肝功能實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)課件

肝功能實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一、中英文摘要

目的:應(yīng)用生物化學(xué)檢驗(yàn)方法對(duì)肝功能進(jìn)行檢查。方法:

1.改良賴氏法測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移氨酶(ALT)活性2.次氯酸鹽直接顯色法測(cè)定血氨3.酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)(液體雙試劑法)測(cè)定總膽汁酸(TotalBileAcid,TBA)Abstract:

…Objective:

Applicationofbiochemicaltestsofliverfunctionbechecked.

….Activity:

1.Laiimprovedmethodformeasuringserumalanineaminotransferaseammonialyase(ALT)

2.Directcolorhypochloriteammoniadetermination

3.Continuousenzymereactioncycle(liquidtwo-reagentmethod)determinationoftotalbileacid(TotalBileAcid,TBA)（1）丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移氨酶(ALT)

ALT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，其細(xì)胞內(nèi)濃度高于血清中1000-3000倍。只要有1%的肝細(xì)胞壞死，就可以使血清酶增高一倍,肝臟發(fā)炎時(shí)，ALT就會(huì)從肝細(xì)胞釋放到血液中，因此，ALT被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)故測(cè)定ALT的活性，能很好反映肝功能的情況（2）血清氨血氨的主要來(lái)源是氨基酸的分解代謝。肝臟是體內(nèi)利用氨合成尿素的惟一器官,在肝硬化、重癥肝炎、原發(fā)性肝癌、肝性腦病,肝臟清除氨的能力下降,血氨會(huì)升高,過(guò)度增高可引起肝性腦病,對(duì)嚴(yán)重的肝病和肝性腦病有很好的協(xié)助診斷作用，故它的測(cè)定具有重要的臨床意義。（3）總膽汁酸(TotalBileAcid,TBA)人急性肝炎急性期患者的TBA測(cè)定的異常率達(dá)100%,平均增高幅度可達(dá)正常高限的10倍，。慢性活動(dòng)性肝炎的TBA增高幅度較大。而慢性遷延性肝炎的TBA大多在正常范圍。肝硬化患者的TBA平均水平是正常高限的5倍，其異常率高于所有其它肝功能試驗(yàn)。血清TBA測(cè)定對(duì)肝外膽管阻塞和肝內(nèi)膽汁淤積的診斷有較高的靈敏度，包括膽道阻塞、膽汁性肝硬化、新生兒膽汁淤積、妊娠性膽汁淤積，血清中TBA均可顯著增高2.肝功能檢查測(cè)定方法的選擇指標(biāo)1:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移氨酶(ALT)活性方法:血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移氨酶(ALT)活性的測(cè)定（改良賴氏法）試劑：1.0.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液2.標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/ml）3.ALT底物液（含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml）4.2.4二硝基苯肼溶液5.0.4mol/LNaOH溶液(樣本)血清生成的丙酮酸可與起終止和顯色作用的2,4二硝基苯肼發(fā)生加成反應(yīng)，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，進(jìn)而在堿性環(huán)境中生成紅棕色的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與丙酮酸的生成量，亦即與ALT活性的高低成正比關(guān)系

實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.賴氏法測(cè)定ALT的標(biāo)準(zhǔn)曲線(即計(jì)量反應(yīng)曲線)在坐標(biāo)紙上以上表中An－A0之值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的酶活性的卡門氏單位為橫坐標(biāo)作圖，即得賴氏法測(cè)定ALT的標(biāo)準(zhǔn)曲線2.標(biāo)本中ALT活性結(jié)果⑴查標(biāo)準(zhǔn)曲線利用測(cè)定所得的吸光度結(jié)果(AU－AB)，便可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得標(biāo)本的ALT結(jié)果⑵計(jì)算將實(shí)驗(yàn)測(cè)得的AU－AB、AS代入下面計(jì)算公式，即可算得標(biāo)本中ALT活性

參考值.5～25卡門氏單位卡門氏單位的定義是：在溫度25℃，pH7.4，波長(zhǎng)340nm，光徑1cm的條件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的轉(zhuǎn)氨酶活性?？梢娍ㄩT氏單位不是用物質(zhì)的量濃度，而是用物質(zhì)的吸光度表示酶的活性單位的。若將卡門氏單位的定義條件代入國(guó)際單位計(jì)算公式，即得卡門氏單位與國(guó)際單位的換算關(guān)系：1卡門氏單位=0.4821IU/L(25℃)，便可將卡門氏單位兌換成國(guó)際單位評(píng)價(jià)：改原賴氏法的反應(yīng)溫度(40℃改為37℃)和底物濃度(改為低濃度)的改良賴氏法，對(duì)卡門氏單位的科學(xué)套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其結(jié)果與速率法較為一致，能較好反映酶的真實(shí)活性，所用試劑價(jià)廉，易得，可見光比色，不需要特殊儀器，適合學(xué)生實(shí)驗(yàn)室操作的練習(xí)。醫(yī)院常規(guī)方法：紫外連續(xù)監(jiān)測(cè)法（該法特異精密度更高，但測(cè)定成本較高，一般需要昂貴的自動(dòng)生化儀）指標(biāo)2：

血清的氨

方法:次氯酸鹽直接顯色法測(cè)定血氨儀器：723型分光光度計(jì)電熱恒溫水浴箱PHs一3C型精密酸度計(jì)實(shí)驗(yàn)原理:血液離體后，立即加入定量過(guò)量的鎢酸鈉及硫酸溶液，使蛋白沉淀的同時(shí)，血液中的氨與硫酸形成硫酸銨而存留于血濾液中，再以酚-次氯酸鈉顯色后于波長(zhǎng)630nm處測(cè)定A值（以空白校正）。實(shí)驗(yàn)操作:1.在3支試管(分別寫明測(cè)定、空白、標(biāo)準(zhǔn))中加入O．3mol／L鎢酸鈉溶液和0．5mol／L硫酸溶液各lmL。在測(cè)定管中加入臨時(shí)抽出的血液0．5mL后立即加蓋混勻，2500r／min離心5min，上清液留做測(cè)氨用。在空白管中加入0．5mL蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)管中加入0．5mL硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液，混勻，分別得到空白混合液和標(biāo)準(zhǔn)混合液2.另取3支試管，標(biāo)明測(cè)定、空白、標(biāo)準(zhǔn)。于測(cè)定管中加入上清液0．5mL，顯色劑I和顯色劑ⅡA各lmL，邊加邊混勻于空白管中加入空白混合液O．5mL，標(biāo)準(zhǔn)管中加入標(biāo)準(zhǔn)混合液0．5mL，然后在兩管中加入顯色劑I和顯色劑ⅡB各lmL，邊加邊混勻。評(píng)價(jià)：1.本法采用兩種堿濃度不同的次氯酸鹽溶液分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)和血液樣品，保持了顯色溶液酸度一致性因而提高了血卻氨測(cè)定的準(zhǔn)確度，回收率達(dá)98.5%~101.3%2.醫(yī)院常規(guī)方法：血氨常規(guī)測(cè)定方法大體分為兩類，即液體試劑（谷氨酸脫氫酶法）和干化學(xué)法。以干化學(xué)法為主，但儀器昂貴，小的儀器干式儀器2～10萬(wàn)，大的數(shù)十萬(wàn)指標(biāo)3:血清總膽汁酸方法:酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)(液體雙試劑法)所用試劑:

總膽汁酸酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測(cè)試劑盒注:(開封后直接使用,有效期限:開封后存放于4℃，1個(gè)月)R1：緩沖液PH7.0,65mmol/L。Thio-NAD1g/L

R2：緩沖液PH7.0,65mmol/L。Thio-NADH6g/L。疊氮鈉0.6mmol/L。3α-羥基類固醇脫氫酶（3α-HSD）≥5000U/L

操作步驟：

1.S+R1在37℃保溫5分鐘，加入試劑2(R2)2.S+R1+R2在37℃保溫60秒，記錄吸光度值A(chǔ)1后，180秒后記錄吸光度值A(chǔ)2。

注：標(biāo)本量(S)：4ul試劑1(R1)：270ul試劑2(R2)：ul90主波長(zhǎng)：405nm副波長(zhǎng)：660nm正常值范圍：0-15umol/L線性范圍：200umol/L計(jì)算:

ΔA標(biāo)本總膽汁酸濃度=--------------×校準(zhǔn)液濃度