SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)免疫印跡

SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)免疫印跡■蛋白免疫印跡雜交(WesternBlot)是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜(blot)上，然后通過一抗/二抗復合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。WB是進行蛋白質(zhì)分析最流行和成熟的技術(shù)之一。原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在加速劑N,N,N\N，一四甲基乙二胺（簡稱TEMED）和催化劑過硫酸鐵（簡稱AP）作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠,以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。ProteinsonblotseparatedbysizeEpitopeTaggedProteinorColorSpecificProteinBand\ProteinsonblotseparatedbysizeEpitopeTaggedProteinorColorSpecificProteinBand\rEpitopeAntibodylinkedtoenzymeProteinBloton

NilroctflluloseSDSPolyacrylamide

GelElectrophoresis:I^belwithSpecific30%丙烯酰胺的配制1、稱量Acrylamide290g,Bis10g,置于1L燒杯中2、向燒杯中加入約600ml的去離子水，充分攪拌溶解。3、加去離子水將溶液定容至1L,用0.45mm濾膜濾去雜質(zhì)。4.于棕色瓶中4℃保存。??吸等可意膚箸注皮口為丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性，并可通過??吸等可意膚箸注皮口為■凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。表3.4分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍適用的凝膠濃度/(%)蛋白質(zhì)20-3015-2020-3015-2010-155-102-510-40KD10-100KD100KD>500KD分離胺的聚合（12%）51nl體系蒸懦水1.634mlTOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"30%丙烯酰胺2.0ml1.5MpH8.8Tris-SDS3.7ml10%AP25ulTEMED5ul上層加異丙醇壓股，室溫一小時積層膠的聚合(5%)2.5ml體系蒸瑞水1.75ml30%丙烯酰胺0.413ml1MpH6.8Tris-SDS0.338ml10%APTEMED10%APTEMED2.5ul室溫一小時

下電極上極槽下電極緩沖液pH=8.3Tris-甘樣品膠］H=6.7Tns-HC1濃縮膠J分離膠PH=8.9Tris-HC1緩沖液pH=8.3Tris-甘過程圖http7/48/newkj/my/moban2/index.htmWebernBlot聚丙烯酹月方疑股電法■轉(zhuǎn)膜■孵育1小時或過夜.孵育抗

孵育1小時或過夜1d'W

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CUM3x5分豐中1X10分鐘

.M底粉（如為顯色法，則苴接孵育至顯色艮阿）1分鐘膠片暴光顯觀1-30分車中（―）方法1、制膠：制備凝膠板，將混合后的分離膠溶液，用1ml槍加至距梳齒卜緣約1cm。用1mL槍在凝膠表而沿短玻璃板邊緣輕輕加一層異丙醇（約高3-4mm）,用于隔絕空氣，使膠面平整。約30-60min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有?折射率不同的界線。將異丙醇倒去川重蒸水洗凈膠而，將混合均勻后的濃縮膠溶液加入分離膠上方，輕輕插入梳子.待上層膠聚合，拔出梳子，放入電泳槽，加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.3cm,即可加樣。2、樣品處理：樣品經(jīng)反復凍融裂解，離心，測濃度后，向樣品中加入適量的上樣緩沖液6*SDS,金屬浴105°C10min,加樣量一般每個樣品池10~4053、電泳將電泳儀與電源接通，打開電泳儀穩(wěn)流，開始時電流約20mA,待樣拈進入分離膠后，將電流調(diào)至25-30mA,當澳酚藍染料距底框0.5cm時，停止電泳，關(guān)閉電源4、染色與脫色、電泳結(jié)束后，取下凝膠板，用膠鏟撬開短玻璃板，叢凝膠板上切下?角作為加樣標記。加入染色液染色h,再加自來水（加幾滴3MKCI）煮沸三次（10min/次）脫色,則可見蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。5、轉(zhuǎn)移電泳：凝膠電泳結(jié)束前30min,將PDVF膜浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。從模具中取出凝膠放在PDVF膜上，驅(qū)除氣泡，然后置于濾紙上放入轉(zhuǎn)移模具中，將模具放入轉(zhuǎn)移電泳槽,PDVF膜一面朝正極，恒壓100伏70min,4℃電泳過夜，次日取出PDVF膜做好標記。七、抗體雜交抗體表面全要采用間接法。即先加入未標記特異性抗體與膜上抗原結(jié)合，再加入標記的抗體進行雜交檢測，標記二抗物質(zhì)有放射性核素、酶以及生物素等。雜交過程：1)封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的一抗，封口，4℃孵育過夜或室溫(22-25℃)搖動孵育2h.)液洗膜3次xIOmin)標記的二抗室溫1h,洗膜3x10min八、檢測根據(jù)標記二抗的標記物不同，其雜交的結(jié)果檢測方法也不同，較常用的檢測系統(tǒng)有增強化學發(fā)光(ECL)和DAB檢測］系統(tǒng).1)辣根過氧化物酶-DAB法：①DAB顯色液的配制:按照1mlH2O加顯色劑A,B,C各1滴,混勻.②顯色:將適量DAB顯色液平鋪在二抗雜交后的印跡膜上,室溫放置觀察，可出現(xiàn)明顯的棕褐色蛋白顯色帶③終止:用Tris-HCI緩沖液或水漂洗雜交膜即可終止反應(yīng).2)辣根過氧化物iW?ECL法：增強化學發(fā)光(ECL)檢測是利用辣根過氧化物酶催化化學發(fā)光物質(zhì)，生成一種不穩(wěn)定的中間物質(zhì)，其衰變時在暗室內(nèi)形成明顯的肉眼可見的化學發(fā)光帶，利用X線膠片感光原理，將結(jié)果記錄下來。ECL顯色劑配制：按EP管中加顯色劑A、B各1滴,混勻，在暗室將雜交后跡膜放入顯色盒中，加上混合好的顯色液，反應(yīng)1-5分鐘，用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的顯色液，將一透明的保鮮膜蓋住撫平，并確定干的表面與膠片接觸。將印跡膜在暗室中使膠片暴光1-5分鐘，沖洗膠片以確定所測抗原的正確暴光時間，暴光時間可短至幾秒也可以長到數(shù)小時。沖洗膠片步驟：先在顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止，在放入定影液中漂洗，十秒即可。考馬斯亮藍和DABCoomusUebluestainedgelVMesternblot考馬斯克藍染色：將凝膠取出放入培養(yǎng)皿中加入少量的染色液，以浸沒凝膠為宜，在搖床CoomusUebluestainedgelVMesternblot考馬斯克藍染色：將凝膠取出放入培養(yǎng)皿中加入少量的染色液，以浸沒凝膠為宜，在搖床上震蕩，直到凝膠上出現(xiàn)明顯的條帶為止，一般5-6小時或者4c過夜.然后傾去染色液，用脫色液洗滌宸蕩，其間要不斷換脫色液，宜至脫色液顏色稍清亮，凝膠背景清楚為止。DAB整色常見問題及解決方案D富見問鑒分析與解決方案詡S可能原因婺證或解決辦法封閉不充分延長封閉時間）更換合適用圉閉劑（脫脂饋，0SA,山清等）卜抗儂度過高增加一抗敏倍數(shù).SU幅溫度過高時孵育卜景高二抗聿特融船或與封閉劑減購設(shè)置二抗龍照不加1抗）,降低二抗?jié)舛纫豢够蚨古c封閉劑在孵窗1曲瑕中加入Twe印-2。有殳義反應(yīng)以減姆摩應(yīng).洗腹不充分增加蟒燔膜不合適何。腹比PVDF厘背景保膜二燥保證充分的反應(yīng)液7避免出現(xiàn)千展現(xiàn)象L一抗、二抗等不匹配仃購試劑時認真選取一抗與組織種即一抗與二抗或施底潴系統(tǒng)之間相甌詼這及底枷可通過設(shè)置內(nèi)參可以西收檢解統(tǒng)的有雌.L一抗或加二抗?jié)舛鹊驮黾涌贵w濃度，至儂能間2擱肺一抗或二抗有交叉反應(yīng)封閉時使用溫僦去污劑,WEEN20,或更投封癇（獻翩、BSAU清或明膠L一抗不識別目的物種的靶蛋白查說明書,或彼ClustalW比對j設(shè)陽用■沿硒性條帶設(shè)置陽性對照，尤薪日性對照有給果，但標本沒有則可能A鈣中無靶蛋白或靶蛋白含物位科不含杷蛋白或噓E一太能后者可增加科上稻抗飄效）旃孔20?30喳白件制備時使用蛋白陶雕杯國分^目的蛋白。或很弱sV考段不充分,或洗膜過度婢用麗春紅睹峭重燃FVDF膜需浸透需正宿辨^須度洗脫:境封閉陵含0.5%脫麒婚脫檢騰航體㈱液或電囹解用閉時間L一抗劫使用有效期內(nèi)抗俗分裝保存避免反復凍融取用工作醐E用L;抗程氮蒯制所用溶液和容器中窗曳含有屈氮鈉（HR用時稀驕JE軌就失效直接懶和底轆醛合，如果猛色則說明掠烯11歸有效期內(nèi)、有活域穎物,使用新鮮的底物.1卜既犧過短窕長曝光時間

舞髏數(shù)過—表達使用原始或他少祿曜株，或平行實聆徐丙表東苗雷白樣云目有名鐘修飾形式：乙?；?洪防化、甲基化、烷基化、糖基化等查文獻，使用去修飾的試劑使蛋白恢復其正逢的大小重白樣本璘解使用新鮮格播的標本,并使用蜜白的4解濟廠多非特異性條帶新蛋白或叵族蜜白的分享同種表位查其它文頻導，琪BLAST搜尋，使用說明書報導的細胞;的不同剪摟方式畫一抗紜度過高降低抗體濃度,可LN更少非特異性條帶或條帶位置不對二抗?jié)饣馗弋a(chǎn)生非特異性結(jié)合降低抗體濃度，增加二抗對照選擇特異性更走，只針對重施的一抗抗體耒純化使用單克隆或親和純化“抗住,說？非畤異條帶蛋白存在二聚體或多聚體SDS?PAGE電泳上樣前，以增強蛋白質(zhì)簫聚變性煮沸10min，背景有白色，黑色斑轉(zhuǎn)翌時有鈾或抗體分布不為盡量去除氣泡，抗瘁強肯時保持據(jù)動點抗體與鳥閔劑絡(luò)合過濾封閉劑暗片現(xiàn)白條帶一抗或二抗加入過多福球抗體的儂金目的條帶過低歸高SD4PAGE?海度選擇不合適調(diào)整膠濃度，分子量大的蛋白月低濃度膠，分子量小的蛋I高儂度膠“微笑”條帶遷移過快電泳溫度過高降低電泳速度，低溫電泳（冷室）膜沒有挺均勻濕透使用100%melh3noi浸透膜5p->泊籽量小于10.000選擇小孔徑雕，絡(luò)瞬珞時間轉(zhuǎn)朦不充分罐U等電點等于或接近轉(zhuǎn)微沖iSpHfi可嘗試使用其他短沖液如CAP盤沖浪（pH1”諫使用IE媛沖液如乙懶沖液幫濃度過高過高甲苫濃度總導致金白質(zhì)與SDS分罌，從而沉題凝網(wǎng)同時會使凝蹤縮或變硬，從而抑帶睛分子量蛋白的轉(zhuǎn)移,低甲等儂度轆便用乙醇或異丙修惘轉(zhuǎn)移時間相Thickgel對于屋的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時間

S?cn^c(dYarrodSiond(vd -91SahWo?hS?cn^c(dYarrodSiond(vd -91SahWo?h-注意事項：.免疫印跡雜交的敏感與檢測系統(tǒng)有關(guān)。因此，凝膠電泳時的蛋白上樣量應(yīng)該保證被檢測抗原量不至于太低,如果過低應(yīng)該重新純化和濃縮使用，或者建議做一次梯度稀釋，上樣電泳后，直接考馬斯亮藍染色選擇最佳上樣量。.形成凝膠的試劑要有足夠的純度，激活劑的濃度適當,不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠的質(zhì)量,凝膠時的溫度也將影響凝膠聚合的速度。因此，建議要根據(jù)不同溫度下'適量增減激活劑的川量以保證分離膠從加入激活劑起至開始出現(xiàn)凝膠凝聚的時間為15-20分鐘最佳，對于濃縮膠最佳聚合時間為8-10分鐘開始可見聚合。灌完分離膠加水封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合。.未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時應(yīng)該戴手套口罩防護。梳子插入濃縮膠時，應(yīng)確保沒有氣泡，可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生，梳子拔出來時應(yīng)該小心，不要破壞加樣孔，如有加樣孔上的凝膠歪斜可用針頭插入加樣孔中糾正，但要避免針頭刺入膠內(nèi)。.電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，同時建議低電壓短時間的預電泳，清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通（恒壓10-20V,20-30min）.加樣前樣品應(yīng)先離心，尤其是長時間放置的樣品，以減少蛋白