大腸菌群檢驗(yàn)課件

一、大腸菌群的食品衛(wèi)生學(xué)意義1、作為糞便污染食品的指標(biāo)菌

有來(lái)源特異性，即僅來(lái)自腸道。在腸道中的數(shù)量較多，易于檢出。在外環(huán)境中有足夠的抵抗力，能生存一定期間。食品細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方法敏感、特異。2、作為腸道致病菌污染食品的指標(biāo)菌。二、大腸菌群的定義及檢測(cè)方法1、大腸菌群的傳統(tǒng)定義大腸菌群（Coliformgroup）系指一群需氧及兼性厭氧，在37℃24小時(shí)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。包括腸桿菌科的艾希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯菌屬。其中以艾希氏菌屬為主，稱為典型大腸桿菌，其它三屬習(xí)慣上稱為典型大腸桿菌。2、大腸菌群檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法（1）最近擬數(shù)法（MPN）（GB4789.2-1994）

樣品

0.1g×30.01g×30.001g×3

乳糖膽鹽發(fā)酵管37℃24hr

產(chǎn)酸產(chǎn)氣管伊紅美藍(lán)平板（分離）

37℃24hr可疑菌落乳糖發(fā)酵管（證實(shí)）

37℃24hr根據(jù)經(jīng)證實(shí)的乳糖膽鹽發(fā)酵管陽(yáng)性管數(shù)，查MPN表。

3、ISO關(guān)于大腸菌群的定義（ISO9308-1：2000）（ISO：INTERNATIONALSTARDIZATIONORGANIZATION國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織）大腸菌群是革蘭氏陰性、無(wú)芽孢、氧化酶陰性的桿狀細(xì)菌，可需氧或兼性厭氧地生長(zhǎng)在含膽鹽（或其他具有同樣抑制生長(zhǎng)性能的表面活性劑）的培養(yǎng)基上，當(dāng)在36±2℃培養(yǎng)時(shí)，通常能于48hr內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和醛。它們還具有?-半乳糖苷酶。4、依據(jù)?-半乳糖苷酶快速測(cè)定大腸菌群的原理

大腸菌群產(chǎn)生的?-半乳糖苷酶可分解培養(yǎng)基中的酶底物（即色基與?-半乳糖的結(jié)合物），使帶色基團(tuán)游離而顯色或發(fā)熒光。該反應(yīng)靈敏快速。測(cè)定?-半乳糖酶常用的底物有4-甲基傘形酮-?-D半乳糖苷（MUGal）、5-溴-4氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷（X-gal）、3，4-環(huán)已酮-?-D-半乳糖苷和8-羥基喹啉-?-D-半乳糖苷等。1993年Brenner等人用加4-甲基傘形酮-?-D-半乳糖苷（MUGal）和吲哚氧基-?-D-葡糖醛酸苷的培養(yǎng)基檢測(cè)大腸菌群和大腸桿菌[3]，取得滿意結(jié)果。1995年該方法被美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)署采納（CodeofFederalRegulation40,141.21ProtectionOfEnvironment）。美國(guó)SIGMA公司有商品化試劑，但價(jià)格昂貴。

2000年James等獨(dú)家報(bào)導(dǎo)了一種新的檢測(cè)大腸菌群的酶底物——茜素-β-D-半乳糖苷（Aliz-gal）。該試劑具有比同類酶底物更靈敏的性能，在固體培養(yǎng)基中可使大腸菌群呈現(xiàn)帶色菌落，色素為脂溶性不擴(kuò)散，易與辨別，另還可以和不同的陽(yáng)離子（Fe、Al、K、NH4）形成帶色的螯合物，這樣就便于和其他的顯色劑合用，組成具有多種性能的鑒別培養(yǎng)基，以提高檢測(cè)的靈敏度。目前，國(guó)內(nèi)外均無(wú)商品化試劑出售。三、應(yīng)用4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷快速檢驗(yàn)食品中的大腸菌群1、檢測(cè)步驟

樣品

0.1g×30.01g×30.001g×3

MUGal肉湯37℃24hr

在紫外光下觀察產(chǎn)熒光管數(shù)，查MPN表得MPN值

大腸菌群β-D-半乳糖苷酶

4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷4-甲基傘形酮（蘭色熒光）MUGal肉湯：胰蛋白胨20g氯化鈉5g無(wú)水磷酸氫二鉀2.75g無(wú)水磷酸二氫鉀2.75g

月桂基硫酸鈉0.1g

MUGal0.08g水1000ml加熱使溶化，調(diào)Ph7.4，分裝試管，每管10ml，116℃高壓滅菌10min。待培養(yǎng)基冷卻后，以無(wú)菌手續(xù)在每管培養(yǎng)液內(nèi)加入0.1mL經(jīng)過(guò)濾除菌的500ug/mL頭孢磺啶稀釋液。

將MUGal肉湯陽(yáng)性管中的可疑菌株進(jìn)行觸酶、氧化酶和硝酸鹽還原試驗(yàn)，并任選其中18株用API20E鑒定。證明95.1%的MUGal肉湯陽(yáng)性管中含有大腸菌群。綜上所述，自制MUGal肉湯檢測(cè)大腸菌群靈敏、快速、準(zhǔn)確，無(wú)需驗(yàn)證，可一次完成。自制MUGal性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)游離熒光，可替代昂貴的進(jìn)口產(chǎn)品使用。鑒于以MUGal檢測(cè)大腸菌群的方法早在1995年即為美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)署采納，有關(guān)大腸菌群具有?-半乳糖苷酶的特性，也在ISO9308-1:2000給予了明確的定義。因此，經(jīng)過(guò)本次試驗(yàn)我們認(rèn)為，以MUGal肉湯快速檢測(cè)食品中大腸菌群作為一種推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法加以應(yīng)用是可行的。茜素-β-D-半乳糖苷瓊脂（Alig-g