè)部位都可用作總DNA抽提的材料，常用的材料一般為植物37基因組DNA-CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。

基因組DNA-CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）

C38CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

組份Tris-HCl39CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。

組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方組份Tris-HCl40CTAB法流程圖

植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解41一般過(guò)程及原理：（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。（2）細(xì)胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。65oC溫育。一般過(guò)程及原理：（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨42用0.6倍體積的異丙醇（-20oC）。（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）。用0.6倍體積的異丙醇（-20oC）。（3）純化DNA用苯43三、RNA提取的基本原理與方法

制備RNA的關(guān)鍵—防止內(nèi)外源RNase的作用

1)

RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍;抗高溫嚴(yán)寒(0~65℃均具活性）；抗變性劑

2)

解決辦法：

外源RNase—高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理幾乎所有溶液和器皿，操作者帶手套

內(nèi)源RNase—高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等

三、RNA提取的基本原理與方法制備RNA的關(guān)鍵—防止內(nèi)44三、RNA提取的基本原理與方法

總RNA的提取

根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法：

1）熱苯酚抽提法

2）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍

3）LiCl/尿素法其中以胍鹽法最好，對(duì)于從那些RNase含量很高的組織（胰臟）中提取RNA特別有效，可使RNase迅速變性，制備的RNA有較高翻譯活性。在RNA制備中，細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)行的。三、RNA提取的基本原理與方法總RNA的提取45二、RNA提取的基本原理與方法

RNA提取的通用方法

異硫氰酸胍/苯酚法原理：細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來(lái)的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。

二、RNA提取的基本原理與方法RNA提取的通用方法46二、RNA提取的基本原理與方法RNA提取的通用方法

異硫氰酸胍/苯酚法

步驟:材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70％乙醇。沉淀：異丙醇、無(wú)水乙醇。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。

二、RNA提取的基本原理與方法RNA提取的通用方法47三、DNA/RNA濃度、純度和相對(duì)分子

質(zhì)量的測(cè)定

1.紫外分光光度法

原理基于DNA(或RNA)分子在260nmm處有特異的紫外吸收峰且吸收強(qiáng)度與系統(tǒng)中DNA或RNA的濃度成正比。分子形狀、雙鏈與單鏈之間的轉(zhuǎn)換也會(huì)導(dǎo)致吸收水平的改變，但是這種偏差可以用特定的公式來(lái)校正。該法的特點(diǎn)是準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，但所需儀器較昂貴。衡量所提取DNA的純度可用OD260與OD280的比值,OD260/OD280對(duì)DNA而言其值大約為1.8。當(dāng)OD260/OD280大于1.8則可能有RNA污染。當(dāng)OD260/OD280小于1.8時(shí)則有蛋白質(zhì)污染。

在波長(zhǎng)260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。三、DNA/RNA濃度、純度和相對(duì)分子

質(zhì)量的測(cè)定48三、DNA/RNA濃度、純度和相對(duì)分子

質(zhì)量的測(cè)定1.紫外分光光度法

測(cè)DNA：純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260m／OD230應(yīng)大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9時(shí)，表明有RNA污染。2)小于1.6時(shí)，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0時(shí)，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。

三、DNA/RNA濃度、純度和相對(duì)分子

質(zhì)量的測(cè)定149三、DNA/RNA濃度、純度和相對(duì)分子

質(zhì)量的測(cè)定1.紫外分光光度法

測(cè)RNA純的RNA樣品其OD260／OD280應(yīng)介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0。1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說(shuō)明有蛋白質(zhì)或酚的污染；2）比值大于2.0時(shí)，可能被異硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0時(shí)表明有小分子及鹽存在。

三、DNA/RNA濃度、純度和相對(duì)分子

質(zhì)量的測(cè)定150三、DNA/RNA濃度、純度和相對(duì)分子

質(zhì)量的測(cè)定核酸的保存

對(duì)DNA

保存：①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②長(zhǎng)期保存樣品中可加入1滴氯仿。

對(duì)RNA

保存：①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;②長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。

三、DNA/RNA濃度、純度和相對(duì)分子

質(zhì)量的測(cè)定核51第二章基因工程操作的基本技術(shù)第二節(jié)核酸的提取與純化第二章基因工程操作的基本技術(shù)第二節(jié)核酸的提取與純化52

核酸的發(fā)現(xiàn)核酸是1869年米歇爾(F.Miescher)在膿液的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，他當(dāng)時(shí)稱之為核素。阿爾特曼(R.Altmann)于1889年認(rèn)識(shí)其酸性后，定名為核酸。核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。核酸概述

53核酸的種類和分布核酸按戊糖分為兩大類：脫氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid核糖核酸（RNA）RibonucleicAcid*rRNA（ribosomalRNA）80%*tRNA（transferRNA）15%*mRNA（mesengerRNA）5%

種類核酸的種類和分布核酸按戊糖分為兩大類：種類54核酸分布

真核細(xì)胞原核細(xì)胞

DNA細(xì)胞核（95%）：線型雙鏈，一般與組蛋白結(jié)合成染色體線粒體、葉綠體（5%）：環(huán)狀雙鏈線型雙鏈主要集中于核區(qū)質(zhì)粒DNA：染色體外DNARNA細(xì)胞質(zhì)（75%）線粒體、葉綠體（15%）細(xì)胞核（10%）

主在細(xì)胞質(zhì)核酸分布真核細(xì)胞原核細(xì)胞55核酸的理化性質(zhì)RNA的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。核酸的理化性質(zhì)RNA的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色56DNA提取一般思路裂解細(xì)胞（破細(xì)胞壁和細(xì)胞膜）——內(nèi)容物釋放分離出核酸——去除蛋白質(zhì)和多糖及雜質(zhì)沉淀并吸附DNA,去除RNA溶解DNA,并保存DNA提取一般思路裂解細(xì)胞（破細(xì)胞壁和細(xì)胞膜）——內(nèi)容物釋放57DNA提取一般原則保持DNA結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。純度高——盡量排除其他大分子的污染（蛋白質(zhì)、多糖、及RNA等），保證樣品中不含有有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。得率好——選用合適的方法獲得足夠的樣品DNA提取一般原則保持DNA結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。58由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。第一節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等59

60大腸桿菌基因組DNA大腸桿菌基因組DNA61一、質(zhì)粒DNA的提取一、質(zhì)粒DNA的提取62plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.GenomicDNAplasmidDNAThegenomicDNAof63質(zhì)粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb）的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。常常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等質(zhì)粒的復(fù)制：嚴(yán)緊型復(fù)制（1~n個(gè)）松弛型復(fù)制（20個(gè)以上）質(zhì)粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb64堿變性法提取質(zhì)粒的原理堿變性法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異：在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)；將pH調(diào)至中性并有高濃度鹽存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。由于操作原因，提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。堿變性法提取質(zhì)粒的原理堿變性法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒65質(zhì)粒提取的思路質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質(zhì)：蛋白基因組DNA脂類及小分子雜質(zhì)RNA三個(gè)基本步驟：細(xì)菌的生長(zhǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增菌體的收集裂解及質(zhì)粒DNA的分離質(zhì)粒DNA的純化質(zhì)粒提取的思路質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA三66閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNADNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強(qiáng)堿中性閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（1）原理167染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。變性染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)68堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟

SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟SolutionI的配制：69溶液II破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）溶液II破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白70上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的無(wú)水乙醇。第五步：純化DNA上清液過(guò)柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA第七步：70%乙醇洗滌DNA第八步：干燥后，DNA懸浮于TE或去離子水中上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積711.LB培養(yǎng)基detail2.溶液Idetail3.溶液Ⅱdetail4.溶液IIIdetail5.TE(pH8.0)detail質(zhì)粒DNA－堿裂解法

所用試劑的生化作用

1.LB培養(yǎng)基detail質(zhì)粒DNA－堿裂解法72Solution（溶液）Ⅰ50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)、10mmol/LEDTA(pH8.0)高壓滅菌后，4℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)加入：4-5mg/ml溶菌酶及

RNaseA

Solution（溶液）Ⅱ(現(xiàn)用現(xiàn)配制)

0.2mol/LNaOH、1%SDS

Solution（溶液）Ⅲ（100ml）5mol/LKAc60ml、冰醋酸11.5ml、水28.5ml配制成的溶液Ⅲ含3mol/L鉀鹽、5mol/L醋酸（pH4.8）。質(zhì)粒DNA－堿裂解法(溶液配方)Solution（溶液）Ⅰ質(zhì)粒DNA－堿裂解法(溶液配方)73

LB培養(yǎng)基

back

配制1升培養(yǎng)基，應(yīng)在去離子水中加入：細(xì)菌培養(yǎng)基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g細(xì)菌培養(yǎng)基用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl10g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，5mol/LNaOH(約0.2ml)調(diào)節(jié)pH值至7.0,加入去離子水至總體積為1L，高壓下蒸汽滅菌121℃，20分鐘。LB培養(yǎng)基back配制1升培養(yǎng)基，應(yīng)在去離子水中加入：74溶液I

back50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在高壓下蒸汽滅菌20分鐘，保存于4℃。

溶菌酶:能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。葡萄糖:增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。EDTA:Mg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。RNaseA：降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。使用時(shí)加入：4-5mg/ml溶菌酶RNaseA溶液Iback50mmol/L葡萄糖溶菌酶:能水解菌75溶液II

back0.2mol/LNaOH(從5mol/L貯存液中現(xiàn)用稀釋)1%SDS作用：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。NaOH：強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS:溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)脂類和蛋白，并結(jié)合成“蛋白—SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。溶液IIback0.2mol/LNaOH(從5mo76溶液III

back5mol/L醋酸鈉（醋酸鉀） 冰醋酸 作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS＋線性DNA沉淀，K＋可中和DNANaAc-HAc緩沖液：冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。用來(lái)中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。溶液IIIback5mol/L醋酸鈉（醋酸鉀） N77TE(pH8.0)

back10mmol/LTris·Cl(pH8.0)

1mmol/LEDTA(pH8.0)作用：穩(wěn)定ＤＮＡ

TE緩沖液：DNA保存液，由Tris-HCl和EDTA配制。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。TE(pH8.0)back10mmol/LTris·C78蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。酚-氯仿以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。異戊醇:異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過(guò)程中泡沫的產(chǎn)生。同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定?，F(xiàn)在普遍用:酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但79核酸相Protein變性相有機(jī)相核酸的提取與純化課件80

(1）使用注意酚通常是透明無(wú)色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。(2）安全操作酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。使用酚時(shí)應(yīng)注意(1）使用注意使用酚時(shí)應(yīng)注意81核酸的沉淀

沉淀是濃縮核酸最常用的方法。

優(yōu)點(diǎn)：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調(diào)整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。82

有機(jī)沉淀劑（1）乙醇優(yōu)點(diǎn)：

對(duì)鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：需要量大，一般要求低溫操作。（2）異丙醇優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。缺點(diǎn)：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數(shù)次。有機(jī)沉淀劑（1）乙醇（2）異丙醇83質(zhì)粒DNA提取的其它方法

質(zhì)粒DNA－煮沸法

原理：染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開。

氯化銫密度梯度離心法質(zhì)粒DNA提取的其它方法質(zhì)粒DNA－煮沸法氯化銫密度梯84第二節(jié)基因組或其他DNA的提取（補(bǔ)充）

一般過(guò)程及原理：

1.細(xì)菌基因組DNA的制備（1）細(xì)胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37oC溫育。不用NaOH!（2）DNA純化CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。第二節(jié)基因組或其他DNA的提?。ㄑa(bǔ)充）一般過(guò)程及原理：85

一般過(guò)程及原理：動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）組織粉碎2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提一般過(guò)程及原理：動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)860.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC溫育。（2）細(xì)胞裂解（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。（5）除去RNA污染用RNase。用2倍體積的無(wú)水乙醇。（4）沉淀DNA（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC溫育。（87植物各個(gè)部位都可用作總DNA抽提的材料，常用的材料一般為植物幼葉。先用機(jī)械的方法使組織和細(xì)胞破碎，然后加入SDS、CTAB等離子型表面活性劑，溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使細(xì)胞膜和核膜破裂。再加入酚和氯仿等表面活性劑，使蛋白變性。最后加入無(wú)水乙醇或異丙醇沉淀DNA；沉淀的DNA即為植物總DNA，溶于TE溶液或超純水中保存?zhèn)溆谩?.從植物組織中制備DNA植物各個(gè)部位都可用作總DNA抽提的材料，常用的材料一般為植物88基因組DNA-CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。

基因組DNA-CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）

C89CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

組份Tris-HCl90CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。

組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方組份Tris-HCl91CTAB法流程圖

植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解92一般過(guò)程及原理：（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。（2）細(xì)胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。65oC溫育。一般過(guò)程及原理：（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨93用0.6倍體積的異丙醇（-20oC）。（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）。用0.6倍體積的異丙醇（-20oC）。（3）純化DNA用苯94三、RNA提取的基本原理與方法

制備RNA的關(guān)鍵—防止內(nèi)外源RNase的作用

1)

RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍;抗高溫嚴(yán)寒(0~65℃均具活性）；抗變性劑

2)

解決辦法：

外源RNase—高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理幾乎所有溶液和器皿，操作者帶手套

內(nèi)源RNase—高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等

三、RNA提取的基本原理與方法制備RNA的關(guān)鍵—防止內(nèi)95三、RNA提取的基