藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)和過程控制課件

藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制藥品因素環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢查破壞試驗(yàn)方法驗(yàn)證過程控制1中國藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制藥品因素方法驗(yàn)證過程控制1中國藥無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷2中國藥品生物制品檢定所無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢微生物檢查的過程控制一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施（硬件——物質(zhì)保障）二、檢驗(yàn)程序（軟件——有效的結(jié)果）三、結(jié)果判斷（調(diào)查——可靠的結(jié)論）3中國藥品生物制品檢定所微生物檢查的過程控制一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施（硬件——物質(zhì)保障）3中國藥一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)操作環(huán)境關(guān)鍵設(shè)備對照培養(yǎng)基物質(zhì)保障4中國藥品生物制品檢定所一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)物質(zhì)保障4中國藥品生物制品檢定所（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)潔凈實(shí)驗(yàn)條件有效性：整體10000級、局部100級。安全性：保護(hù)樣品、人員和環(huán)境。可操作性：方便、快捷、順暢。潔凈實(shí)驗(yàn)條件的維護(hù)、驗(yàn)證陽性菌實(shí)驗(yàn)室達(dá)到P2生物安全標(biāo)準(zhǔn)5中國藥品生物制品檢定所（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)潔凈實(shí)驗(yàn)條件5中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)室改造示例：原布局圖

擬定布局圖

建議布局圖1

建議布局圖2

實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)——中檢所微生物實(shí)驗(yàn)室6中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)室改造示例：原布局圖

（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的管理與維護(hù)：1、屏障系統(tǒng)的有效性壓差、風(fēng)速、微粒、照度（外包服務(wù)合同）2、清潔、靜態(tài)與動(dòng)態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫酒精棉球分離微生物新潔爾滅分離微生物7中國藥品生物制品檢定所（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的管理與維護(hù)：7中國藥品生物制品環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：頭狀葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）8中國藥品生物制品檢定所環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：8中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺9中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境1、隔離器9中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點(diǎn)評隔離器？驗(yàn)證困難，滅菌不徹底：假陽性滅菌劑殘留：假陰性生物安全柜？動(dòng)態(tài)驗(yàn)證困難，不適合多任務(wù)的檢驗(yàn)活動(dòng)超凈工作臺經(jīng)典、廉價(jià)、適合多任務(wù)的檢驗(yàn)活動(dòng)。提高實(shí)驗(yàn)室新風(fēng)供給、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控可以揚(yáng)長避短10中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點(diǎn)評隔離器？驗(yàn)證搽拭實(shí)驗(yàn)菌株菌液計(jì)數(shù)回收計(jì)數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7%金黃色葡萄球菌646093.8%菌液稀釋、分液的誤差為：5.5%表面搽拭操作的回收率大于99%11中國藥品生物制品檢定所搽拭實(shí)驗(yàn)菌株菌液計(jì)數(shù)回收計(jì)數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7（三）、關(guān)鍵設(shè)備微生物檢查薄膜過濾儀一次性薄膜過濾培養(yǎng)器應(yīng)急檢驗(yàn)用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器12中國藥品生物制品檢定所（三）、關(guān)鍵設(shè)備微生物檢查薄膜過濾儀12中國藥品生物制品檢（四）、對照培養(yǎng)基培養(yǎng)基適用性（靈敏度）；培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標(biāo)準(zhǔn)化）。對照培養(yǎng)基理化評價(jià)（可控性）生物學(xué)評價(jià)（有效性）回收率比較MPN比較生長曲線比較生態(tài)評價(jià)某些CRS原則固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法13中國藥品生物制品檢定所（四）、對照培養(yǎng)基培養(yǎng)基適用性（靈敏度）；對照培養(yǎng)基理化評二、檢驗(yàn)程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷14中國藥品生物制品檢定所二、檢驗(yàn)程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法二、檢驗(yàn)程序接受任務(wù)實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備樣品核對實(shí)驗(yàn)操作過程監(jiān)控培養(yǎng)觀察有效的結(jié)果物質(zhì)保障15中國藥品生物制品檢定所二、檢驗(yàn)程序接受任務(wù)有效的結(jié)果物質(zhì)保障15中國藥品生物實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系編寫說明及批準(zhǔn)頁1實(shí)驗(yàn)室概況1.1實(shí)驗(yàn)室簡介1.2實(shí)驗(yàn)室通訊資料1.3實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可項(xiàng)目/參數(shù)表1.4實(shí)驗(yàn)室平面圖及功能區(qū)域1.5儀器設(shè)備總覽1.6常備試劑耗材一覽表1.7實(shí)驗(yàn)室發(fā)展目標(biāo)2管理規(guī)范2.1安全管理2.2業(yè)務(wù)流程2.3人員管理（6個(gè)SOP）2.4樣品管理（3個(gè)SOP）3標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程3.1檢驗(yàn)工作SOP（13個(gè)）3.2儀器操作SOP（30個(gè)）3.3實(shí)驗(yàn)記錄SOP（9個(gè)）4實(shí)驗(yàn)室保障4.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、設(shè)備及消耗品供應(yīng)商確定原則4.2實(shí)驗(yàn)室設(shè)施服務(wù)商4.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備供應(yīng)商4.4實(shí)驗(yàn)室消耗品供應(yīng)商16中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系（一）、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備應(yīng)堅(jiān)持“平戰(zhàn)結(jié)合”，物質(zhì)準(zhǔn)備有備無患，應(yīng)隨時(shí)保證“來之能戰(zhàn)”。尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實(shí)驗(yàn)器材等。17中國藥品生物制品檢定所（一）、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備應(yīng)堅(jiān)持“平戰(zhàn)結(jié)合”，物質(zhì)準(zhǔn)備有備無患實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——無菌室專用酒精棉球制備

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——場地清潔

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——臺面清潔

18中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——無菌室專用酒精棉球制備

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——場地清潔

實(shí)（二）、樣品核對盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安全性、有效性；仔細(xì)核對樣品及樣品資料，高度關(guān)注媒體公布樣品（問題樣品），同時(shí)盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)、比較分析；樣品外觀檢查、完整性檢查。19中國藥品生物制品檢定所（二）、樣品核對盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安樣品外觀檢查——欣弗

樣品外觀檢查——刺五加

樣品外觀檢查——雙黃連

樣品完整性真空檢漏

20中國藥品生物制品檢定所樣品外觀檢查——欣弗

樣品外觀檢查——刺五加

樣品外觀檢查—（三）、實(shí)驗(yàn)操作不斷完善標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP），嚴(yán)格避免實(shí)驗(yàn)室污染。實(shí)驗(yàn)人員培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)環(huán)境檢驗(yàn)結(jié)果待檢樣品原料輔料設(shè)備環(huán)境藥品（食品）人員藥品食品生產(chǎn)過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)21中國藥品生物制品檢定所（三）、實(shí)驗(yàn)操作不斷完善標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP），嚴(yán)格避免實(shí)實(shí)驗(yàn)操作——物料進(jìn)場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風(fēng)淋、紫外照射）雙層無菌包裝核心區(qū)外圍實(shí)驗(yàn)操作——人員進(jìn)場一更二更核心操作區(qū)實(shí)驗(yàn)操作——無菌操作技術(shù)22中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)操作——物料進(jìn)場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風(fēng)淋、紫外（四）、實(shí)驗(yàn)過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控?zé)o菌檢驗(yàn)框架示意圖23中國藥品生物制品檢定所（四）、實(shí)驗(yàn)過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控?zé)o菌檢驗(yàn)框架示三、結(jié)果判斷長菌與否分離鑒定溯源調(diào)查結(jié)果報(bào)告可靠的結(jié)論有效的結(jié)果物質(zhì)保障24中國藥品生物制品檢定所三、結(jié)果判斷長菌與否可靠的結(jié)論有效的結(jié)果物質(zhì)保障24中三、結(jié)果判斷

是不是微生物？是什么微生物？微生物來自哪里？幾點(diǎn)思考

參見：《FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗(yàn)潔凈室環(huán)境菌的相似性考察》《藥學(xué)學(xué)報(bào)》，2007，42（11）：1189～1194《判斷無菌檢查陽性結(jié)果有效性的實(shí)驗(yàn)探討》《藥物分析雜志》，2008，28（05）：66～71

25中國藥品生物制品檢定所三、結(jié)果判斷是不是微生物？25中國藥品生物制品檢定所1、長菌與否？渾不渾濁?物理變化、化學(xué)變化還是生物變化？一靠經(jīng)驗(yàn)二靠實(shí)驗(yàn)三靠嚴(yán)格程序控制避免干擾26中國藥品生物制品檢定所1、長菌與否？渾不渾濁?一靠經(jīng)驗(yàn)26中國藥品生物制品檢定所是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁物理變化？化學(xué)變化？生物學(xué)變化？（2）、平板上的菌落瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層

菌落or藥渣？27中國藥品生物制品檢定所是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁27中國藥品生物制品檢定菌落or藥渣？經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗(yàn)延長培養(yǎng)時(shí)間到7天重新劃線培養(yǎng)鏡檢28中國藥品生物制品檢定所菌落or藥渣？經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗(yàn)28中國藥品生2、分離鑒定（1）立即轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80℃保存；（3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；（4）如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應(yīng)增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應(yīng)進(jìn)一步鑒定，并逐一保藏。29中國藥品生物制品檢定所2、分離鑒定（1）立即轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD）核酸鑒定（16sRNA、DNA）……30中國藥品生物制品檢定所是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)30中國藥品生物制品檢定所3、溯源調(diào)查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株檢驗(yàn)過程監(jiān)控菌株環(huán)境菌（近期、遠(yuǎn)期）現(xiàn)場調(diào)查收集菌株鑒定與相似性分析相結(jié)合傳統(tǒng)方法與新技術(shù)相結(jié)合不同方法的交叉驗(yàn)證31中國藥品生物制品檢定所3、溯源調(diào)查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株鑒定與相似性分析相結(jié)合傳統(tǒng)微生物來自哪里？

相似性分析同源性分析脈沖場電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR）

32中國藥品生物制品檢定所微生物來自哪里？相似性分析32中國藥品生物制品檢定所SamplePreparationAutomatedmeasurementafterdryingofthesamples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms圖不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關(guān)系33中國藥品生物制品檢定所SamplePreparationAutomatedmTheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellwallcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles...FT-IRspectrumisafingerprintofthecellsBiochemicalStructureofCells34中國藥品生物制品檢定所TheInfraredSpectrumlipidspro35中國藥品生物制品檢定所35中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件

圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢36中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培編號濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）0206G渾濁，劇烈產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）0112G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）0104L顆粒狀懸浮物，振搖能散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）298L；298G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）303L；303G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、陰溝腸桿菌（Enterobacter

cloacae）305L；305G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）306L；306G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）307G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）308L渾濁（Alcaligenesfaecalis）308G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）309L渾濁（Alcaligenesfaecalis）309G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）304G渾濁G-桿菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）37中國藥品生物制品檢定所編號濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcus

capitissspcapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus

cohniissp

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）。監(jiān)測到的環(huán)境菌株38中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staph溯源性分析例2編號BD鑒定走廊1B.pumilus走廊2M.luteus走廊3/無菌室4C.urealyticum無菌室5K.kristinae無菌室6C.urealyticumC1524-FS.capraeC1524-BS.capraeC1525-B1-1S.warneriC1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidisC1526-F2S.haemolyticus菌株16sRNA鑒定可信度C1524-FS.haemolyticus99%C1524-BS.haemolyticus98%C1526-F2S.haemolyticus100%雙黃連注射液利巴韋林注射液FTIR相似性分析DuPontRiboPrinter基因指紋分析39中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例2編號BD鑒定走廊1B.pumilus走廊2M幾點(diǎn)思考（1）、怎樣才算是同一株菌？

需要深入認(rèn)識微生物本身微生物變異與保守的相對性；分析方法的可變性與微生物本身的可變性；生物學(xué)先鋒琳恩·馬古利斯(LynnMargulis)曾表示：“如果將一個(gè)特殊的質(zhì)粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會突然間變成克雷伯氏桿菌”。40中國藥品生物制品檢定所幾點(diǎn)思考（1）、怎樣才算是同一株菌？40中國藥品生物制品檢定幾點(diǎn)思考（2）、什么是最適宜的技術(shù)？

需要深入認(rèn)識分析微生物的技術(shù)和手段形態(tài)學(xué)分析與相似性分析（生化反應(yīng)譜、片段相似性、FTIR光譜相似性等），在權(quán)衡方法本身的邊界和微生物變異性邊界的基礎(chǔ)上，似乎更適合對親緣關(guān)系下一個(gè)否定的結(jié)論，即排除法，在這個(gè)意義上是否可以引入化學(xué)分析的3δ概念、精密度概念？

41中國藥品生物制品檢定所幾點(diǎn)思考（2）、什么是最適宜的技術(shù)？41中國藥品生物制品檢定4、幾點(diǎn)思考（2）、什么是最適宜的技術(shù)？16sRNAcDNA序列，需要研究，太保守不利于區(qū)分；變異率太高（高到普通傳代、培養(yǎng)難以控制）則沒有意義。但一般來說16sRNAcDNA序列水平具有確定意義，困難在于確定足夠長。溯源分析不僅僅是鑒定到種，而是到株，對菌株的穩(wěn)定性認(rèn)識？與之相關(guān)的技術(shù)粗放性問題。

42中國藥品生物制品檢定所4、幾點(diǎn)思考（2）、什么是最適宜的技術(shù)？42中國藥品生物制品4、幾點(diǎn)思考（3）、怎樣下結(jié)論？

分析的根本目的是要下一個(gè)結(jié)論

以檢驗(yàn)活動(dòng)為中心、以檢驗(yàn)過程為線索、以實(shí)驗(yàn)事實(shí)為依據(jù)，根據(jù)所有信息的綜合分析能力。對陽性檢出菌的技術(shù)分析最終要回到檢驗(yàn)活動(dòng)本身，技術(shù)分析結(jié)論

43中國藥品生物制品檢定所4、幾點(diǎn)思考（3）、怎樣下結(jié)論？43中國藥品生物制品檢定所4、結(jié)果報(bào)告綜合分析慎下不合格結(jié)論不放過任何一個(gè)陽性信息44中國藥品生物制品檢定所4、結(jié)果報(bào)告綜合分析44中國藥品生物制品檢定所無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷45中國藥品生物制品檢定所無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化驗(yàn)證試驗(yàn)的系統(tǒng)化制定標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)化完備的實(shí)驗(yàn)室保障系統(tǒng)最終目標(biāo)：一次檢驗(yàn)即可得到準(zhǔn)確結(jié)果。46中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化46中國藥品生物制品檢定所謝謝大家！47中國藥品生物制品檢定所謝謝大家！47中國藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制藥品因素環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢查破壞試驗(yàn)方法驗(yàn)證過程控制48中國藥品生物制品檢定所藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制藥品因素方法驗(yàn)證過程控制1中國藥無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷49中國藥品生物制品檢定所無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢微生物檢查的過程控制一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施（硬件——物質(zhì)保障）二、檢驗(yàn)程序（軟件——有效的結(jié)果）三、結(jié)果判斷（調(diào)查——可靠的結(jié)論）50中國藥品生物制品檢定所微生物檢查的過程控制一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施（硬件——物質(zhì)保障）3中國藥一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)操作環(huán)境關(guān)鍵設(shè)備對照培養(yǎng)基物質(zhì)保障51中國藥品生物制品檢定所一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)物質(zhì)保障4中國藥品生物制品檢定所（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)潔凈實(shí)驗(yàn)條件有效性：整體10000級、局部100級。安全性：保護(hù)樣品、人員和環(huán)境?？刹僮餍裕悍奖?、快捷、順暢。潔凈實(shí)驗(yàn)條件的維護(hù)、驗(yàn)證陽性菌實(shí)驗(yàn)室達(dá)到P2生物安全標(biāo)準(zhǔn)52中國藥品生物制品檢定所（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)潔凈實(shí)驗(yàn)條件5中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)室改造示例：原布局圖

擬定布局圖

建議布局圖1

建議布局圖2

實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)——中檢所微生物實(shí)驗(yàn)室53中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)室改造示例：原布局圖

（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的管理與維護(hù)：1、屏障系統(tǒng)的有效性壓差、風(fēng)速、微粒、照度（外包服務(wù)合同）2、清潔、靜態(tài)與動(dòng)態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫酒精棉球分離微生物新潔爾滅分離微生物54中國藥品生物制品檢定所（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的管理與維護(hù)：7中國藥品生物制品環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：頭狀葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）55中國藥品生物制品檢定所環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：8中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺56中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境1、隔離器9中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點(diǎn)評隔離器？驗(yàn)證困難，滅菌不徹底：假陽性滅菌劑殘留：假陰性生物安全柜？動(dòng)態(tài)驗(yàn)證困難，不適合多任務(wù)的檢驗(yàn)活動(dòng)超凈工作臺經(jīng)典、廉價(jià)、適合多任務(wù)的檢驗(yàn)活動(dòng)。提高實(shí)驗(yàn)室新風(fēng)供給、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控可以揚(yáng)長避短57中國藥品生物制品檢定所（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員安全環(huán)境要求點(diǎn)評隔離器？驗(yàn)證搽拭實(shí)驗(yàn)菌株菌液計(jì)數(shù)回收計(jì)數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7%金黃色葡萄球菌646093.8%菌液稀釋、分液的誤差為：5.5%表面搽拭操作的回收率大于99%58中國藥品生物制品檢定所搽拭實(shí)驗(yàn)菌株菌液計(jì)數(shù)回收計(jì)數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7（三）、關(guān)鍵設(shè)備微生物檢查薄膜過濾儀一次性薄膜過濾培養(yǎng)器應(yīng)急檢驗(yàn)用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器59中國藥品生物制品檢定所（三）、關(guān)鍵設(shè)備微生物檢查薄膜過濾儀12中國藥品生物制品檢（四）、對照培養(yǎng)基培養(yǎng)基適用性（靈敏度）；培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標(biāo)準(zhǔn)化）。對照培養(yǎng)基理化評價(jià)（可控性）生物學(xué)評價(jià)（有效性）回收率比較MPN比較生長曲線比較生態(tài)評價(jià)某些CRS原則固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法60中國藥品生物制品檢定所（四）、對照培養(yǎng)基培養(yǎng)基適用性（靈敏度）；對照培養(yǎng)基理化評二、檢驗(yàn)程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷61中國藥品生物制品檢定所二、檢驗(yàn)程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法二、檢驗(yàn)程序接受任務(wù)實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備樣品核對實(shí)驗(yàn)操作過程監(jiān)控培養(yǎng)觀察有效的結(jié)果物質(zhì)保障62中國藥品生物制品檢定所二、檢驗(yàn)程序接受任務(wù)有效的結(jié)果物質(zhì)保障15中國藥品生物實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系編寫說明及批準(zhǔn)頁1實(shí)驗(yàn)室概況1.1實(shí)驗(yàn)室簡介1.2實(shí)驗(yàn)室通訊資料1.3實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可項(xiàng)目/參數(shù)表1.4實(shí)驗(yàn)室平面圖及功能區(qū)域1.5儀器設(shè)備總覽1.6常備試劑耗材一覽表1.7實(shí)驗(yàn)室發(fā)展目標(biāo)2管理規(guī)范2.1安全管理2.2業(yè)務(wù)流程2.3人員管理（6個(gè)SOP）2.4樣品管理（3個(gè)SOP）3標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程3.1檢驗(yàn)工作SOP（13個(gè)）3.2儀器操作SOP（30個(gè)）3.3實(shí)驗(yàn)記錄SOP（9個(gè)）4實(shí)驗(yàn)室保障4.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、設(shè)備及消耗品供應(yīng)商確定原則4.2實(shí)驗(yàn)室設(shè)施服務(wù)商4.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備供應(yīng)商4.4實(shí)驗(yàn)室消耗品供應(yīng)商63中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系（一）、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備應(yīng)堅(jiān)持“平戰(zhàn)結(jié)合”，物質(zhì)準(zhǔn)備有備無患，應(yīng)隨時(shí)保證“來之能戰(zhàn)”。尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實(shí)驗(yàn)器材等。64中國藥品生物制品檢定所（一）、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備應(yīng)堅(jiān)持“平戰(zhàn)結(jié)合”，物質(zhì)準(zhǔn)備有備無患實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——無菌室專用酒精棉球制備

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——場地清潔

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——臺面清潔

65中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——無菌室專用酒精棉球制備

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備——場地清潔

實(shí)（二）、樣品核對盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安全性、有效性；仔細(xì)核對樣品及樣品資料，高度關(guān)注媒體公布樣品（問題樣品），同時(shí)盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)、比較分析；樣品外觀檢查、完整性檢查。66中國藥品生物制品檢定所（二）、樣品核對盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安樣品外觀檢查——欣弗

樣品外觀檢查——刺五加

樣品外觀檢查——雙黃連

樣品完整性真空檢漏

67中國藥品生物制品檢定所樣品外觀檢查——欣弗

樣品外觀檢查——刺五加

樣品外觀檢查—（三）、實(shí)驗(yàn)操作不斷完善標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP），嚴(yán)格避免實(shí)驗(yàn)室污染。實(shí)驗(yàn)人員培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)環(huán)境檢驗(yàn)結(jié)果待檢樣品原料輔料設(shè)備環(huán)境藥品（食品）人員藥品食品生產(chǎn)過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)68中國藥品生物制品檢定所（三）、實(shí)驗(yàn)操作不斷完善標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP），嚴(yán)格避免實(shí)實(shí)驗(yàn)操作——物料進(jìn)場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風(fēng)淋、紫外照射）雙層無菌包裝核心區(qū)外圍實(shí)驗(yàn)操作——人員進(jìn)場一更二更核心操作區(qū)實(shí)驗(yàn)操作——無菌操作技術(shù)69中國藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)操作——物料進(jìn)場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風(fēng)淋、紫外（四）、實(shí)驗(yàn)過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控?zé)o菌檢驗(yàn)框架示意圖70中國藥品生物制品檢定所（四）、實(shí)驗(yàn)過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控?zé)o菌檢驗(yàn)框架示三、結(jié)果判斷長菌與否分離鑒定溯源調(diào)查結(jié)果報(bào)告可靠的結(jié)論有效的結(jié)果物質(zhì)保障71中國藥品生物制品檢定所三、結(jié)果判斷長菌與否可靠的結(jié)論有效的結(jié)果物質(zhì)保障24中三、結(jié)果判斷

是不是微生物？是什么微生物？微生物來自哪里？幾點(diǎn)思考

參見：《FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗(yàn)潔凈室環(huán)境菌的相似性考察》《藥學(xué)學(xué)報(bào)》，2007，42（11）：1189～1194《判斷無菌檢查陽性結(jié)果有效性的實(shí)驗(yàn)探討》《藥物分析雜志》，2008，28（05）：66～71

72中國藥品生物制品檢定所三、結(jié)果判斷是不是微生物？25中國藥品生物制品檢定所1、長菌與否？渾不渾濁?物理變化、化學(xué)變化還是生物變化？一靠經(jīng)驗(yàn)二靠實(shí)驗(yàn)三靠嚴(yán)格程序控制避免干擾73中國藥品生物制品檢定所1、長菌與否？渾不渾濁?一靠經(jīng)驗(yàn)26中國藥品生物制品檢定所是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁物理變化？化學(xué)變化？生物學(xué)變化？（2）、平板上的菌落瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層

菌落or藥渣？74中國藥品生物制品檢定所是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁27中國藥品生物制品檢定菌落or藥渣？經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗(yàn)延長培養(yǎng)時(shí)間到7天重新劃線培養(yǎng)鏡檢75中國藥品生物制品檢定所菌落or藥渣？經(jīng)60Coγ射線大劑量照射再檢驗(yàn)28中國藥品生2、分離鑒定（1）立即轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80℃保存；（3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；（4）如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應(yīng)增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應(yīng)進(jìn)一步鑒定，并逐一保藏。76中國藥品生物制品檢定所2、分離鑒定（1）立即轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD）核酸鑒定（16sRNA、DNA）……77中國藥品生物制品檢定所是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)30中國藥品生物制品檢定所3、溯源調(diào)查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株檢驗(yàn)過程監(jiān)控菌株環(huán)境菌（近期、遠(yuǎn)期）現(xiàn)場調(diào)查收集菌株鑒定與相似性分析相結(jié)合傳統(tǒng)方法與新技術(shù)相結(jié)合不同方法的交叉驗(yàn)證78中國藥品生物制品檢定所3、溯源調(diào)查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株鑒定與相似性分析相結(jié)合傳統(tǒng)微生物來自哪里？

相似性分析同源性分析脈沖場電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR）

79中國藥品生物制品檢定所微生物來自哪里？相似性分析32中國藥品生物制品檢定所SamplePreparationAutomatedmeasurementafterdryingofthesamples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms圖不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關(guān)系80中國藥品生物制品檢定所SamplePreparationAutomatedmTheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellwallcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles...FT-IRspectrumisafingerprintofthecellsBiochemicalStructureofCells81中國藥品生物制品檢定所TheInfraredSpectrumlipidspro82中國藥品生物制品檢定所35中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件

圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢83中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件圖29欣弗培養(yǎng)物圖30欣弗培編號濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）0206G渾濁，劇烈產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）0112G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）0104L顆粒狀懸浮物，振搖能散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）298L；298G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）303L；303G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、陰溝腸桿菌（Enterobacter

cloacae）305L；305G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratiamarcescens）306L；306G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）307G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）308L渾濁（Alcaligenesfaecalis）308G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）309L渾濁（Alcaligenesfaecalis）309G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）304G渾濁G-桿菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）84中國藥品生物制品檢定所編號濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcus

capitissspcapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus

cohniissp

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）。監(jiān)測到的環(huán)境菌株85中國藥品生物制品檢定所溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staph溯源性分析例2編號BD鑒定走廊1B.pumilu