蛋白質(zhì)化學(xué)講義

第二章蛋白質(zhì)化學(xué)要求掌握：氨基酸的種類；蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次；蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)；熟悉：氨基酸的重要化學(xué)性質(zhì)；蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的基本原理。了解：蛋白質(zhì)的分類；蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；重點內(nèi)容：氨基酸的種類；蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次；蛋白質(zhì)的變性、別構(gòu)和兩性性質(zhì)。難點內(nèi)容：肽鍵，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。英文名：Protein希臘語：П，本義為“最原初的”“第一重要的”有學(xué)者建議中文譯為朊（ruan）蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子第一節(jié)概述一、蛋白質(zhì)的化學(xué)概念蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。二、蛋白質(zhì)的分類（一）根據(jù)分子形狀：球狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)（分子軸比小于10（分子軸比大于10）較易溶解，如血紅蛋白）可溶性不溶性（如血纖維蛋白原）（角蛋白）（二）根據(jù)化學(xué)組成單純蛋白質(zhì)：僅由氨基酸組成結(jié)合蛋白質(zhì)：蛋白部分+非蛋白部分核蛋白色蛋白糖蛋白脂蛋白磷蛋白（三）根據(jù)溶解度清蛋白：又稱白蛋白，溶于水。精蛋白：溶于水及酸性溶液。組蛋白：溶于水及稀酸溶液。球蛋白：微溶于水和稀的中性鹽。谷蛋白：不溶于水、醇和中性鹽，溶于稀酸稀堿。醇溶蛋白：溶于70~80%乙醇，不溶于水。硬蛋白：不可溶。（三）根據(jù)功能催化功能、調(diào)節(jié)功能、保護和支持功能、運輸功能、儲存和營養(yǎng)功能、收縮和運動功能、防御功能、識別功能、信息傳遞功能、基因表達調(diào)控功能、凝血功能、蛋白質(zhì)的其他眾多生理功能第二節(jié)氨基酸一、蛋白質(zhì)的元素組成的顯著特點平均含氮量等于16%這是凱氏定氮法測定樣品中蛋白質(zhì)總含量的理論基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)百分含量=氮百分含量X6.25注意：（1）所測為粗蛋白（2）不同樣品中換算系數(shù)可不同二、氨基酸的種類（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式NH2R–CO–COOHHR表示側(cè)鏈基團，R基不同則氨基酸不同。氨基酸為兩性電解質(zhì)天然氨基酸有180多種，其中參與蛋白質(zhì)組成的氨基酸稱為蛋白質(zhì)氨基酸。常見蛋白質(zhì)氨基酸有二十種，這二十種氨基酸稱為基本氨基酸其他稱為非蛋白質(zhì)氨基酸。（二）二十種基本氨基酸的分類和結(jié)構(gòu)

見P73表3-2除脯氨酸外，其他十九種基本氨基酸均為α-氨基酸。除甘氨酸外，其他十九種基本氨基酸的Cá均為不對稱碳原子，均具有旋光活性氨基酸的旋光異構(gòu)體是依據(jù)與構(gòu)型標準物甘油醛的結(jié)構(gòu)比較而確定的天然蛋白質(zhì)氨基酸均為L-氨基酸；氨基酸構(gòu)型與旋光方向無必然聯(lián)系氨基酸的旋光方向和大小取決于它的R基性質(zhì)，并與測定溶液的pH有關(guān)，不同pH件氨基和羧基解離狀態(tài)有關(guān)。（三）不常見的氨基酸見P75表3-4三、氨基酸的物理性質(zhì)1、溶解度2、旋光性3、極性四、氨基酸的化學(xué)性質(zhì)（一）a-氨基參與的反應(yīng)

（1）與亞硝酸反應(yīng)（2）與甲醛發(fā)生羥甲基化反應(yīng)（3）酰化反應(yīng)P82（4）烴基化反應(yīng)見P82（二）-羧基參與的反應(yīng)

（1）成鹽反應(yīng)（2）形成酯的反應(yīng)（3）形成酰鹵的反應(yīng)（4）疊氮化反應(yīng)（5）脫羧反應(yīng)（三）a-氨基和羧基共同參與的反應(yīng)（1）兩性解離及等電點(3)與茚三酮反應(yīng)（2）成肽反應(yīng)（四）側(cè)鏈基團的化學(xué)性質(zhì)（1）巰基（-SH）的性質(zhì)（2）羥基（-OH）的性質(zhì)（3）咪唑基的性質(zhì)五、氨基酸的分離分析（一）分配層析：支持劑是一些具有親水性的不溶性物質(zhì)，如纖維素、淀粉、硅膠等。濾紙層析：薄層層析：離子交換層析：陰離子交換樹脂-N(CH3)3OH，陽離子交換樹脂-SO3H電泳：（二）分離氨基酸的層析技術(shù)濾紙層析根據(jù)溶解度原理是分配層析。一種溶質(zhì)（如氨基酸）在互不相溶的兩相溶劑中分配，達到平衡后，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值等于其在兩相溶劑中的溶解度之比，該比值是一常數(shù)，稱為分配系數(shù)。見P73不同溶劑構(gòu)成層析系統(tǒng)的兩相

1、濾紙層析：支持介質(zhì)：濾紙固定相：濾紙纖維吸附的水。極性側(cè)連的氨基酸易溶于水而與固定相親和，移動較慢。流動相：水飽和的有機溶劑,如丁醇-醋酸。非極性側(cè)連的氨基酸易溶于有機溶劑而與流動相親和，移動較快。濾紙層析圖解2、離子交換層析根據(jù)電荷常用強酸型陽離子交換樹脂SO32-Na2+SO32-AA+氨基酸自動分析儀利用離子交換層析3、薄層層析根據(jù)氨基酸

吸附性質(zhì)支持物：玻璃板固定相：硅膠粉或纖維素粉涂布的薄層流動相：有機溶劑氨基酸在硅膠等薄層上反復(fù)吸附與解吸附而得以分離。（三）氨基酸的制備和應(yīng)用P93目前氨基酸的合成方法有5種：1）直接發(fā)酵法；2）添加前體發(fā)酵法；3）酶法；4）化學(xué)合成法；5）蛋白質(zhì)水解提取法。通常將直接發(fā)酵法和添加前體發(fā)酵法統(tǒng)稱為發(fā)酵法。（四）蛋白質(zhì)水解見P93蛋白質(zhì)和多肽是由氨基酸以酰胺鍵形式連接而成的線性大分子。肽鍵與一般的酰胺鍵一樣可以被酸堿或蛋白酶催化水解。酸或堿能夠?qū)⒍嚯耐耆猓杆庖话闶遣糠炙?1、酸水解：常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進行水解，反應(yīng)時間約20小時。此法優(yōu)點：不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點：色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基。2、堿水解一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時。堿水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。該法的優(yōu)點是色氨酸在水解中不受破壞。3、酶水解目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolyticenzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。酶水解多肽不破壞氨基酸，也不發(fā)生消旋化。水解的產(chǎn)物為較小的肽段。第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)肽鍵和肽肽鍵（peptidebond）是蛋白質(zhì)分子中的主要共價鍵，性質(zhì)比較穩(wěn)定。它雖是單鍵，但具有部分雙鍵的性質(zhì)，難以自由旋轉(zhuǎn)而有一定的剛性，因此形成肽鍵平面（圖2－3），則包括連接肽鍵兩端的C═O、Ｎ－Ｈ和2個Cα共6個原子的空間位置處在一個相對接近的平面上，而相鄰2個氨基酸的側(cè)鏈R又形成反式構(gòu)型，從而形成肽鍵與肽鏈復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。肽（peptide）是氨基酸通過肽鍵相連的化合物，蛋白質(zhì)不完全水解的產(chǎn)物也是肽。肽按其組成的氨基酸數(shù)目為2個、3個和4個等不同而分別稱為二肽、三肽和四肽等，一般含10個以下氨基酸組成的稱寡肽（oligopeptide），由10個以上氨基酸組成的稱多肽（polypeptide），它們都簡稱為肽。肽鏈中的氨基酸已不是游離的氨基酸分子，因為其氨基和羧基在生成肽鍵中都被結(jié)合掉了，因此多肽和蛋白質(zhì)分子中的氨基酸均稱為氨基酸殘基（aminoacidresidue）。多肽有開鏈肽和環(huán)狀肽。在人體內(nèi)主要是開鏈肽。開鏈肽具有一個游離的氨基末端和一個游離的羧基末端，分別保留有游離的α－氨基和α－羧基，故又稱為多肽鏈的N端（氨基端）和C端（羧基端），書寫時一般將N端寫在分子的左邊，并用（H）表示，并以此開始對多肽分子中的氨基酸殘基依次編號，而將肽鏈的C端寫在分子的右邊，并用（OH）來表示。目前已有約20萬種多肽和蛋白質(zhì)分子中的肽段的氨基酸組成和排列順序被測定了出來，其中不少是與醫(yī)學(xué)關(guān)系密切的多肽，分別具有重要的生理功能或藥理作用。多肽在體內(nèi)具有廣泛的分布與重要的生理功能。其中谷胱甘肽在紅細胞中含量豐富，具有保護細胞膜結(jié)構(gòu)及使細胞內(nèi)酶蛋白處于還原、活性狀態(tài)的功能。而在各種多肽中，谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)比較特殊，分子中谷氨酸是以其γ－羧基與半胱氨酸的α－氨基脫水縮合生成肽鍵的，且它在細胞中可進行可逆的氧化還原反應(yīng)，因此有還原型與氧化型兩種谷胱甘肽。近年來一些具有強大生物活性的多肽分子不斷地被發(fā)現(xiàn)與鑒定，它們大多具有重要的生理功能或藥理作用，又如一些“腦肽”與機體的學(xué)習(xí)記憶、睡眠、食欲和行為都有密切關(guān)系，這增加了人們對多肽重要性的認識，多肽也已成為生物化學(xué)中引人矚目的研究領(lǐng)域之一。多肽和蛋白質(zhì)的區(qū)別，一方面是多肽中氨基酸殘基數(shù)較蛋白質(zhì)少，一般少于50個，而蛋白質(zhì)大多由100個以上氨基酸殘基組成，但它們之間在數(shù)量上也沒有嚴格的分界線，除分子量外，現(xiàn)在還認為多肽一般沒有嚴密并相對穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，即其空間結(jié)構(gòu)比較易變具有可塑性，而蛋白質(zhì)分子則具有相對嚴密、比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，這也是蛋白質(zhì)發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)，因此一般將胰島素劃歸為蛋白質(zhì)。但有些書上也還不嚴格地稱胰島素為多肽，因其分子量較小。但多肽和蛋白質(zhì)都是氨基酸的多聚縮合物，而多肽也是蛋白質(zhì)不完全水解的產(chǎn)物。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及其規(guī)律性蛋白質(zhì)是大分子化合物，一般由一條肽鏈、上百個氨基酸，即成千上萬個原子組成，分為一、二、三、四4級、四個不同的層次（表2－5），以便進行深入研究，其中二、三、四級均屬于蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)（three-dimensionalstructure，3D）或構(gòu)象（conformation）。隨著研究的深入，現(xiàn)在在蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)之間，又增加了一些超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域(domain)。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（primarystructure）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，專指多肽鏈中氨基酸（殘基）的排列的序列（sequence）。若蛋白質(zhì)分子中含有二硫鍵，一級結(jié)構(gòu)也包括生成二硫鍵的半胱氨酸殘基位置。一級結(jié)構(gòu)就是指蛋白質(zhì)分子中由共價肽鍵相連的基本分子結(jié)構(gòu)。不同的蛋白質(zhì)，首先具有不同的一級結(jié)構(gòu)，因此一級結(jié)構(gòu)是區(qū)別不同蛋白質(zhì)最基本、最重要的標志之一。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的重要性，首先是由于其序列中不同氨基酸側(cè)鏈R的大小、性質(zhì)不同，決定著肽鏈折疊盤曲形成不同的空間結(jié)構(gòu)和功能。同時由于蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是由遺傳物質(zhì)DNA分子上相應(yīng)核苷酸序列、即遺傳密碼決定的，蛋白質(zhì)與DNA分子均為線狀，因此具有“共線性”關(guān)系，不同生物具有不同的遺傳特征，首先是由于其不同的DNA，編碼合成出不同的蛋白質(zhì)，具有不同的一級結(jié)構(gòu)所決定的，因此蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的認識對闡明其眾多生理功能之分子本質(zhì)甚為重要。蛋白質(zhì)分子中氨基酸序列自動分析儀的問世，使蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定有了飛速的發(fā)展。同時由于DNA分子中核苷酸序列的測定也有了迅猛的發(fā)展，且其步驟較蛋白質(zhì)序列測定方法更快速簡便，因此近年來更有通過蛋白質(zhì)相應(yīng)基因DNA序列的測定，來推斷該蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。自然界億萬種不同的蛋白質(zhì)，首先是由于它們有億萬種不同的一級結(jié)構(gòu)，這是其不同空間結(jié)構(gòu)與生理功能的分子基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中相鄰氨基酸殘基形成的局部肽鏈空間結(jié)構(gòu)，是其主鏈原子的局部空間排布。蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)有一些共同的規(guī)律可遵循，其中二級結(jié)構(gòu)主要是周期性出現(xiàn)的有規(guī)則的α-螺旋、β-片層、β-轉(zhuǎn)角、π-螺旋和無規(guī)則線圈等幾種二級結(jié)構(gòu)單元，且這些有序的二級結(jié)構(gòu)單元，主要是靠氫鍵等非共價鍵來維持其空間結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定的。α-螺旋（α-helix）：是蛋白質(zhì)分子中最穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，其基本特征是：肽鏈骨架由肽鍵上的C、N原子與氨基酸殘基中的α碳原子組成，交替形成了肽鏈主鏈，它從N端到C端為順時針方向的右手螺旋結(jié)構(gòu)（圖2-6、2-7）。螺旋每圈由3.6個氨基酸殘基組成，每圈上下螺距為0.54nm（5.4）。相鄰螺旋之間，由第1個氨基酸肽鍵上C═O，隔三個氨基酸殘基，與第5個氨基酸肽鍵上N—H形成氫鍵，其間包括13個原子（圖2-8），故又稱3.613螺旋，且氫鍵方向與α－螺旋長軸基本平行，每相鄰螺旋間有三個氫鍵維持其空間結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定。α-螺旋類似實心棒狀，氨基酸殘基側(cè)鏈R在螺旋外側(cè)。各種蛋白質(zhì)分子中α-螺旋中氨基酸占總氨基酸組成的比例各不相同，如角蛋白中幾乎全是由α-螺旋組成，而小分子蛋白質(zhì)尤其是在多肽中幾乎無α-螺旋的存在。α-螺旋對維持蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定起著十分重要的作用。β-片層結(jié)構(gòu)（β-pleatedsheetstructure）又稱β-折疊，是肽鏈中比較伸展的空間結(jié)構(gòu)，其中肽鍵平面接近平行、但略呈鋸齒狀或扇形。β-片層可由2～5個肽段片層之間經(jīng)C═O與N—H間形成的氫鍵來維系，但氫鍵方向與肽鏈長軸方向相垂直（圖2－9），且反平行方式排列在熱力學(xué)上最為穩(wěn)定。大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)分子中，α-螺旋與β-片層結(jié)構(gòu)都同時存在，且是各種蛋白質(zhì)分子中的主要二級結(jié)構(gòu)，但各占氨基酸組成的比例不同，如表2－6所示。胰島素分子中約有14%的氨基酸殘基組成β-片層結(jié)構(gòu)，而胰糜蛋白酶分子中約有45%氨基酸殘基組成β-片層二級結(jié)構(gòu)，β-片層二級結(jié)構(gòu)的可塑性比較大。β－轉(zhuǎn)角（β－turn，T），指肽鏈出現(xiàn)180o左右轉(zhuǎn)向回折時的“U”形有規(guī)律的二級結(jié)構(gòu)單元，空間結(jié)構(gòu)靠第1個氨基酸殘基上的C═O隔兩個氨基酸殘基與第4個氨基酸殘基上的N—H形成的氫鍵來維持其穩(wěn)定，氫鍵中包括10～12個原子，因此較α-螺旋卷曲得更緊密。β-轉(zhuǎn)角還有幾種亞型，在球狀蛋白質(zhì)中含量豐富，且大多存在于球狀蛋白質(zhì)分子的表面，因此為蛋白質(zhì)生物活性的重要空間結(jié)構(gòu)部位。π-螺旋（π-helix）：主要存在于膠原蛋白分子中，肽鏈以4.4個氨基酸殘基盤旋一圈，靠與螺旋長軸基本平行的氫鍵維持螺旋的穩(wěn)定，氫鍵跨18個原子，故又稱4.418螺旋。它是比α-螺旋稍大而疏松的左手螺旋。在膠原蛋白分子中，三股左手螺旋再盤曲形成穩(wěn)定的右手超螺旋，進一步縮合形成膠原微纖維。隨意卷曲（randoncoil）：又稱無規(guī)律卷曲，是指各種蛋白質(zhì)分子中彼此各不相同、沒有共同規(guī)律可遵循的那些肽段空間結(jié)構(gòu)，它是蛋白質(zhì)分子中一系列無序構(gòu)象的總稱，也可以說是各種蛋白質(zhì)分子中的特征性二級結(jié)構(gòu)。因為在蛋白質(zhì)分子中，并不是所有肽段都形成有序的α-螺旋、β-片層、β-轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構(gòu)的，而是有相當(dāng)部分的肽段，其二級結(jié)構(gòu)在各蛋白質(zhì)分子間彼此并不相似，無共同規(guī)律可遵循，它也普遍存在于各種天然蛋白質(zhì)分子中，同時也是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、乃至更高層次空間結(jié)構(gòu)的形成，決定于其一級結(jié)構(gòu)。由于一級結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基側(cè)鏈R大小與性質(zhì)的不同，使肽鍵可形成不同的α-螺旋、β-片層等二級結(jié)構(gòu)。如一段肽段由相鄰較多酸性氨基酸組成，由于側(cè)鏈R解離帶了相同的負電荷，因此就同性相斥而不易形成穩(wěn)定的α-螺旋；又如一個肽段中集中了較多具有大側(cè)鏈R的氨基酸，因空間位阻也不易形成有序的α-螺旋，而多形成隨意卷曲。而膠原蛋白分子中富含小分子的甘氨酸和脯氨酸、羥脯氨酸，空間位阻小，故易形成三股超螺旋，且由于脯氨酸、羥脯氨酸為亞氨基酸，在形成肽鍵后其氮原子上已無氫原子可形成氫鍵，因此π-螺旋不穩(wěn)定，也就進一步形成了三股超螺旋。超二級結(jié)構(gòu)（supersecondarystructure）和結(jié)構(gòu)域：近年來隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究的深入，發(fā)現(xiàn)不少蛋白質(zhì)分子中的一些二級結(jié)構(gòu)單元，往往有規(guī)則地聚集在一起形成全由α-螺旋、全由β-片層或α-螺旋與β-片層混合、均有的超二級結(jié)構(gòu)基本形式，具體說，形成相對穩(wěn)定的αα、βββ、βαβ、β2α和αTα等超二級結(jié)構(gòu)（圖2－12）又稱模體(motif)或模序。具有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)中，就有β2α和αTα超二級結(jié)構(gòu)存在。且單個或多個超二級結(jié)構(gòu)，尚可進一步集結(jié)起來，形成在蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)中明顯可區(qū)分的區(qū)域，稱結(jié)構(gòu)域（圖2－13），它們分別又是蛋白質(zhì)分子中的一個個功能單位，故不嚴格地又稱之為功能域。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域一般由40～400個氨基酸殘基組成。蛋白質(zhì)超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的重要性，還在于它們往往分別是由該蛋白質(zhì)相應(yīng)基因的DNA鏈上不同的外顯子編碼的。體內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成時，甚至可將分布在不同染色體上的外顯子，通過重組合成出含有不同結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)。但因含有一些相同的結(jié)構(gòu)域，因此就可生成一些具有相似功能的蛋白質(zhì)，形成蛋白質(zhì)家族（proteinfamily），和合成特異性不同的各種免疫球蛋白分子等。又由于結(jié)構(gòu)域僅是大分子蛋白質(zhì)中的一個部分，相對較小，比較容易研究其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，因此結(jié)構(gòu)域已成為目前蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能研究中的一個關(guān)注焦點與熱門課題。蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是指整條多肽鏈中所有氨基酸殘基，包括相距甚遠的氨基酸殘基主鏈和側(cè)鏈所形成的全部分子結(jié)構(gòu)。因此有些在一級結(jié)構(gòu)上相距甚遠的氨基酸殘基，經(jīng)肽鏈折疊在空間結(jié)構(gòu)上可以非常接近。例如肌紅蛋白是一條由153個氨基酸殘基組成的肽鏈，分子中由八個肽段分別形成A～H八段α－螺旋，再進一步通過AB、CD等一些β－轉(zhuǎn)角與隨意卷曲連接，進一步地折疊形成接近球狀的分子三級結(jié)構(gòu)，分子大小為4.3nm×3.5nm×2.3nm（43×35×23）。臨床上也通過測定病人血中的肌紅蛋白來鑒別診斷心絞痛還是心肌梗死.自然界大多數(shù)蛋白質(zhì)都是由一條肽鏈組成的，因此相對穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)就是其特征性的空間結(jié)構(gòu)，這是蛋白質(zhì)分子最顯著的特征之一。不同蛋白質(zhì)有不同的一級結(jié)構(gòu)，因此折疊形成不同的三級結(jié)構(gòu)，賦予它們不同的生理功能。按一級結(jié)構(gòu)人工合成胰島素的成功，并具有降低動物血糖濃度的作用，是一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與生理功能的最好例證。肽鏈折疊卷曲形成的球狀、橢圓形等三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子，往往形成一個親水的分子表面和一個疏水的分子內(nèi)核，靠分子內(nèi)部疏水鍵和氫鍵等來維持其空間結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定。有些蛋白質(zhì)分子的親水表面上也常有一些疏水微區(qū)，或在分子表面形成一些形態(tài)各異的“溝”、“槽”或“洞穴”等結(jié)構(gòu)，一些蛋白質(zhì)的輔基或金屬離子往往就結(jié)合在其中。例如上述肌紅蛋白分子親水表面上，就有一個疏水洞穴，其中結(jié)合著一個含F(xiàn)e2+的血紅素輔基，起著結(jié)合并儲存氧的功能，供肌肉劇烈收縮氧供應(yīng)相對不足時釋放被利用的需要。而結(jié)合了糖、脂的蛋白質(zhì)分子其三級結(jié)構(gòu)就更復(fù)雜了。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)是指各具獨立三級結(jié)構(gòu)多肽鏈再以各自特定形式接觸排布后，結(jié)集所形成的蛋白質(zhì)最高層次空間結(jié)構(gòu)。在此蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中，各具獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱亞基（subunit），亞基單獨存在時不具生物活性，只有按特定組成與方式裝配形成四級結(jié)構(gòu)時，蛋白質(zhì)才具有生物活性。例如血紅蛋白就是由兩條相同、各由141個氨基酸殘基組成的α-亞基和兩條相同、各由146個氨基酸殘基組成的β-亞基按特定方式接觸、排布組成的一個球狀、接近四面體的分子結(jié)構(gòu)。其中α和β亞基分別由七段和八段α-螺旋組成，且β-亞基的三級結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白三級結(jié)構(gòu)十分相似，每個亞基表面疏水洞穴中都分別結(jié)合一個含F(xiàn)e2+血紅素輔基。血紅蛋白四個亞基間主要靠八個鹽鍵和眾多氫鍵維系其嚴密、特定的四級結(jié)構(gòu)，其中一個α亞基肽鏈的N端與另一α-亞基的C端，在空間結(jié)構(gòu)中十分接近，靠鹽鍵結(jié)合，且β-亞基的C端，又和α-亞基的第40位賴氨酸殘基以鹽鍵相連，以維持血紅蛋白嚴密且相對穩(wěn)定的四級結(jié)構(gòu)，完成其在血液中運輸氧氣的生理功能。具有四級結(jié)構(gòu)的整個蛋白質(zhì)分子也大多形成一個親水的分子表面和一個疏水的分子內(nèi)核。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)，包括亞基數(shù)目、種類和空間排布方式各不相同。自然界蛋白質(zhì)的亞基組成數(shù)目多為偶數(shù)，可以由相同或不同的亞基組成，不同的亞基一般都用α、β、γ等來命名，而具有不同催化功能和調(diào)節(jié)功能的酶蛋白亞基，則多用催化亞基C和調(diào)節(jié)亞基R來命名。在蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中，亞基多以對稱的方式結(jié)合排布，并由非共價鍵彼此相互連接。并不是所有蛋白質(zhì)分子都具有四級結(jié)構(gòu)的。大多數(shù)蛋白質(zhì)都只由一條肽鏈組成，只具有三級結(jié)構(gòu)就有生理活性了，只有一部分分子量更大、或具有調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)，才具有四級結(jié)構(gòu)，它由幾條肽鏈組成，從而賦予它特殊的別構(gòu)作用，這對完成其特定生理功能十分重要。另外由于肽鏈亞基間的連結(jié)鍵都是非共價鍵，因此由二硫鍵相連的，如由四條肽鏈組成的免疫球蛋白、由A、B二條肽鏈組成的胰島素分子，不屬于具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，何況胰島素還是一個分子量很小的蛋白質(zhì)。維系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的非共價鍵這些非共價鍵又稱副鍵，包括氫鍵、鹽鍵、疏水鍵和范德瓦士力（vanderWaals）等。其中維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要是氫鍵，維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要是疏水鍵，維持蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的有鹽鍵。事實上各層次蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，都有這些副鍵共同參與，以保證蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定和各種生理功能的正常發(fā)揮。非共價鍵的鍵能要比共價鍵的鍵能小得多，因此容易斷裂，但由于蛋白質(zhì)分子中非共價鍵數(shù)目眾多，因此它們在維持蛋白質(zhì)嚴密空間結(jié)構(gòu)和生理功能上起著十分重要的作用。二硫鍵（disulfidebond）二硫鍵屬于共價鍵，由一條或兩條肽鍵上的兩個半胱氨酸殘基上的巰基經(jīng)脫氫氧化生成。二硫鍵的作用是加固由非共價鍵維系的蛋白質(zhì)分子嚴密的空間結(jié)構(gòu)，在進一步穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象和生理功能上起著重要的作用。但并不是所有蛋白質(zhì)分子中都含有二硫鍵的。含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，一旦其二硫鍵被還原斷裂，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)往往易遭到破壞，生理功能也就喪失。胰島素被還原后就喪失其降低血糖的生物活性。一般細胞合成后分泌到細胞外的蛋白質(zhì)，分子中二硫鍵較多，使此蛋白質(zhì)分子構(gòu)象更趨穩(wěn)定以便順利完成其生理功能，如胰島素、血漿白蛋白和免疫球蛋白等，而存在于細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分子，往往二硫鍵較少，因為在細胞內(nèi)是富含還原型谷胱甘肽的生理環(huán)境。第四節(jié)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子中關(guān)鍵活性部位氨基酸殘基的改變，會影響其生理功能，甚至造成分子?。╩oleculardisease）。例如鐮狀細胞貧血，就是由于血紅蛋白分子中兩個β亞基第6位正常的谷氨酸變異成了纈氨酸，從酸性氨基酸換成了中性支鏈氨基酸，降低了血紅蛋白在紅細胞中的溶解度，使它在紅細胞中隨血流至氧分壓低的外周毛細血管時，容易凝聚并沉淀析出，從而造成紅細胞破裂溶血和運氧功能的低下。另實驗證明，若切除了促腎上腺皮質(zhì)激素或胰島素A鏈N端的部分氨基酸，它們的生物活性也會降低或喪失，可見關(guān)鍵部分氨基酸殘基對蛋白質(zhì)和多肽功能的重要作用。所謂“分子病”，首先是蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的改變，從而引起其功能的異?；騿适斐傻募膊　？梢姷鞍踪|(zhì)關(guān)鍵部位甚至僅一個氨基酸殘基的異常，對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和生理功能均會有明顯的影響。分子病是基因突變引起的遺傳性疾病，當(dāng)然首先就是DNA分子結(jié)構(gòu)的改變，是其分子編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)基因結(jié)構(gòu)的改變，這是1949年美國科學(xué)家Pauling在研究血紅蛋白時首先提出來的。目前已知血紅蛋白分子異常有500多種，其中約一半在臨床上可造成分子病。分子病也包括整條多肽鏈在合成時的缺失，如血紅蛋白分子病中的地中海貧血，可缺失血紅蛋白α－亞基或β－亞基等?，F(xiàn)在已知人類有幾千種先天遺傳性疾病，其中大多是由于相應(yīng)蛋白質(zhì)分子異?；蛉笔?。另一方面，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系中，一些非關(guān)鍵部位氨基酸殘基的改變或缺失，則不會影響蛋白質(zhì)的生物活性。例如人、豬、牛、羊等哺乳動物胰島素分子A鏈中8、9、10位和B鏈30位的氨基酸殘基各不相同，有種族差異，但這并不影響它們都具有降低生物體血糖濃度的共同生理功能。又如在人群的不同個體之間，同一種蛋白質(zhì)有時也會有氨基酸殘基的不同或差異，個體之間，同一種蛋白質(zhì)中有時會存在一級結(jié)構(gòu)的微小差異，但這也并不影響不同個體中它們擔(dān)負相同的生理功能。但差異的氨基酸，若是在氨基酸分類中從脂肪族換成芳香族氨基酸等，即蛋白質(zhì)之間的免疫原性就會差異較大，由這些蛋白質(zhì)組成人體組織、器官，在臨床上進行移植時，就可產(chǎn)生排異反應(yīng)。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系十分復(fù)雜。不同生物中具有相似生理功能的蛋白質(zhì)或同一種生物體內(nèi)具有相似功能的蛋白質(zhì)，其一級結(jié)構(gòu)往往相似，但也有時可相差很大。如催化DNA復(fù)制的DNA聚合酶，細菌的和小鼠的就相差很大，具有明顯的種族差異，可見生命現(xiàn)象十分復(fù)雜多樣。蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)和其性質(zhì)及生理功能的關(guān)系也十分密切。不同的蛋白質(zhì)，正因為具有不同的空間結(jié)構(gòu)，因此具有不同的理化性質(zhì)和生理功能。如指甲和毛發(fā)中的角蛋白，分子中含有大量的α-螺旋二級結(jié)構(gòu)，因此性質(zhì)穩(wěn)定堅韌又富有彈性，這是和角蛋白的保護功能分不開的；而膠原蛋白的三股π螺旋平行再幾股擰成纜繩樣膠原微纖維結(jié)構(gòu)，使其性質(zhì)穩(wěn)定而具有強大的抗張力作用，因此是組成肌腱、韌帶、骨骼和皮膚的主要蛋白質(zhì)；絲心蛋白正因為分子中富含β-片層結(jié)構(gòu)，因此分子伸展，蠶絲柔軟卻沒有多大的延伸性。事實上不同的酶，催化不同的底物起不同的反應(yīng)，表現(xiàn)出酶的特異性，也是和不同的酶具有各自不相同且獨特的空間結(jié)構(gòu)密切有關(guān)。又如細胞質(zhì)膜上一些蛋白質(zhì)是離子通道，就是因為在其多肽鏈中的一些α-螺旋或β－折疊二級結(jié)構(gòu)中，一側(cè)多由親水性氨基酸組成，而另一側(cè)卻多由疏水性氨基酸組成，因此是具有“兩親性”（amphipathic）的特點，幾段α-螺旋或β-折疊的親水側(cè)之間就構(gòu)成了離子通道，而其疏水側(cè)，即通過疏水鍵將離子通道蛋白質(zhì)固定在細胞質(zhì)膜上。載脂蛋白也具有兩親性，既能與血漿中脂類結(jié)合，又使之溶解在血液中進行脂類的運輸。兩親性使蛋白質(zhì)間形成二聚體也十分重要。具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，尚有重要的別構(gòu)作用（allostericeffect），又稱變構(gòu)作用。別構(gòu)作用是指一些生理小分子物質(zhì)，作用于具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，與其活性中心外別的部位結(jié)合，引起蛋白質(zhì)亞基間一些副鍵的改變，使蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生輕微變化，包括分子變得疏松或緊密，從而使其生物活性升高或降低的過程。具有四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的別構(gòu)作用，其活性得到不斷調(diào)正，從而使機體適應(yīng)千變?nèi)f化的內(nèi)、外環(huán)境，因此推斷這是蛋白質(zhì)進化到具有四級結(jié)構(gòu)的重要生理意義之一。血紅蛋白運氧中也有別構(gòu)作用：當(dāng)血紅蛋白分子第一個亞基與氧結(jié)合后，該亞基構(gòu)象的輕微改變，可導(dǎo)致4個亞基間鹽鍵的斷裂，使亞基間的空間排布和四級結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變，血紅蛋白分子從較緊密的T型轉(zhuǎn)變成較松弛的R型構(gòu)象，從而使血紅蛋白其他亞基與氧的結(jié)合容易化，產(chǎn)生了正協(xié)同作用，呈現(xiàn)出與肌紅蛋白不同的“S”形氧解離曲線，完成其更有效的運氧功能。氧對生命十分重要，但氧又難溶于水，生物進化到脊椎動物，產(chǎn)生了血紅蛋白與肌紅蛋白，尤其是血紅蛋白具有四級結(jié)構(gòu)和別構(gòu)作用，使之能更有效地完成運氧功能。它就像撕一張四聯(lián)郵票，當(dāng)撕第一張時較費力，但撕第二、三張時就容易些了，當(dāng)撕到第四張郵票時幾乎可以不費力氣一樣，即血紅蛋白變構(gòu)到第四個亞基與氧的結(jié)合時就更容易了（圖2－22）。當(dāng)然，血紅蛋白是由四個亞基聚合而成的蛋白質(zhì)，在變構(gòu)中亞基是絕對不能分開的，只是整個構(gòu)象的改變。第五節(jié)蛋白質(zhì)的重要理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)分子的大?。ㄒ唬┓肿恿繂挝粸椤癲alton”1dalton=1.661X10-241KD=1000蛋白質(zhì)分子量在6KD~1000KD（二）單純蛋白質(zhì)的分子量與氨基酸殘基數(shù)目估算蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)目=分子量÷110說明：1、蛋白質(zhì)20種基本氨基酸平均分子量為138；2、多數(shù)蛋白質(zhì)中較小的氨基酸占多數(shù)，因此平均分子量接近128；3、氨基酸以肽鍵相連，每形成一個肽鍵縮去一分子H2O（分子量18）；4、因此氨基酸殘基平均分子量取110例如：牛胰島素分子量為5733則其氨基酸殘基數(shù)目nn=5733÷110=52(個)實際上牛胰島素分子由51個氨基酸殘基組成。二、膠體性質(zhì)1、蛋白質(zhì)溶液是親水膠體2、透析和超濾使蛋白質(zhì)與小分子雜質(zhì)分開三、兩性解離和等電點1、兩性解離蛋白質(zhì)是多價解離的兩性電解質(zhì)2、等電點概念見P115特征等電點時，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，但總電荷量不一定最少。蛋白質(zhì)的等電點隨緩沖液性質(zhì)、離子強度等變化，描述等電點時須注明條件。在水溶液中蛋白質(zhì)的等電點一般偏酸，因羧基解離大于氨基解離。等電點時，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)率、滲透壓、粘度、溶解度等達最低值。等電點沉淀法是分離蛋白質(zhì)的方法之一。蛋白質(zhì)在純水中的等電點稱為等離子點，是特征性常數(shù)。等電點不一定等于等離子點。三、電泳現(xiàn)象1、電泳現(xiàn)象：帶電粒子在電場中向與本身所帶電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。2、電泳的分類：根據(jù)電泳所用支持介質(zhì)分為紙電泳、凝膠電泳、粉末電泳等；根據(jù)電泳時不同蛋白質(zhì)組分形成的形狀分為：自由界面電泳區(qū)帶電泳圓盤電泳3、蛋白質(zhì)電泳技術(shù)（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(poly-acrylamidegelelectrophoresis)由丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺在催化劑TEMED作用下形成的凝膠。蛋白質(zhì)分子根據(jù)荷質(zhì)比得以分離。（2）SDS測定蛋白質(zhì)分子量原理蛋白質(zhì)樣品加入陰離子去污劑—十二烷基磺酸鈉（SDS）處理。SDS可與蛋白質(zhì)定量結(jié)合：SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物表面覆蓋相同密度的大量負電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)分子本身的電荷差異；SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物形狀均為橢圓棒狀。SDS存在時，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率與其本身所帶電荷和分子形狀無關(guān)，僅取決于它的分子量。此時蛋白質(zhì)的分子量的對數(shù)與其電泳遷移率成正比。如首先用還原劑巰基乙醇打開二硫鍵，再用SDS處理可測定蛋白質(zhì)亞基的分子量。（3）等電聚焦電泳（isoelectricfocusingelectrophoresis,IFE)PAGE凝膠中加入兩性電解質(zhì)（ampholine)，在外加電場下可自然形成連續(xù)PH梯度，電泳時各蛋白質(zhì)遷移到其等電點PH處并停留。可測定蛋白質(zhì)等電點。四、變性作用1、概念見P1172、引起蛋白質(zhì)變性的因素物理因素：加熱、紫外線、超聲波、射線、振蕩等。化學(xué)因素：強酸、強堿、有機溶劑、重金屬等。3、變性本質(zhì)與可逆變性蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)破壞，一級結(jié)構(gòu)并未破壞。denaturationrenaturation4、蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)溶解度降低生物活性降低或喪失粘度增加反應(yīng)基團增加易被酶消化5、蛋白質(zhì)凝固見P119

凝固是蛋白質(zhì)深度變性，不可逆轉(zhuǎn)。五、別構(gòu)作用（一）有關(guān)概念1、變構(gòu)現(xiàn)象蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化從而引起蛋白質(zhì)分子性質(zhì)發(fā)生改變，以適應(yīng)生理功能的現(xiàn)象。與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起蛋白質(zhì)變構(gòu)的物質(zhì)稱為別構(gòu)效應(yīng)物或別構(gòu)調(diào)節(jié)劑。被蛋白質(zhì)結(jié)合并受蛋白質(zhì)作用的分子稱為蛋白質(zhì)的底物或配基。如O2是血紅蛋白的配基。別構(gòu)效應(yīng)：別構(gòu)效應(yīng)物與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變從而改變其生物活性的現(xiàn)象。有時配基本身就是別構(gòu)效應(yīng)劑。如O2是血紅蛋白的配基，也是別構(gòu)效應(yīng)物。（二）血紅蛋白氧合的別構(gòu)效應(yīng)血紅蛋白是由兩條α鏈和兩條β-鏈組成的四聚體蛋白質(zhì)。α鏈和β-鏈的三級結(jié)構(gòu)和肌紅蛋白非常相似，每條鏈各結(jié)合一個血紅素輔基，故每分子血紅蛋白可攜帶4個O2A、兩種分子構(gòu)象Hb:血紅蛋白的4個亞基之間由8個鹽鍵相連，整個分子結(jié)構(gòu)緊密，不易和O2分子結(jié)合。HbO2的別構(gòu)效應(yīng)：當(dāng)O2分子與一個亞基的血紅素卟啉鐵結(jié)合后，鐵原子半徑縮小，牽引相鄰肽段，該亞基構(gòu)象改變，鹽鍵破壞，