病原體分子診斷技術(shù)進(jìn)展課件

病原體分子診斷技術(shù)進(jìn)展分子診斷概念和特點(diǎn)概念：利用標(biāo)本中的核酸作為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)感染性疾病、腫瘤、遺傳性疾病等進(jìn)行診斷和預(yù)后判斷的方法。特點(diǎn)

特異性高、靈敏度高穩(wěn)定性高診斷范圍廣、適應(yīng)性強(qiáng)臨床應(yīng)用前景好什么是核酸？鏈狀分子DNA(脫氧核糖核酸)

貯存遺傳信息RNA(核糖核酸)

傳遞遺傳信息遺傳信息的傳遞途徑DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄RNA和DNA的結(jié)構(gòu)dsDNAssDNAssRNA通常RNA在細(xì)胞中拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于DNA的拷貝數(shù)一個(gè)或幾個(gè)拷貝DNA可達(dá)10000個(gè)拷貝的核糖體RNA(rRNA)OneCellContains:如使用rRNA為靶標(biāo)，將極大地提高了

取樣效率和擴(kuò)增檢測(cè)靈敏度A、如果2ml樣本含有1個(gè)細(xì)菌

取0.2ml樣本，最終得到細(xì)菌的幾率是1/10。SampleCellLysisTargetRNAReleasedB、如果2ml樣本含有1個(gè)細(xì)菌先裂解，后取樣，

2ml樣本含有10000個(gè)rRNA。取0.2ML樣本，可得到1000個(gè)分子主要的核酸擴(kuò)增技術(shù)DNA擴(kuò)增技術(shù)A、PCR：使用Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，溫度循環(huán)；RT-PCR將RNA變成DNA，再進(jìn)行DNA擴(kuò)增B、實(shí)時(shí)熒光PCR：擴(kuò)增與PCR相同，采用實(shí)時(shí)閉管熒光檢測(cè)（分子信標(biāo)，Taqman探針等）RNA擴(kuò)增技術(shù)A、TMA：恒溫?cái)U(kuò)增，使用RT酶和T7酶；終點(diǎn)雜交保護(hù)檢測(cè)B、SAT：擴(kuò)增與TMA相同，采用實(shí)時(shí)閉管熒光檢測(cè)（分子信標(biāo)）PCR原理TMA原理SAT與PCR技術(shù)原理比較

RTRNAcDNART~1000copiesT7SATDNATaqTaqPCR30分鐘內(nèi)擴(kuò)增1010倍DNA擴(kuò)增技術(shù)（PCR）用于病原體

檢驗(yàn)的不足

不能區(qū)分“活菌”“死菌”與臨床相關(guān)性差不能區(qū)分“潛伏感染”“活動(dòng)性感染”臨床意義小，如CMV交叉污染變溫檢測(cè)，對(duì)儀器要求高反應(yīng)易受抑制RNA擴(kuò)增技術(shù)用于病原體

檢驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)可以區(qū)分“死菌”“活菌”：病原體死亡，RNA很快降解與臨床相關(guān)性好（＝培養(yǎng)），減少無效治療，比如抗生素濫用可以診斷“活動(dòng)性感染”

活動(dòng)性感染：指示RNA轉(zhuǎn)錄活躍潛伏感染：指示RNA不轉(zhuǎn)錄不易污染：靶標(biāo)和擴(kuò)增產(chǎn)物都是RNA靈敏度高：RNA拷貝數(shù)≥DNA拷貝數(shù)RNA診斷產(chǎn)品的商品化程度及應(yīng)用FDA或CE認(rèn)證產(chǎn)品（TMA）SFDA認(rèn)證產(chǎn)品（SAT）沙眼衣原體（CT）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）淋病奈瑟菌（NG）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）解脲脲原體（UU）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）結(jié)核分子桿菌（TB）核酸檢測(cè)試劑盒（RNA恒溫?cái)U(kuò)增）......為什么我們必須熟悉和了解RNA擴(kuò)增技術(shù)？（一）為什么我們必須熟悉和了解RNA擴(kuò)增技術(shù)？（二）血液篩查市場(chǎng)美國中國RNA診斷RNA診斷傳統(tǒng)技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)其他傳染病市場(chǎng)（優(yōu)生優(yōu)育：CT/NG為例）RNA診斷傳統(tǒng)技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)美國中國100%進(jìn)口！有部分國產(chǎn)什么樣的病原體需要分子診斷？傳統(tǒng)方法不能及時(shí)檢測(cè)或鑒定的病原體。

難培養(yǎng)的如CT、MG、手足口病毒培養(yǎng)較慢的如TB鏡檢容易弄錯(cuò)的如NG、T.vaginalis免疫交叉反應(yīng)較多的如CT需要分型的如HPV、HSV胞內(nèi)病原體如衣原體、支原體、病毒與PCR、TMA等相比，SAT改進(jìn)了捕獲方法（一）靶標(biāo)核酸捕獲核酸磁珠OligodTOligodA優(yōu)點(diǎn)：幾乎去除了所有抑制劑允許使用大體積樣本可同時(shí)處理多種樣本SAT應(yīng)用例一（CT/NG尿液檢測(cè)，國內(nèi)唯一）CT/NG尿液檢測(cè)CT女性感染人群中70%以上無臨床癥狀男性感染人群中50%無臨床癥狀NG女性感染人群中60%無臨床癥狀男性感染人群中20%無臨床癥狀CT的反復(fù)感染不僅導(dǎo)致不育，而且增加感染淋球菌、HIV、HBV等風(fēng)險(xiǎn)（6～8倍）【1】【1】李躍進(jìn),譚湘芳.熒光定量PCR檢測(cè)性病的結(jié)果分析[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2007,14(16):2151.RNA（TMA）檢測(cè)尿液中的CT（美國）尿液樣本的靈敏度、特異性與拭子相當(dāng)SystematicReview:NoninvasiveTestingforChlamydiatrachomatisandNeisseriagonorrhoeae.AnnInternMed.2005;142:914-925.SAT應(yīng)用例二（結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)）操作流程痰液預(yù)處理超聲波處理15min預(yù)熱15min恒溫?cái)U(kuò)增40min耗時(shí)2小時(shí)1、以臨床診斷的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)253例結(jié)核患者痰標(biāo)本；134例其他呼吸道感染患者標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行涂片、TB-SAT、BactecMGIT960檢測(cè)。參數(shù)方法臨床診斷靈敏度(%)特異度(%)陽性預(yù)測(cè)值(%)陰性預(yù)測(cè)值(%)陽性陰性TB-SAT總樣本陽性171067.610010062.0陰性82134涂片陽性陽性120097.610010040.0陰性32涂片陰性陽性51039.210010062.6陰性79132MGIT960+菌種鑒定總樣本陽性156061.710010058.0陰性97134涂片陽性陽性118095.910010028.6陰性52