免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)課件

IL-35對(duì)小鼠的Ⅰ型糖尿病的治療效果評(píng)定及免疫機(jī)制的研究目錄1.立題依據(jù)2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.實(shí)驗(yàn)對(duì)象4.實(shí)驗(yàn)材料5.實(shí)驗(yàn)步驟及方法6.預(yù)期結(jié)果及結(jié)論7.實(shí)驗(yàn)可行性分析8.參考文獻(xiàn)自身免疫性疾?。ˋutoimmunediseases）是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。如今越來(lái)越多的自身免疫性疾病被不斷發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，也越來(lái)越引起人們的關(guān)注。Ⅰ型糖尿病(T1DM自身免疫性胰腺炎)就是其中的一員，其機(jī)制是體內(nèi)除了抗原提呈細(xì)胞（APC）和活化的T淋巴細(xì)胞外正常細(xì)胞幾乎不表達(dá)MHC-Ⅱ類分子，研究表明IFN-γ轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島β細(xì)胞分泌IFN-γ，由于IFN-γ刺激MHC-Ⅱ分子的表達(dá)這種小鼠的胰島β細(xì)胞高表達(dá)MHC-Ⅱ類分子，這樣以來(lái)免疫細(xì)胞就會(huì)結(jié)合并識(shí)別胰島β細(xì)胞然后對(duì)其進(jìn)行攻擊，使其喪失胰島素分泌活性，最終導(dǎo)致體內(nèi)胰島素缺乏。臨床發(fā)現(xiàn)人體發(fā)病機(jī)制與鼠基本相同，患者往往需要終生注射外源性胰島素來(lái)控制體內(nèi)的血糖水平。Ⅰ型糖尿病的發(fā)病率雖然較低，在全球大約有2000萬(wàn)患者，中國(guó)至少有100萬(wàn)的患者，但是Ⅰ型糖尿病常常在幼兒和青少年時(shí)期發(fā)生且為一種多基因遺傳病有較高的遺傳度（75%），表現(xiàn)為明顯的家族遺傳性。同時(shí)，Ⅰ型糖尿病患者如治療不善將引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，如失明、腎衰竭、心臟病、截肢等。因此如果能正確了解Ⅰ型糖尿病的免疫學(xué)機(jī)制，制定更加有效治療及預(yù)防方案，對(duì)于患者本身乃至整個(gè)家族的身體和生活質(zhì)量的提高意義重大。關(guān)于Ⅰ型糖尿病的介紹調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg)是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，是一些CD4+Tcell還可高表達(dá)IL-2受體的α鏈（CD25）分子，胞質(zhì)中表達(dá)Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的T細(xì)胞分化亞群。它的主要功能是通過(guò)抑制CD4+Tcell和CD8+Tcell的活化與增殖從而達(dá)到免疫的負(fù)調(diào)節(jié)作用。

關(guān)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)就是通過(guò)提高NOD系小鼠（Ⅰ型糖尿病患鼠）體內(nèi)的IL-35水平，觀測(cè)小鼠各期的血糖尿糖等水平及后期的Ⅰ型糖尿病發(fā)病率、胰島炎評(píng)分等，評(píng)定IL-35對(duì)Ⅰ型糖尿病的預(yù)防及治療效果，并與其它一些免疫抑制性的藥物（環(huán)孢菌素A）等，進(jìn)行藥敏對(duì)比；體外測(cè)定小鼠體內(nèi)IL-4及干擾素-γ（IFN-γ）的等含量及T淋巴細(xì)胞的亞群分化情況及調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的含量等，對(duì)小鼠的免疫體質(zhì)及IL-35對(duì)Ⅰ型糖尿病作用的免疫學(xué)機(jī)制有大體認(rèn)識(shí)及方向把握，為以后的研究打下基礎(chǔ)。為免疫抑制性新藥（聯(lián)合藥）的開發(fā)及免疫抑制領(lǐng)域的深入研究有一定意義。實(shí)驗(yàn)?zāi)康腘OD系和NON系（正常不患病個(gè)體）小鼠

起源

在對(duì)ICR/Jcl小鼠進(jìn)行近郊培育的第6代，從白內(nèi)障易感亞系分離出非肥胖糖尿病品系（NOD）和非肥胖正常品系（NON）。在近交20代時(shí)，首先發(fā)現(xiàn)NOD雌鼠有胰島素依賴性糖尿病。特征

自發(fā)Ⅰ型糖尿病以及多種自身免疫疾病小鼠。通過(guò)病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，NOD小鼠自身免疫性胰島炎發(fā)生于4周齡。NOD小鼠發(fā)病后，充分呈現(xiàn)該品系小鼠糖尿病的生理生化特征即：尿頻·多飲·高血糖癥狀。在幾周的時(shí)間內(nèi)，血糖迅速升高，飲水量劇增，大量的排尿，體重迅速下降，在這個(gè)過(guò)程中，患鼠血糖呈現(xiàn)迅速上升，后逐步下降，但仍維持高于正常值的狀態(tài)，體重直線下降，最后昏迷而死亡。于12周齡時(shí)出現(xiàn)明顯糖尿病癥狀，至30周齡時(shí)雌性小鼠累計(jì)發(fā)病率可達(dá)到80％。知己知實(shí)驗(yàn)對(duì)象試劑及儀器IL-35試劑，磷酸鹽緩沖液(PBS),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ElISA）試劑盒，流式細(xì)胞儀，CD8及CD4單克隆抗體，注射器等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)器械。實(shí)驗(yàn)材料小鼠的分組與處理

30周后，頸椎脫臼法處死各組小鼠，取各組小鼠胰島做HE色切片進(jìn)行病理性胰島炎評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1>0級(jí)：胰島完整無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)0分；2>1級(jí)：有胰島周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（即胰島周圍炎）或<25%的胰島面積受累，計(jì)1分；3>2級(jí)：浸潤(rùn)至胰島內(nèi)，25%→50%的面積受累,計(jì)2分；4>3級(jí)：>50%的面積受累，計(jì)3分。記錄各組小鼠評(píng)分值胰腺炎嚴(yán)重程度評(píng)分

取各組小鼠脾臟制成單核細(xì)胞懸液，應(yīng)用細(xì)胞流式法進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群（主要是細(xì)胞免疫）計(jì)數(shù)，結(jié)果用百分比表示。T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定

分選提取大鼠脾臟和淋巴結(jié)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞

并進(jìn)行純度和活性檢測(cè)。用免疫磁珠兩步法既陰性選擇和陽(yáng)性

選擇分選提取小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞

純度,臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞

應(yīng)用實(shí)驗(yàn)常用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SAS,SPSS等）進(jìn)行大量數(shù)據(jù)的后處理，整理待分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析預(yù)期結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組小鼠的發(fā)病率遠(yuǎn)低于對(duì)照組小鼠發(fā)病率，體重較對(duì)照組重；且對(duì)照組飲食飲水量遠(yuǎn)多于實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組；血糖和尿糖含量比對(duì)照組低并接近于正常對(duì)照組（可偏高）；IL-4及干擾素-γ（IFN-γ）的含量實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)遠(yuǎn)低于對(duì)照組和正常對(duì)照組鼠，提示實(shí)驗(yàn)組發(fā)生了免疫的抑制（免疫的耐受）；實(shí)驗(yàn)組T淋巴細(xì)胞亞群分化度和活性較對(duì)照組和正常對(duì)照組明顯偏低；調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組計(jì)數(shù)和活性較對(duì)照組和正常對(duì)照組高，提示有免疫抑制及耐受。預(yù)期結(jié)果及結(jié)論預(yù)期結(jié)論

IL-35對(duì)Ⅰ型糖尿病有明顯的抑制或治療作用；由于IL-35使Th0細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞分化（優(yōu)勢(shì)分化方向）從而抑制T淋巴細(xì)胞的其他效應(yīng)性分化（主要有Th1和Th2方向）使IL-2、IL-4及IFN-γ等主要免疫增強(qiáng)因子的分泌減少，有效抑制了荷主的免疫能力，從整體水平上降低自身免疫病的發(fā)生；

Treg的活性增值又能分泌IL-35和促進(jìn)Fas、Fasl途徑激活相關(guān)基因致使T淋巴細(xì)胞凋亡，以上兩項(xiàng)從整體水平上降低自身免疫病的發(fā)生；IFN-γ分泌的減少還能抑制胰島β細(xì)胞產(chǎn)生MHC-Ⅱ類分子使T淋巴細(xì)胞不能對(duì)其產(chǎn)生殺傷作用，從而不會(huì)引起免疫細(xì)胞對(duì)自體胰島β細(xì)胞識(shí)別與破壞，保證了胰島β細(xì)胞的正常胰島素分泌功能，維持血糖的正常。【1】金伯泉·醫(yī)學(xué)免疫學(xué)·第五版·北京：人民衛(wèi)生出版社，2008【2】宋文剛·免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教材·北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2010【3】孫黎飛·細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)研究方法·北京：人民軍醫(yī)出版社，2009【4】王培林，傅松濱·醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)·第三版·北京科學(xué)技術(shù)出版社2011【5】哈佛醫(yī)學(xué)院BrighamandWomen’s醫(yī)院，eBioscience公司的科學(xué)家·Nature·罕見的抑制性因子·美國(guó)·2007【6】王嘉軍·微生物學(xué)免疫學(xué)新進(jìn)展·第37卷，第4期·2011【7】周國(guó)慶，唐琴，黃麗，孫保亮·泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，Treg的免疫磁珠提取純化方法【8】姜小麗，楊婷等·中