實驗六產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

關于實驗六產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測第一頁，共十二頁，2022年，8月28日實驗目的1.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理2.學會瓊脂糖凝膠的制作和進行電泳的方法第二頁，共十二頁，2022年，8月28日實驗原理1.DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理

瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，天然聚合長鏈狀分子，在沸水中溶解，45℃開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小取決于瓊脂糖的濃度，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。第三頁，共十二頁，2022年，8月28日實驗原理（1）電荷效應

DNA分子在PH值高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電泳時向陽極移動。第四頁，共十二頁，2022年，8月28日（2）分子篩效益在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度主要取決于分子篩效益，即DNA分子本身的大小和構象（共價閉環(huán)DNA>線狀DNA>開環(huán)DNA），而且其遷移速度與其相對分子質量的對數(shù)值成反比，所以不用相對分子質量的DNA分子可以在瓊脂糖凝膠電泳中分離。第五頁，共十二頁，2022年，8月28日2.DNA分子進行染色的原理（以溴化乙錠為例）

觀察瓊脂糖凝膠中DNA最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖凝膠中的DNA分子。溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負極向正極泳動時，溴化乙錠從正極向負極移動，這樣溴化乙錠分子就會嵌入到DNA分子中的堿基對之間形成絡合物，這種絡合物在紫外光下發(fā)射的熒光要比單純的DNA分子要強的多，便于DNA的檢測。第六頁，共十二頁，2022年，8月28日實驗儀器、材料、試劑實驗儀器及用具電泳儀、移液槍、電磁爐、錐形瓶、容量瓶、紫外分析儀實驗材料及試劑實驗材料：雞血DNAPCR擴增產物

DNAMarker、GoldView核酸染色劑、瓊脂糖、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉、6×DNALodingBuffer

實驗試劑：0.5×TBE（PH8.0）緩沖液、1.0%瓊脂糖溶液、

第七頁，共十二頁，2022年，8月28日實驗步驟瓊脂糖凝膠的配制1g瓊脂糖100mlTBE緩沖液5μlGoldView冷卻到60℃第八頁，共十二頁，2022年，8月28日1.將適量的DNAMarker用移液槍加入凝膠的第一個孔中。2.在PCR產物中加入6×DNALodingBuffer（每5ul產物加入1ul），混勻后，用移液槍加入到樣品孔內，每孔加2ul。點樣第九頁，共十二頁，2022年，8月28日

肉眼可見指示劑泳至距制膠板前端約2-3cm處即可停止電泳。切斷電源，取出凝膠，置于紫外線透射儀上觀察電泳結果，或用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存。電泳、觀察第十頁，共十二頁，2022年，8月28日注意事項1.瓊脂糖融化時，檔位不宜太高。2.制膠和加樣過程中要防治氣泡的產生。3.操作過程必須戴手套操作，嚴格注意防護。4.加樣時，Tip頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或DNA帶型不整齊。5.電源接通時，應核實凝膠的方向是否正確。6.電泳儀有電壓顯示，并不一定標志電泳槽已接通，應觀察電極氣泡出現(xiàn)情況。負極的氣泡比正極多一倍，表示電泳已開始。將