基因工程的操作

第二節(jié)基因工程的基本操作程序生長快、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國)

基因工程（DNA重組技術(shù)）是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定概念：一、目的基因的獲取目的基因：

主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，例如，與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因，與生物藥物和保健品相關(guān)的基因，以及與工業(yè)所需酶相關(guān)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。獲取目的基因的方法：人工合成從基因文庫中獲得目的基因PCR技術(shù)擴(kuò)增從基因文庫中獲得目的基因1、概念:將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因庫。2、分類:基因組文庫部分基因文庫(如cDNA文庫)基因組文庫:將某種生物體內(nèi)的DNA全部提取出來，選用適當(dāng)?shù)南拗泼?，將DNA切成一定范圍大小的DNA片段，然后，將這些DNA片段分別與載體連接起來，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，每個(gè)受體菌都含有了一段不同的DNA片段，也就是說，這個(gè)群體包含了這種生物的所有基因，叫做這種生物的基因組文庫。cDNA文庫如果用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA（也叫cDNA)片段，與載體連接后儲存在一個(gè)受體菌群中，那么，這個(gè)受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫。基因組文庫的構(gòu)建②cDNA文庫的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)思考？1、怎樣從基基因文庫中得得到我們所需需的目的基因因?根據(jù)基因的核苷酸序列，，基因的功能能，基因在染染色體上的位位置，基因的的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以以及基因的表表達(dá)產(chǎn)物蛋白白質(zhì)等特殊性性來獲得目的基基因。利用PCR技技術(shù)擴(kuò)增目的基因1、定義：PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒捶磻?yīng)的縮寫，是一一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核核酸合成技術(shù)術(shù)，通過這一一技術(shù)，可以以在短時(shí)間內(nèi)內(nèi)大量擴(kuò)增目目的基因。2、原理：它是利用DNA雙鏈復(fù)制制的原理，將將基因的核苷苷酸序列不斷斷地加以復(fù)制制，使其數(shù)量量呈指數(shù)方式增長長(約2n，其中n為擴(kuò)擴(kuò)增循環(huán)的次次數(shù)）。3、基本前提提：要有一段已知知目的基因的的核苷酸序列列，以便根據(jù)據(jù)這一序列合合成引物。4、過程：（1）加熱至至90℃~95℃，使雙鏈DNA模板兩條條鏈之間的氫鍵打開開，變成單鏈鏈DNA，作作為互補(bǔ)鏈聚聚合反應(yīng)的模板板。(DNA變性性）（2）將溫度度降至55℃~60℃，使兩種引物分別與模板DNA的的一端互補(bǔ)序序列互補(bǔ)配對。（退火）（3）將溫度度升至70℃~75℃，在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下，使DNA鏈延伸伸。（延伸）是一小段單鏈鏈DNA，作為DNA復(fù)制的起始始點(diǎn)，在核酸酸合成反應(yīng)時(shí)時(shí)，作為每個(gè)個(gè)多核苷酸鏈鏈進(jìn)行延伸的的出發(fā)點(diǎn)而起起作用的多核苷酸鏈.引物：利用PCR技技術(shù)擴(kuò)增目的的基因PCR擴(kuò)增儀儀人工合成目的基因基因較小，核核苷酸序列已已知，可以利利用DNA合合成儀人工合合成.二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的模式圖抗生素抗性基因思考？將生物的所有有DNA直接接導(dǎo)入受體細(xì)細(xì)胞不是更簡簡便嗎？表達(dá)載體的構(gòu)構(gòu)建使目的基基因在受體細(xì)細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并并且以遺傳給給下一代，同時(shí)是目的的基因能夠表表達(dá)和發(fā)揮作作用?；虮磉_(dá)載體組分分目的基因啟動(dòng)子：是一段有特殊殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位位于基因的首首段，它是RNA聚合酶酶識別的結(jié)合部位，有了它才能能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄mRNA。終止子：也是一段有特特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，，位于基因的的末端，使轉(zhuǎn)錄在這里終終止。標(biāo)記基因：是為了鑒定受受體細(xì)胞中是是否含有目的的基因，從而而將含有目的的基因的細(xì)胞胞篩選出來。。①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者者都有標(biāo)記基基因和復(fù)制原點(diǎn)兩兩部分DNA片段。表達(dá)達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加加了目的基因因、啟動(dòng)子、、終止子三部分結(jié)構(gòu).②用到的工具酶酶：既用到限制酶酶切割載體，，又用到DNA連連接酶將目的的基因和載體體拼接，兩種酶作用的化化學(xué)鍵都是磷磷酸二酯鍵.③啟動(dòng)子、終止止子對于目的基因因表達(dá)必不可可少.④目的基因不能能單獨(dú)進(jìn)入受受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式式攜帶進(jìn)去。。注意三、將目的基因?qū)胧荏wA、將目的基因因?qū)肴胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)換法法（最常用）基因槍法花粉管通道法法1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換法農(nóng)桿菌：是一種在土壤壤中生活的微微生物，，能能在自然界感感染雙子葉植物和和裸子植物，而對大多數(shù)數(shù)單子葉植物沒有感染能力力。原理：當(dāng)植物受到損損傷時(shí)，傷口口處的細(xì)胞會會分泌大量的的酚類化合物，吸引龍桿菌菌移向這些細(xì)細(xì)胞，這時(shí)龍龍桿菌的Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA)可轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色色體的DNA上。轉(zhuǎn)化過程2、基因槍法法原理：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，，將包裹在金金屬顆粒表面面的表達(dá)載體體DNA打入入受體細(xì)胞中中，使目的基基因與其整合合并表達(dá)的方方法。應(yīng)用：單子葉植物，但成本較高高3、花粉管通通道法B、將目的基因因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞1、方法：顯微注射法2、步驟：（1）首先將將含有目的基基因的表達(dá)載載體提純。（2）從雌性性體內(nèi)取出受受精卵，采用用顯微注射儀進(jìn)行顯微注射射。（3）再將注射射了目的基因因的受精卵，，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)一一段時(shí)間后，再移植到雌雌性動(dòng)物的輸卵卵管或子宮內(nèi)內(nèi)，使其發(fā)育育稱為具有新現(xiàn)狀的動(dòng)物。C、將目的基因因?qū)胛⑸锛?xì)胞1、受體：由于原核生物具有繁殖快，，多為單細(xì)胞胞，遺傳物質(zhì)質(zhì)相對較少等等特點(diǎn)，因此此。早期的基基因工程操作作都用原核生物作為受體細(xì)胞胞，其中以大腸桿菌應(yīng)用最為廣泛泛。2、導(dǎo)入方法法：（1）首先用Ca2+處理細(xì)胞，使使細(xì)胞處于一一種能吸收周圍環(huán)境中中DNA分子的生理狀狀態(tài)，這種細(xì)細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。（2）將重組組表達(dá)載體DNA分子溶溶于緩沖液與與感受態(tài)細(xì)胞融合，，在一定溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)細(xì)胞吸收DNA分子，，完成轉(zhuǎn)化過過程。四、目的基因因的檢測與鑒定定1、受體細(xì)胞胞的DNA是是否插入了目的基基因。2、目的基基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA。。3、檢測目目的基因是是否翻譯成蛋白白質(zhì)。受體細(xì)胞的的DNA是是否插入了目的的基因1、方法：：DNA分子子雜交技術(shù)術(shù)2、步驟：：（1）將轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因生物物的基因組DNA提取出來。。（2）制備備一個(gè)含有有目的基因因的DNA片段段，在片段上用同位素標(biāo)記記，作為探針。。（3）使探探針與基因因組DNA雜交，如果顯示示出雜交帶，說明目的的基因已經(jīng)經(jīng)插入染色色體DNA中。目的基因是是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA1、方法：：分子雜交技技術(shù)2、步驟：：（1）將轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因生物物的mRNA提取出來。。（2）制備備一個(gè)含有有目的基因因的DNA片段段，在片段上用同位素標(biāo)記記，作為探針。（3）使探針與mDNA雜交，如果顯示出出雜交帶，說明目的基因因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。檢測目的基因因是否翻譯成蛋蛋白質(zhì)1、方法：抗原——抗體體分子雜交2、步驟：（1）將轉(zhuǎn)基基因生物的蛋白質(zhì)提取出來。（2）制備一一個(gè)相應(yīng)的抗體，抗體用同位位素標(biāo)記。（3）使使抗體與蛋白質(zhì)雜交，如如果顯示示出雜交帶，說明目目的基因因已經(jīng)形成成蛋白質(zhì)質(zhì)。1、在已已知某小小片段基基因堿基基序列的的情況下下，獲得得該基因因的最佳佳方法是是A．用mRNA為模模板逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄合成成DNAB．以4種脫脫氧核苷苷酸為原原料人工工合成C．將供體DNA片片段轉(zhuǎn)入入受體細(xì)細(xì)胞中，，再進(jìn)一一步篩選選D．由蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的氨氨基基酸酸序序列列推推測測mRNA答案案：：B2、、下下列列高高科科技技成成果果中中，，根根據(jù)據(jù)基基因因重重組組原原理理進(jìn)進(jìn)行行的的是是（（））①我我國國科科學(xué)學(xué)家家袁袁隆隆平平利利用用雜雜交交技技術(shù)術(shù)培培育育出出超超級級水水稻稻②我國科學(xué)家家將蘇云金桿桿菌的某些基基因移植到棉棉花內(nèi)，培培育育出抗蟲棉③我國科學(xué)家家通過返回式式衛(wèi)星搭載種種子培育出太太空椒④我國科學(xué)家家通過體細(xì)胞胞克隆技術(shù)培培養(yǎng)出太空牛牛A．①B．①①②C．①②②③D．②③③④答案：B3、鐮刀型細(xì)細(xì)胞貧血癥的的病因是血紅紅蛋白基因的的堿基序列發(fā)發(fā)生了改變。。檢測這種堿堿基序列改變變必須使用的的酶是（（））A．解旋酶B．DNA連連接酶C．限制性內(nèi)內(nèi)切酶D．RNA聚合酶解析：檢測這這種堿基序列列改變需將被被測基因從DNA上切下下來進(jìn)行擴(kuò)增增，該過程需需要限制性內(nèi)內(nèi)切酶。在擴(kuò)擴(kuò)增后，通過過熱變性即可可使待測基因因解旋成單鏈鏈，與已知堿堿基序列的貧貧血病基因制制成的DNA探針進(jìn)行分分子雜交，根根據(jù)形成雙鏈鏈的情況即可可測知其堿基基序列，此過過程無需解旋旋酶，更不需需要形成重組組DNA分子子所需的DNA連接酶和和基因轉(zhuǎn)錄所所需的RNA聚合酶。據(jù)據(jù)以上分析可可知，必須使使用的酶是C、限制性內(nèi)內(nèi)切酶。答案：C4、下列關(guān)于于基因工程的的敘述，正確確的是（））A．基因工程程經(jīng)常以抗菌菌素抗性基因因?yàn)槟康幕蛞駼．細(xì)菌質(zhì)粒粒是基因工程程常用的運(yùn)載載體C．為培育成成抗除草劑的的作物新品種種，導(dǎo)入抗除除草劑基因時(shí)時(shí)只能以受精精卵為受體D．通常用一一種限制性內(nèi)內(nèi)切酶處理含含目的基因的的DNA,用另一種種處理運(yùn)載體體DNA解析：基基因工程程經(jīng)常以以抗菌素素抗性基基因?yàn)闃?biāo)標(biāo)記基因因；質(zhì)粒粒是基因因工程常常用的運(yùn)運(yùn)載體；；通常用用同一種種限制酶酶切割目目的基因因和運(yùn)載載體，以以獲得相相同的黏黏性末端端；受體體細(xì)胞可可以是受受精卵，，也可以以是體細(xì)細(xì)胞。答案：B5、利用用外源基基因在受受體細(xì)胞胞中表達(dá)達(dá)，可生生產(chǎn)人類類所需要要的產(chǎn)品品。下列列各項(xiàng)中中能說明明目的基基因完成成了在受受體細(xì)胞胞中表達(dá)達(dá)的是A．棉花花二倍體體細(xì)胞中中檢測到到細(xì)菌的的抗蟲基基因B．大腸腸桿菌中中檢測到到人胰島島素基因因及其mRNAC．山羊羊乳腺細(xì)細(xì)胞中檢檢測到人人生長激激素DNA序列列D．酵母母菌細(xì)胞胞中提取取到人干干擾素蛋蛋白答案：D9、靜夜四四無鄰，，荒居舊舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黃黃葉樹，，燈下白白頭人。。。06:00:1706:00:1706:0012/23/20226:00:17AM11、以我我獨(dú)沈沈久，，愧君君相見見頻。。。12月月-2206:00:1706:00Dec-2223-Dec-2212、故人人江海海別，，幾度度隔山山川。。。06:00:1706:00:1706:00Friday,December23,202213、乍見見翻疑疑夢，，相悲悲各問問年。。。12月月-2212月月-2206:00:1706:00:17December23,202214、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國國見青山。。。23十二二月20226:00:17上上午06:00:1712月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。十二二月月226:00上上午午12月月-2206:00December23,202216、行動(dòng)出出成果，，工作出出財(cái)富。。。2022/12/236:00:1706:00:1723December202217、做前，能夠夠環(huán)視四周；；做時(shí)，你只只能或者最好好沿著以腳為為起點(diǎn)的射線線向前。。6:00:17上午6:00上上午06:00:1712月-229、沒有失敗，，只有暫時(shí)停停止成功！。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、很多事情努努力了未必有有結(jié)果，但是是不努力卻什什么改變也沒沒有。。06:00:1706:00:1706:0012/23/20226:00:17AM11、成功就是是日復(fù)一日日那一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小努力力的積累。。。12月-2206:00:1706:00Dec-2223-Dec-2212、世間成事，，不求其絕對對圓滿，留一一份不足，可可得無限完美美。。06:00:1706:00:1706:00Friday,December23,202213、不知香積積寺，數(shù)里里入云峰。。。12月-2212月-2206:00:1806:00:18December23,202214、意志堅(jiān)強(qiáng)強(qiáng)的人能把把世界放在在手中像泥泥塊一樣任任意揉捏。。23十二二月20226:00:18上上午06:00:1812月-2215、楚塞三三湘接，，荊門九九派通。。。。十二月226:00上午午12月-2206:00December23,202216、少年年十五五二十十時(shí)，，步行行奪得得胡馬馬騎。。。2022/12/236:00:1806:00:1823December202217、空山山新雨雨后，，天氣氣晚來來秋。。。6:00:18上上午6:00上上午午06:00:1812月月-229、楊柳柳散和和風(fēng)，，青山山澹吾吾慮。。。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、閱讀一切切好書如同同和過去最最杰出的人人談話。06:00:1806:00:1806:0012/23/2022