微生物實(shí)驗(yàn)(2)課件

實(shí)驗(yàn)二、細(xì)菌培養(yǎng)及生化反應(yīng)掌握細(xì)菌的分離方法及無(wú)菌操作技術(shù)。熟悉細(xì)菌生長(zhǎng)狀況及代謝產(chǎn)物檢查。熟悉細(xì)菌培養(yǎng)方法

目的要求無(wú)菌技術(shù)防止細(xì)菌進(jìn)入人體或其他物品的操作技術(shù)稱無(wú)菌操作細(xì)菌檢驗(yàn)的操作需在無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)使用前后需進(jìn)行消毒。細(xì)菌檢驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌培養(yǎng)基的概念培養(yǎng)基是人工配制的微生物生活環(huán)境，其主要用途是繁殖及分離接種微生物，傳代或保存微生物，鑒別微生物的類(lèi)屬，研究微生物的生理及生化特性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制劑等。其營(yíng)養(yǎng)成分包括微生物生長(zhǎng)所需要的水分、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及某些生長(zhǎng)因子（維生素、輔酶）等。培養(yǎng)基的分類(lèi)雙糖鐵培養(yǎng)基SS培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基

庖肉培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基按用途分類(lèi)按物理性狀分類(lèi)液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基主要用于增菌用于檢測(cè)動(dòng)力及保存菌種用于分離鑒定細(xì)菌培養(yǎng)基的配制（示教）調(diào)配過(guò)濾矯正pH（7.0-7.6） 分裝滅菌（121.3℃，15-20分鐘）鑒定是否有菌放入冰箱冷藏備用因高壓之后pH值會(huì)下降0.1左右，所以矯正pH時(shí)應(yīng)比所需的pH高鑒定是否有菌可將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，然后觀察常用培養(yǎng)基及用途固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基加入1-2%的瓊脂即可，用于分離鑒定細(xì)菌。半固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入0.5%瓊脂即可，用于檢測(cè)動(dòng)力及保存菌種。液體培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯，主要用于增菌血液營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基：在50℃固體培養(yǎng)基加入10%的綿羊血液即為血平板（營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基）用于營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌。巧克力平板：在80℃固體培養(yǎng)基中加入10%的綿羊血液即為巧克力平板，用于奈瑟菌的培養(yǎng)。分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)

液體培養(yǎng)基接種法（示教）細(xì)菌培養(yǎng)方法一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：培養(yǎng)溫度：37℃（采用恒溫培養(yǎng)箱）培養(yǎng)時(shí)間：18～24h二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象混濁生長(zhǎng)（大多數(shù)細(xì)菌）；沉淀生長(zhǎng)（鏈球菌）；膜樣生長(zhǎng)（專(zhuān)性需氧菌，如結(jié)核分枝桿菌、枯草桿菌）。細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)主要看是否有鞭毛，即觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)。有鞭毛細(xì)菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴(kuò)散生長(zhǎng)，穿刺線邊緣模糊。無(wú)鞭毛細(xì)菌：只沿穿刺線生長(zhǎng)，穿刺線邊緣清晰。細(xì)菌在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象菌落：一個(gè)細(xì)菌不斷分裂而成的細(xì)菌群體稱之。在普通瓊脂平板上觀察菌落的形態(tài)、大小、表面、邊緣、濕度、透明度；在血平板上還要觀察溶血情況和色素等。分為光滑型(S)，粗糙型(R)和黏液型(M)。菌苔：指多個(gè)菌落融合在一起形成的細(xì)菌堆積物。菌落各種細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物或多或少地各有區(qū)別，可供鑒別細(xì)菌之用。用生化試驗(yàn)的方法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的種屬，稱之為細(xì)菌的生化反應(yīng)。細(xì)菌的生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)儀器37℃恒溫培養(yǎng)箱。微生物材料大腸桿菌、變形桿菌二者的普通平板。培養(yǎng)基糖的分解與生化反應(yīng)：糖發(fā)酵培養(yǎng)基，甲基紅培養(yǎng)基。蛋白質(zhì)分解與生化反應(yīng)：蛋白胨水（吲哚試驗(yàn)），雙糖鐵培養(yǎng)基（硫化氫試驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)步驟編號(hào)在微量五糖發(fā)酵管上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱，所接種的菌名和組號(hào)，下同。接種分別取葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇培養(yǎng)基各2支，按編號(hào)1號(hào)支接種大腸桿菌，2號(hào)接種變形桿菌。將已接種好的培養(yǎng)基置37℃溫箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果：被檢細(xì)菌若能發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖時(shí)，則使培養(yǎng)基的pH降低，這時(shí)培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)(為黃色)，若發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則培養(yǎng)基不僅顯酸色反應(yīng)，并且在培養(yǎng)基中有氣體。若被檢細(xì)菌不分解培養(yǎng)基中的糖，則培養(yǎng)基不發(fā)生變化。二甲基紅(Methylred)試驗(yàn)很多細(xì)菌，如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降低到4.5以下，這時(shí)若加甲基紅指示劑呈現(xiàn)紅色。因甲基紅指示劑變色范圍是pH4.4(紅色)~pH6.2(黃色)。若某些細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，但很快將丙酮酸脫羧，轉(zhuǎn)化成醇等物，則培養(yǎng)基的pH仍在6.2以上，故此時(shí)加入甲基紅指示劑，呈現(xiàn)黃色。將大腸桿菌和變形桿菌分別接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，加甲基紅指示劑數(shù)滴，觀察結(jié)果，呈現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。三靛基質(zhì)(吲哚)實(shí)驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌，如大腸桿菌，能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)(吲哚)，靛基質(zhì)與對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰色靛基質(zhì)(紅色化合物)。將被檢菌接種到胰蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h～48h后，沿試管壁滴加2滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，出現(xiàn)黃色者為陰性。IndoleTest四硫化氫試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽，形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵。為硫化氫試驗(yàn)陽(yáng)性，可借以鑒