酶工程教學(xué)課件_第1頁(yè)
酶工程教學(xué)課件_第2頁(yè)
酶工程教學(xué)課件_第3頁(yè)
酶工程教學(xué)課件_第4頁(yè)
酶工程教學(xué)課件_第5頁(yè)
已閱讀5頁(yè),還剩75頁(yè)未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

酶工程山東師范大學(xué)幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除,謝謝!本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除,謝謝!酶工程山東師范大學(xué)幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用第一節(jié)抗體酶(Abzyme)一、抗體酶的理論基礎(chǔ)抗體蛋白的特性:抗體(antibody):抗原(antigen):半抗原(hapten):第一節(jié)抗體酶(Abzyme)一、抗體酶的理論基礎(chǔ)酶工程教學(xué)課件IgG的三級(jí)結(jié)構(gòu)IgG的三級(jí)結(jié)構(gòu)IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格抗體與酶的異同:相同點(diǎn):都是蛋白質(zhì),都有特異性。不同點(diǎn):1)抗體無(wú)催化活力,酶有催化活力。2)本質(zhì)差別:酶是能與反應(yīng)過(guò)渡態(tài)選擇結(jié)合的催化物質(zhì),抗體是和基態(tài)緊密結(jié)合的物質(zhì)。3)酶的活性和合成受到代謝調(diào)節(jié),種類(lèi)有限??贵w只有在抗原存在時(shí)才產(chǎn)生,種類(lèi)無(wú)限??贵w與酶的異同:2.酶與底物形成過(guò)渡態(tài)理論

酶的催化在于能結(jié)合底物產(chǎn)生過(guò)渡態(tài),降低能障(反應(yīng)的活化能)。以過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物作為半抗原,誘導(dǎo)與其互補(bǔ)構(gòu)象的抗體,使其具有催化活性,可觀察到抗體催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。2.酶與底物形成過(guò)渡態(tài)理論二、抗體酶的定義抗體酶又稱(chēng)催化抗體(catalyticantibody),是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物,本質(zhì)上是一類(lèi)具有催化活力的免疫球蛋白,在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。二、抗體酶的定義三、抗體酶的制備1.誘導(dǎo)法用設(shè)計(jì)好的半抗原,通過(guò)與載體蛋白(如牛血清白蛋白)偶聯(lián)制成抗原。然后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫,取免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交,雜交細(xì)胞則分泌單克隆抗體,經(jīng)篩選和純化,得抗體酶。三、抗體酶的制備酶工程教學(xué)課件2.拷貝法用酶作為抗原免疫動(dòng)物得到抗酶的抗體,再將此抗體免疫動(dòng)物并進(jìn)行單克隆化,獲得單克隆的抗抗體。對(duì)抗抗體進(jìn)行篩選,獲得具有原來(lái)酶活性的抗體酶。2.拷貝法酶工程教學(xué)課件四、抗體酶的應(yīng)用1.戒毒:

用可卡因水解的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物-磷酸單酯為半抗原,產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解,水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。四、抗體酶的應(yīng)用2.腫瘤治療

抗體介導(dǎo)前藥治療技術(shù):將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專(zhuān)一性抗體相偶聯(lián),則酶通過(guò)和腫瘤結(jié)合的抗體存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后,當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近,抗體酶將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物。2.腫瘤治療第二節(jié)核酶〔Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的種類(lèi)三、核酶的應(yīng)用四、核酶面臨的問(wèn)題五、影響核酶活性的因素第二節(jié)核酶〔Ribozyme)一、核酶的概念具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化劑(Biocatalyst)蛋白質(zhì)類(lèi):天然酶

enzyme極端酶extremozyme抗體酶abzyme生物工程酶其它:模擬酶核酸類(lèi):克隆酶遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化I型內(nèi)含子剪接型核酶II型內(nèi)含子錘頭核酶剪切型核酶發(fā)夾核酶自體催化丁型肝炎病毒(HDV)核酶RNaseP異體催化

二、核酶的分類(lèi)I型內(nèi)含子二、核酶的分類(lèi)1.剪接型核酶剪接型核酶的作用機(jī)制是通過(guò)既剪又接的方式除去內(nèi)含子〔Intron)。1.剪接型核酶剪接型核酶的作用機(jī)制是通過(guò)既剪又接的1〕I類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing)I型IVS是與四膜蟲(chóng)26srRNA前體的IVS構(gòu)造相似的間隔序列,具有環(huán)狀構(gòu)造。通過(guò)轉(zhuǎn)磷酸酯反響,生成成熟的26srRNA及G-IVS,G-IVS經(jīng)兩次環(huán)化生成L-19IVS。催化過(guò)程需要鳥(niǎo)苷酸或鳥(niǎo)苷以及鎂離子參與。剪接機(jī)制L-19IVS在體外的多種酶活性1〕I類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing)I型Ip3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HO

Ⅰ類(lèi)內(nèi)含子的剪接機(jī)制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外顯子內(nèi)含子或居間序列(Interveningsequence,IVS)5‘p3’

UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU

AAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜蟲(chóng)rRNA前體自我剪接反應(yīng)UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU酶工程教學(xué)課件1、轉(zhuǎn)核苷酸作用2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、轉(zhuǎn)磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性?xún)?nèi)切酶作用CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpN1、轉(zhuǎn)核苷酸作用2〕Ⅱ類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接Ⅱ型IVS是與細(xì)胞核mRNA前體的IVS構(gòu)造相似的間隔序列。通過(guò)轉(zhuǎn)磷酸酯反響,生成成熟的RNA及套環(huán)狀的IVS。催化的剪接反響不需要鳥(niǎo)苷或鳥(niǎo)苷酸參加,但仍需要鎂離子(Mg2+)。剪接機(jī)制2〕Ⅱ類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接Ⅱ型IVS是與細(xì)胞核mRNA前體的Ip2‘HO-Ap

p-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ類(lèi)內(nèi)含子的剪接機(jī)制Mg2+套環(huán)的形成5‘3‘外顯子連接p2‘pp-Ap3’pP-AHO3’Ⅱ類(lèi)內(nèi)含子2.剪切型核酶

這類(lèi)RNA進(jìn)展自身催化的反響是只切不接。

1〕自體催化剪切型

剪切機(jī)制

2.剪切型核酶

這類(lèi)RNA進(jìn)展自身催化的反響是只切不接轉(zhuǎn)酯化過(guò)程:由靠近切割位點(diǎn)3‘端的2’OH或氧原子對(duì)切割位點(diǎn)的磷原子實(shí)施親核攻擊,產(chǎn)生5‘-OH和2’,3‘-環(huán)磷酸二酯。剪切機(jī)制核酶自身剪切反應(yīng)轉(zhuǎn)酯化過(guò)程:剪切機(jī)制核酶自身剪切反應(yīng)錘頭型核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖三個(gè)雙螺旋區(qū)。13個(gè)核苷酸殘基保守序列。剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3‘端自動(dòng)發(fā)生。錘頭型核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間立體發(fā)夾〔hairpin〕構(gòu)造1989年漢普〔Hample〕研究煙草環(huán)斑病毒〔sTRSV〕的負(fù)鏈RNA的自我剪切反響,提出發(fā)夾構(gòu)造〔hairpinstructure〕模型。發(fā)夾核酶構(gòu)造模型發(fā)夾〔hairpin〕構(gòu)造1989年漢普〔Hample〕研四個(gè)螺旋區(qū)、三個(gè)連接區(qū)和兩個(gè)環(huán)。剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識(shí)別序列GUC的5‘端。5‘3‘發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)模型剪切位點(diǎn)四個(gè)螺旋區(qū)、三個(gè)連接區(qū)和兩個(gè)環(huán)。5‘3‘發(fā)2)異體催化剪切型

核糖核酸酶P(RNaseP)是內(nèi)切核酸酶,是核糖核蛋白體復(fù)合物,能剪切所有tRNA前體的5‘端,除去多余的序列,形成3’-OH和5’-磷酸末端。RNaseP由M1RNA和蛋白質(zhì)亞基組成。2)異體催化剪切型三、核酶的應(yīng)用1.基礎(chǔ)理論:生命起源的探索2.醫(yī)藥:1)通過(guò)識(shí)別特定位點(diǎn)而抑制目標(biāo)基因的表達(dá),抑制效率高,專(zhuān)一性強(qiáng)。如抗肝炎病毒、抗人類(lèi)免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-Ⅰ)、抗腫瘤。2)免疫原性低,很少引起免疫反應(yīng)。3.植物抗病毒三、核酶的應(yīng)用1.基礎(chǔ)理論:生命起源的探索

四、核酶面臨的問(wèn)題1、核酶催化效率低。2、核酶本身是RNA,很容易被核酸水解酶RNase破壞。四、核酶面臨的問(wèn)題1、核酶催化效率低。五、影響核酶活性的因素1、pH值對(duì)活性的影響:pH7.0-7.5時(shí)核酶活性最高。2、二價(jià)金屬陽(yáng)離子對(duì)活性的影響:Mg2+Mn2+

3、抗生素對(duì)活性的影響:大多數(shù)為抑制效應(yīng)4、變性劑對(duì)活性的影響:5、溫度對(duì)活性的影響:

五、影響核酶活性的因素1、pH值對(duì)活性的影響:第三節(jié)極端酶(extremozyme)一、極端微生物和極端酶

1.極端微生物:又稱(chēng)嗜極菌(extremophiles),是在超常生態(tài)環(huán)境條件下生存的微生物。

第三節(jié)極端酶(extremozyme)根據(jù)所耐受的環(huán)境條件不同,分為:嗜熱菌(thermophiles)超嗜熱菌(hyperthermophiles)嗜冷菌(psychrophiles)嗜鹽菌(halophiles)嗜酸菌(acidophiles)嗜堿菌(alkaliphiles)嗜壓菌(barophiles)抗輻射的微生物根據(jù)所耐受的環(huán)境條件不同,分為:2.極端酶的制備1)天然極端酶的篩選和生產(chǎn)2)蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)極端酶2.極端酶的制備思考題:思考題:GoodLuckforthefinalExam!

Greatsuccessinyourfuturecareer!GoodLuckforthefinalExam!

酶工程山東師范大學(xué)幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除,謝謝!本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用學(xué)習(xí)完請(qǐng)自行刪除,謝謝!酶工程山東師范大學(xué)幻燈片本課件PPT僅供大家學(xué)習(xí)使用第一節(jié)抗體酶(Abzyme)一、抗體酶的理論基礎(chǔ)抗體蛋白的特性:抗體(antibody):抗原(antigen):半抗原(hapten):第一節(jié)抗體酶(Abzyme)一、抗體酶的理論基礎(chǔ)酶工程教學(xué)課件IgG的三級(jí)結(jié)構(gòu)IgG的三級(jí)結(jié)構(gòu)IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格IgG與抗原形成

的交聯(lián)晶格抗體與酶的異同:相同點(diǎn):都是蛋白質(zhì),都有特異性。不同點(diǎn):1)抗體無(wú)催化活力,酶有催化活力。2)本質(zhì)差別:酶是能與反應(yīng)過(guò)渡態(tài)選擇結(jié)合的催化物質(zhì),抗體是和基態(tài)緊密結(jié)合的物質(zhì)。3)酶的活性和合成受到代謝調(diào)節(jié),種類(lèi)有限??贵w只有在抗原存在時(shí)才產(chǎn)生,種類(lèi)無(wú)限??贵w與酶的異同:2.酶與底物形成過(guò)渡態(tài)理論

酶的催化在于能結(jié)合底物產(chǎn)生過(guò)渡態(tài),降低能障(反應(yīng)的活化能)。以過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物作為半抗原,誘導(dǎo)與其互補(bǔ)構(gòu)象的抗體,使其具有催化活性,可觀察到抗體催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。2.酶與底物形成過(guò)渡態(tài)理論二、抗體酶的定義抗體酶又稱(chēng)催化抗體(catalyticantibody),是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物,本質(zhì)上是一類(lèi)具有催化活力的免疫球蛋白,在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。二、抗體酶的定義三、抗體酶的制備1.誘導(dǎo)法用設(shè)計(jì)好的半抗原,通過(guò)與載體蛋白(如牛血清白蛋白)偶聯(lián)制成抗原。然后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫,取免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交,雜交細(xì)胞則分泌單克隆抗體,經(jīng)篩選和純化,得抗體酶。三、抗體酶的制備酶工程教學(xué)課件2.拷貝法用酶作為抗原免疫動(dòng)物得到抗酶的抗體,再將此抗體免疫動(dòng)物并進(jìn)行單克隆化,獲得單克隆的抗抗體。對(duì)抗抗體進(jìn)行篩選,獲得具有原來(lái)酶活性的抗體酶。2.拷貝法酶工程教學(xué)課件四、抗體酶的應(yīng)用1.戒毒:

用可卡因水解的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物-磷酸單酯為半抗原,產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解,水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。四、抗體酶的應(yīng)用2.腫瘤治療

抗體介導(dǎo)前藥治療技術(shù):將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專(zhuān)一性抗體相偶聯(lián),則酶通過(guò)和腫瘤結(jié)合的抗體存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后,當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近,抗體酶將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物。2.腫瘤治療第二節(jié)核酶〔Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的種類(lèi)三、核酶的應(yīng)用四、核酶面臨的問(wèn)題五、影響核酶活性的因素第二節(jié)核酶〔Ribozyme)一、核酶的概念具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化劑(Biocatalyst)蛋白質(zhì)類(lèi):天然酶

enzyme極端酶extremozyme抗體酶abzyme生物工程酶其它:模擬酶核酸類(lèi):克隆酶遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化I型內(nèi)含子剪接型核酶II型內(nèi)含子錘頭核酶剪切型核酶發(fā)夾核酶自體催化丁型肝炎病毒(HDV)核酶RNaseP異體催化

二、核酶的分類(lèi)I型內(nèi)含子二、核酶的分類(lèi)1.剪接型核酶剪接型核酶的作用機(jī)制是通過(guò)既剪又接的方式除去內(nèi)含子〔Intron)。1.剪接型核酶剪接型核酶的作用機(jī)制是通過(guò)既剪又接的1〕I類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing)I型IVS是與四膜蟲(chóng)26srRNA前體的IVS構(gòu)造相似的間隔序列,具有環(huán)狀構(gòu)造。通過(guò)轉(zhuǎn)磷酸酯反響,生成成熟的26srRNA及G-IVS,G-IVS經(jīng)兩次環(huán)化生成L-19IVS。催化過(guò)程需要鳥(niǎo)苷酸或鳥(niǎo)苷以及鎂離子參與。剪接機(jī)制L-19IVS在體外的多種酶活性1〕I類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing)I型Ip3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HO

Ⅰ類(lèi)內(nèi)含子的剪接機(jī)制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外顯子內(nèi)含子或居間序列(Interveningsequence,IVS)5‘p3’

UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU

AAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜蟲(chóng)rRNA前體自我剪接反應(yīng)UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU酶工程教學(xué)課件1、轉(zhuǎn)核苷酸作用2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、轉(zhuǎn)磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性?xún)?nèi)切酶作用CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpN1、轉(zhuǎn)核苷酸作用2〕Ⅱ類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接Ⅱ型IVS是與細(xì)胞核mRNA前體的IVS構(gòu)造相似的間隔序列。通過(guò)轉(zhuǎn)磷酸酯反響,生成成熟的RNA及套環(huán)狀的IVS。催化的剪接反響不需要鳥(niǎo)苷或鳥(niǎo)苷酸參加,但仍需要鎂離子(Mg2+)。剪接機(jī)制2〕Ⅱ類(lèi)內(nèi)含子的自我剪接Ⅱ型IVS是與細(xì)胞核mRNA前體的Ip2‘HO-Ap

p-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ類(lèi)內(nèi)含子的剪接機(jī)制Mg2+套環(huán)的形成5‘3‘外顯子連接p2‘pp-Ap3’pP-AHO3’Ⅱ類(lèi)內(nèi)含子2.剪切型核酶

這類(lèi)RNA進(jìn)展自身催化的反響是只切不接。

1〕自體催化剪切型

剪切機(jī)制

2.剪切型核酶

這類(lèi)RNA進(jìn)展自身催化的反響是只切不接轉(zhuǎn)酯化過(guò)程:由靠近切割位點(diǎn)3‘端的2’OH或氧原子對(duì)切割位點(diǎn)的磷原子實(shí)施親核攻擊,產(chǎn)生5‘-OH和2’,3‘-環(huán)磷酸二酯。剪切機(jī)制核酶自身剪切反應(yīng)轉(zhuǎn)酯化過(guò)程:剪切機(jī)制核酶自身剪切反應(yīng)錘頭型核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖三個(gè)雙螺旋區(qū)。13個(gè)核苷酸殘基保守序列。剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3‘端自動(dòng)發(fā)生。錘頭型核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間立體發(fā)夾〔hairpin〕構(gòu)造1989年漢普〔Hample〕研究煙草環(huán)斑病毒〔sTRSV〕的負(fù)鏈RNA的自我剪切反響,提出發(fā)夾構(gòu)造〔hairpinstructure〕模型。發(fā)夾核酶構(gòu)造模型發(fā)夾〔hairpin〕構(gòu)造1989年漢普〔Hample〕研四個(gè)螺旋區(qū)、三個(gè)連接區(qū)和兩個(gè)環(huán)。剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識(shí)別序列GUC的5‘端。5‘3‘發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)模型剪切位點(diǎn)四個(gè)螺旋區(qū)、三個(gè)連接區(qū)和兩個(gè)環(huán)。5‘3‘發(fā)2)異體催化剪切型

核糖核酸酶P(RNaseP)是內(nèi)切核酸酶,是核糖核蛋白體復(fù)合物,能剪切所有tRNA前體的5‘端,除去多余的序列,形成3’-OH和5’-磷酸末端。RNaseP由M1RNA和蛋白質(zhì)亞基

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論