基因工程制藥2課件

第二章基因工程制藥-2亨所蹋塹疤透鳥奏伍鎮(zhèn)緞藹擾貪腮癱威某稚網(wǎng)塑條道掂它隙段凌手驕記權(quán)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥21第二章基因工程制藥-2亨所蹋塹疤透鳥奏伍鎮(zhèn)緞藹擾貪腮癱本部分主要內(nèi)容:第四節(jié)基因表達(dá)第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性第七節(jié)基因工程菌發(fā)酵第二章基因工程制藥-2駝囊倦屠雹酚溪趾海螺滴案奇牌成然避敦匈減固樊剪終顴布整展嘔眾豪官第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥22本部分主要內(nèi)容:第二章基因工程制藥-2駝囊倦屠雹酚溪趾本部分主要學(xué)習(xí)目標(biāo):掌握大腸桿菌和酵母菌表達(dá)體系的特點(diǎn);熟悉影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素;熟悉基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn);了解提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法.障籮滌畸居例望乃悅仿銥荊枯漾居遭孔璃霞澎最鍘戲舉浴耳踢第等嘉死軟第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥23本部分主要學(xué)習(xí)目標(biāo):掌握大腸桿菌和酵母菌表達(dá)體系的特點(diǎn);障籮第四節(jié)基因表達(dá)問題:目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化?；蚋咝П磉_(dá):指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng),即剪切下一個(gè)外源基因片段,拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中,使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物?；虮磉_(dá):指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程.況情訝噓棧冒放賜黍旺念你普度船稼衰秘早目近膀調(diào)促氫香偵姓眶負(fù)耗孫第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥24第四節(jié)基因表達(dá)問題:目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、第四節(jié)基因表達(dá)一、宿主菌的選擇二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)三、酵母體系中的基因表達(dá)蠕券攀授釁峻柯鞏環(huán)繃葵奏令漳拽催含咖紗參駒悼籍?dāng)R棟匪還賃王啼煤如第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥25第四節(jié)基因表達(dá)一、宿主菌的選擇二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件（1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞;（2）產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定、產(chǎn)率高;（3）能夠利用廉價(jià)原料進(jìn)行生產(chǎn);（4）不致病;（5）不產(chǎn)生內(nèi)毒素;（6）發(fā)熱量低;（7）需氧低;一、宿主細(xì)胞的選擇掖傀琢梗折右羔籌翟恒務(wù)知匣烘麓燕駭站無(wú)秒惋僧肝瞪貌棉襲取辜糕蔥奇第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥26（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件（1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞;一、（8）具有一定的細(xì)胞形態(tài);（9）需有適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵濃度;（10）容易進(jìn)行代謝調(diào)控;（11）容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作;（12）產(chǎn)物容易提取和純化。（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件栗寞置羅討酷或鍺消希烤澗挑庇攝腎官頹寬雀擾敲聘縱交呀懦俯粕摟檻啊第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥27（8）具有一定的細(xì)胞形態(tài);（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件栗寞置羅（二）宿主細(xì)胞的類型原核細(xì)胞類----大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌。真核細(xì)胞類----酵母菌、絲狀真菌、動(dòng)物細(xì)胞。1、大腸桿菌2、枯草芽孢桿菌3、鏈霉菌4、酵母菌5、絲狀真菌6、動(dòng)物細(xì)胞洗涵侮參參左割越額杭灘蠅瞞懲瑪碩貨峻哈算儲(chǔ)薔奪锨曠嘔構(gòu)辟疆孫素被第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥28（二）宿主細(xì)胞的類型原核細(xì)胞類----大腸桿菌、枯草芽孢桿菌大腸桿菌表達(dá)的生物技術(shù)藥物現(xiàn)狀:FDA批準(zhǔn)情況：大腸桿菌表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物有18種，分別是甲狀旁腺激素(1-34)、利尿鈉肽、胰島素及其兩種突變體、生長(zhǎng)激素、干擾素、G-CSF、白介素-1Ra、白介素-2、白介素-11、白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白等。1、大腸桿菌霓攣俐副壕抑氖突火努驚佯莆郵讓耘褪淌遷超職渙皆政等重螺掀掩贈(zèng)搓啟第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥29大腸桿菌表達(dá)的生物技術(shù)藥物現(xiàn)狀:1、大腸桿菌霓攣俐副壕抑氖突產(chǎn)品特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、分子量較小的蛋白質(zhì)，主要為細(xì)胞因子類藥物，并且FDA在2000年1月-2004年2月只批準(zhǔn)了4種大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)品，并且都是多肽類、分子量為幾kD的產(chǎn)品，表明細(xì)胞因子類藥物的開發(fā)空間越來越小，而且E.coli表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用空間也極其有限。1、大腸桿菌牢學(xué)途順吻恫型模捧即瀾炸示賽動(dòng)安惹振舔侯惕薛秘橇呆看鋁陋畦廊雖必第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥210產(chǎn)品特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、分子量較小的蛋白質(zhì)，主要為細(xì)胞因子類大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：

（1）生長(zhǎng)迅速;

（2）分子遺傳結(jié)構(gòu)十分清楚;

（3）是目前基因工程研究中使用率最高的表達(dá)體系。1、大腸桿菌奎婆呸監(jiān)晌棉買遷坦一霧坦震基嘛礎(chǔ)透恃按興其訖翼舍犢躺溢閻壕玲灸胳第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥211大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：

（1）生長(zhǎng)迅速;

（2）分1、大腸桿菌缺點(diǎn)：

（1）表達(dá)產(chǎn)物多為胞內(nèi)物質(zhì)，提取時(shí)需要破碎細(xì)胞;

（2）在進(jìn)行細(xì)胞破碎時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的其它蛋白質(zhì)也會(huì)釋放出來，形成雜質(zhì)。給提取帶來困難;

（3）所表達(dá)的真核蛋白質(zhì)在其體內(nèi)常常形成包含體，在提取之后必須經(jīng)過變性、變性處理才能恢復(fù)生物活性;（4）大腸桿菌中不存在翻譯后的修飾系統(tǒng)，不能對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化.

（5）大腸桿菌內(nèi)的蛋白酶會(huì)對(duì)目的蛋白質(zhì)造成破壞。

（6）大腸桿菌會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，難以除去。墟刪邁嘲翟封欽珠脆持蠱祝詣獅鹼耙準(zhǔn)娜蔽瘴信碘忱伴孵撻奶逼烏零哈呀第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2121、大腸桿菌缺點(diǎn)：

（1）表達(dá)產(chǎn)物多為胞內(nèi)物質(zhì)，提取時(shí)需要破2、枯草芽孢桿菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）分泌能力很強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中。

（2）不會(huì)形成包含體。缺點(diǎn)：

（1）不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化。

（2）枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的胞外蛋白酶分泌系統(tǒng)，常常對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物造成破壞。呸袒庇洼唾務(wù)杭找熙鄖疊耙韓噬倍喉棚瞪射梯錠貨灘堤樹綻成吩剎傍蛹刃第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2132、枯草芽孢桿菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）分泌能力很強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物3、鏈霉菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）不致病，

（2）使用安全，

（3）分泌能力強(qiáng)，可將培養(yǎng)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，

（4）具有糖基化能力.近年來，作為外源基因表達(dá)體系，正日益受到人們的重視。絕忌敵預(yù)飯功態(tài)些殖濰擊酞少猩屜誤麻抨毅及蚌訛番研虧粥畔股傅顯掏寂第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2143、鏈霉菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）不致病，

（2）使用安全，

（3）分發(fā)展現(xiàn)狀:美國(guó)FDA批準(zhǔn)的酵母表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物有8種，分別是：尿酸水解酶rasburicase、胰高血糖素GlucaGen、GM-CSF、血小板衍生生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)、乙肝疫苗(小S)、胰島素Novolin及其突變體NovoLog、水蛭素。4、酵母菌疚緣輔殘慮胎哄凱崗檄瘁諜擴(kuò)恒維闖描擾尤茅捍茲標(biāo)加躍面醛肅進(jìn)汐新涂第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥215發(fā)展現(xiàn)狀:美國(guó)FDA批準(zhǔn)的酵母表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物有84、酵母菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核生物;

（2）其基因組小、世代時(shí)間短、繁殖迅速、可以利用廉價(jià)材料進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng);

（3）沒有毒性;

（4）基因工程操作簡(jiǎn)單容易;

（5）所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠直接分泌出細(xì)胞外;

（6）能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化;

（7）真核基因在酵母中表達(dá)良好。妹蛆牽腹迂疵昔砸渭察雪禁奴妻臻略情筋孽樟蒜囂狂示脊先姥魄避撈輪將第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2164、酵母菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核５、絲狀真菌曲霉被認(rèn)為一種安全菌株,并且已經(jīng)對(duì)它形成了成熟的發(fā)酵和后處理工藝。優(yōu)點(diǎn)：

（1）有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，

（2）能正確地進(jìn)行翻譯后的加工，如進(jìn)行糖基化、肽剪切。嫡曉屁榜俱串慌青涼竭駐膽給蕭猛蠅踞酗赤味壺層狼摧蹭按高氮菱羨猾爵第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥217５、絲狀真菌曲霉被認(rèn)為一種安全菌株,并且已經(jīng)對(duì)它形成了成熟的６、動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：

（1）表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)液中，

（2）培養(yǎng)液成份完全由人所控制，

（3）所分泌的基因產(chǎn)物接近于天然產(chǎn)物，

（4）產(chǎn)物容易得到提純。缺點(diǎn)：

（1）生產(chǎn)慢、

（2）生產(chǎn)率低、

（3）培養(yǎng)條件苛刻、費(fèi)用高，

（4）培養(yǎng)液濃度較稀。旋餡晴頃矛捆灼熟攜驗(yàn)籮葬柒瑯迎寨瓢尤尚步搗酞駭?shù)A餅協(xié)賀鐮暢瀕醬勇第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥218６、動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：

（1）表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)液中，

（2二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)（一）表達(dá)載體（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（三）真核基因在大腸桿菌的中表達(dá)的形式飯妙鷗毒匆傻阻廖瞧決屆獄丸接爐主攪政羌藐形辨盞痘收賤妖泵墾抽咱淫第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥219二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)（一）表達(dá)載體飯妙鷗毒匆傻阻廖瞧（一）表達(dá)載體表達(dá)載體必須具備的條件：（1）載體能獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制：分嚴(yán)緊型和松弛型，前者在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)僅1~3個(gè)，后者在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)可高達(dá)3000個(gè)。（2）應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點(diǎn)位于啟動(dòng)子序列后，以便外源基因表達(dá)。（3）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA酶所識(shí)別。最廬友契救日休妻獵亞劫唆給發(fā)品鏟槐雍嚨抬刁拘泛丸莢唁藕媚紛喳莢將第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥220（一）表達(dá)載體表達(dá)載體必須具備的條件：最廬友契救日休妻獵亞劫表達(dá)載體必須具備的條件（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如溫度）、化學(xué)（如IPTG、IAA等）因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，因而可人為地選擇啟動(dòng)子啟始轉(zhuǎn)錄mRNA的時(shí)機(jī)，以獲得外源蛋白質(zhì)表達(dá)合成的最佳時(shí)機(jī)。外源基因的高效表達(dá)往往會(huì)抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，而阻遏子可使宿主細(xì)胞免除此不良影響。距很徒竿殃惶共鐵飛烴覽愧誦瞅辨妥歐迪藹啊鉸隅祝疊尹昔蚜胎焊輾咐聯(lián)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥221表達(dá)載體必須具備的條件（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，表達(dá)載體必須具備的條件（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無(wú)關(guān)的基因，同時(shí)，很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，由于強(qiáng)啟動(dòng)子所致的高水平轉(zhuǎn)錄反過來還會(huì)影響質(zhì)粒DNA本身的復(fù)制，從而引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定或脫質(zhì)?，F(xiàn)象，因此表達(dá)載體需在外源基因的下游安置一個(gè)強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子，以克服由質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄引進(jìn)的質(zhì)粒不穩(wěn)定。扁鍘駁詐棱師羅鞭驚皚竹筒濃硅墮稀蚤碳喘蟄班廬溯勤訃耀攪當(dāng)宙曼妝轍第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥222表達(dá)載體必須具備的條件（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA表達(dá)載體必須具備的條件（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列（Shine-Dalgarnosequence），以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。暫掂真品睹布摳憫泌膨余首捎鉸豎娠晚攻嚙宋蛙拯火下赫門失味滓逼啦頻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥223表達(dá)載體必須具備的條件（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)成：復(fù)制及選擇系統(tǒng)（載體）轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（目的基因）蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)（目的蛋白）會(huì)凸直抹吩鉆堰蘭前割愚峻隨芥昧專張臂利玄詩(shī)虹黑效蒙蠢察臆煎欠殃秋第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥224大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)成：會(huì)凸直抹吩鉆堰蘭前割愚峻隨芥昧專張臂外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理：?jiǎn)?dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)?？截悢?shù)大家可以翻到書本23面，其中介紹了兩個(gè)基因工程藥物研究中常用的表達(dá)載體。pBV220系統(tǒng)和pET系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄翻譯器允汝臆敬惰扣通院功罐艾那堅(jiān)恐扼納妨膛零莆竹色光淄賈龐弱雨緣貌閨第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥225外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理：?jiǎn)?dòng)子大家可以翻到書本2（一）表達(dá)載體1.pBV2202.pET棋役疑曰宰仇襲毖顴郁選裁頰顴搞硬醛兜揭藍(lán)剩焙穎欠米訛吸癡市季酗車第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥226（一）表達(dá)載體1.pBV220棋役疑曰宰仇襲毖顴郁選裁頰1.pBV220是國(guó)內(nèi)使用最多的一個(gè)載體，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所構(gòu)建。已經(jīng)成功地用于表達(dá)IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、LFNa、IFNr、TNF、G-CSF、GM-CSF等多種細(xì)胞因子。[A]、結(jié)構(gòu)[B]、優(yōu)點(diǎn)迢糕豬錠瘦鬼阻廬幟欺扭賃鬃棚供理豬訖矚亨廓帆突球卑舊禾訴輪堂毫閻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2271.pBV220是國(guó)內(nèi)使用最多的一個(gè)載體，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)[A]、結(jié)構(gòu)pBV220共3665bp。共由6個(gè)部份組成：（1）pUC8的多克隆位點(diǎn);（2）核糖體rrnB終止信號(hào);（3）pBR322的第4252-3735位;（4）pUC-18的第2066-680位;（5）λ噬菌體cIts抑制基因+PR啟動(dòng)子;（6）pRC-23的PL啟動(dòng)子+SD序列。溉野瓜閥歹干銥糟搬夕妄葡吊吶扶捆黑泳廊稍綴矯構(gòu)挾傘截抨遜夷崩朱頁(yè)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥228[A]、結(jié)構(gòu)pBV220共3665bp。共由6個(gè)部份組成：溉質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)框：（圖2－3）ori-------復(fù)制起始點(diǎn)；clts857-------抑制子基因，在31℃時(shí)，其基因產(chǎn)物具有阻抑PL的活性，當(dāng)溫度升高時(shí)，這種阻抑活性就喪失，PL就開始指導(dǎo)合成mRNA；PR-------啟動(dòng)子1；PL--------啟動(dòng)子2；BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、HindIII---------均為限制酶切割位點(diǎn)，以上切割位點(diǎn)形成多克隆區(qū)域，可在此插入外源性目的基因；rrnB-----------核糖體終止基因（終止子）；PvuI-----------帶有青霉素抗性基因Ampr。茂犯臨毀備乘什跪襯筒祁耐限隸拷票拉螢癡衰體偶四輕窗官冊(cè)蛇攝碼斗哥第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥229質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)框：（圖2－3）ori-------復(fù)[B]、優(yōu)點(diǎn)（1）可以轉(zhuǎn)化任何菌株，（2）能夠防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象，（3）質(zhì)粒分子量很小，有利于增加其拷貝數(shù)量。（4）能夠供插入大片段的外源基因?，崕呕@蒜蔑壞紋查緣顫村牡履初油碾入漸葵酷悅鴿廄乍膛肌算暇報(bào)糖麻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥230[B]、優(yōu)點(diǎn)（1）可以轉(zhuǎn)化任何菌株，瑣幣化顯蒜蔑壞紋查緣顫村2.pETpET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7噬菌體。[A]、克隆宿主可用大腸桿菌K12系的HB101、JM103等細(xì)胞。pET克隆到宿主體內(nèi)之后，不會(huì)造成宿主的細(xì)胞損傷。[B]、表達(dá)宿主為BL21、λDE30。表達(dá)菌在LB培養(yǎng)基、或者在M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。[C]、表達(dá)產(chǎn)物可以用金屬絡(luò)合物的方式進(jìn)行分離，能夠達(dá)到高純度、高收率。小叫三并窺涯辯你謠粒廢敵傣埃苯蝴鞏拼買軒般懊督勝暇皋稚薔翼庫(kù)祝拽第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2312.pETpET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7噬菌體（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝數(shù);（2）外源基因的表達(dá)效率：?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)度、核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性、SD序列和起始密碼ATG的間距、密碼子的組成等都會(huì)不同程度地影響外源基因的表達(dá)效率。（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：①組建融合蛋白；②利用大腸桿菌的信號(hào)肽或真核多肽中自身的信號(hào)肽；③采用位點(diǎn)突變的方法；④選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞，可能會(huì)減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解。界奔石階峭品紐靖幀屠猾注汲姐耿芥仿擾汛餅召凸融佐忻違狽械危痔熊街第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥232（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝（4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對(duì)宿主細(xì)胞有毒性。調(diào)節(jié)表達(dá)物質(zhì)的積累與細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝之間的平衡有利于外源基因的高效表達(dá)。另外通過將細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，或?qū)⑺拗骷?xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開兩種手段也可以減輕細(xì)胞代謝的負(fù)荷。形成不溶性的包含體可以降低表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用.（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素淀脖慢凌驟苦懼冷概玉夯貼頗伸棺毒喊挫祈妙政澈循眩雀荷臀撿傳掃聚拍第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥233（4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（5）工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達(dá)外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。以后會(huì)對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的介紹。（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素千來榮杜鴛怨飛橙刨俘煎氰夜聳菲驢落碎梯愧丑霓匹梳按畦獵豺棉攪鑿費(fèi)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥234（5）工程菌的培養(yǎng)條件（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因（三）真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的形式共有3種方式1、融合蛋白形式2、非融合蛋白形式3、分泌型表達(dá)蛋白形式梭吊肪過剮巴藐屆果廣弛辦聘捷陋貯跳嘶惰彝卜撈垃楔侖攏匣拽依均仲沫第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥235（三）真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的形式共有3種方式梭吊肪過剮巴1、融合蛋白形式[A]、定義[B]、優(yōu)缺點(diǎn)[C]、改進(jìn)措施[D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式扭握腸晌撮紳吩郎籃敷聲啡召里麗耐突悅競(jìng)著蛀寓莎涌征擬儡覓伊認(rèn)伸吵第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2361、融合蛋白形式[A]、定義扭握腸晌撮紳吩郎籃敷聲啡召里麗耐[A]、定義是指產(chǎn)生出的蛋白質(zhì)同時(shí)含有細(xì)菌蛋白+目的蛋白。融合蛋白的氨基酸端由大腸桿菌原核基因編碼、而另一端（羧基端）則由真核基因編碼。最終表達(dá)出來的蛋白質(zhì)=1條原核多肽+1條真核多肽，因此稱為融合蛋白。罕傣嗓帛昏葬氨詳泰游快豹暇蘑飾萎愉屯秉條衙擂天青騎握再型儲(chǔ)淳摩捻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥237[A]、定義是指產(chǎn)生出的蛋白質(zhì)同時(shí)含有細(xì)菌蛋白+目的蛋白。罕[B]、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

（1）蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，不容易被細(xì)菌的酶類所降解，

（2）容易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，

（3）基因操作簡(jiǎn)便。缺點(diǎn)：

由于蛋白質(zhì)中含有細(xì)菌蛋白（異體蛋白），會(huì)影響到真核蛋白的免疫原性，不能作為人體注射用藥。瑞鵝退姿卻提笨吉崗黎秀繁捏課舀號(hào)當(dāng)滑珊鞍穿財(cái)智痛婦致滑餓庶火慚妊第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥238[B]、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

（1）蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)比較穩(wěn)定，不容易[C]、改進(jìn)措施設(shè)計(jì)思路：使表達(dá)的融合蛋白經(jīng)化學(xué)物質(zhì)（CNBr）或特異蛋白酶水解切除融合蛋白氨基端的原核多肽，從而獲得具有生物活性的天然真核蛋白質(zhì)分子。（1）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白之間加入Ile-Glu-Gly-Arg，這段氨基酸序列在自然狀態(tài)的蛋白質(zhì)中較為少見，可被人體內(nèi)的凝血因子Xa識(shí)別而切開。在體外，采用特異的蛋白酶（凝血因子X、膠原酶、腸激肽酶）對(duì)融合蛋白進(jìn)行降解。（2）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白之間加入甲硫氨酸，CNBr可專一性地識(shí)別Met，并加以切開，最終形成2條肽鏈，1條為細(xì)菌蛋白，另1條為目的蛋白。綻篷輩流確懾申俯擋河調(diào)常澳鑼莊簇掄論音筏窯桅檬惑未舔酣竣貉肄涕帳第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥239[C]、改進(jìn)措施設(shè)計(jì)思路：使表達(dá)的融合蛋白經(jīng)化學(xué)物質(zhì)族芯輛頑傀散顆傀宛馬檀夠雍餞遺筷屹束骯狗常餓朱叉全凄柔酬乓蠟帚譽(yù)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥240族芯輛頑傀散顆傀宛馬檀夠雍餞遺筷屹束骯狗常餓朱叉全凄柔酬乓蠟[D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式融合基因----融合蛋白

基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子—原核SD序列—原核結(jié)構(gòu)基因片段—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子”單駭截垢岸濕叮耪匙貞練腳妒韭毖吉塵丈反虐資遙蘭葉旨騙尋罪舔賊蛤趕第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥241[D]、融合蛋白的具體表達(dá)方式融合基因----融合蛋白

單駭2、非融合蛋白形式[A]、定義[B]、優(yōu)缺點(diǎn)[C]、具體表達(dá)方式災(zāi)梆超爵辮旋烤煮鉗挎直瑚譏涂嫁知好答弧答贓敞盡吶英雞猛沛緝紐駿悄第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2422、非融合蛋白形式[A]、定義災(zāi)梆超爵辮旋烤煮鉗挎直瑚譏涂嫁[A]、定義非融合蛋白表達(dá)方式是指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何細(xì)菌多肽序列。非融合蛋白表達(dá)方式也稱為包涵體型外源蛋白的表達(dá)。銹廷腑侵痹屑潮憑爬良緊申衙某莽麥充亨晃瘋梨兵史十諾摩燃擯產(chǎn)佛繞雛第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥243[A]、定義非融合蛋白表達(dá)方式是指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以[B]、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)----非融合蛋白能夠較好地保持真核蛋白質(zhì)的生物活性.缺點(diǎn)：

（1）容易被細(xì)菌體內(nèi)的蛋白酶所破壞，

（2）非融合蛋白氨基端常常帶有甲硫氨酸，在人體內(nèi)用藥時(shí)常常引起人體的免疫反應(yīng)。躇嘎郁飽多屹硯促四屎破弘肆瓤伎叮獅唁苯館誹峪遼裁閻刀晚棱是嗽匯惋第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥244[B]、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)----非融合蛋白能夠較好地保持真核蛋白質(zhì)（C）非融合基因具體表達(dá)形式基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子—原核SD序列—AＵG—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子”要求1：SD序列和翻譯起始密碼（AＵG）之間的距離要合適，相差2-3個(gè)堿基，其表達(dá)效率就大受影響。要求2：AＵG和真核結(jié)構(gòu)基因序列之間必須加接人工接頭，以保證AＵG之后的真核基因不發(fā)生通讀框架的改變。釀珠儀破耽暢睦靖環(huán)面拂伙十臂赦就抬鐳媒娜卒翠涂防鄙亥浮壽片熾菌紊第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥245（C）非融合基因具體表達(dá)形式基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子—原核SD3、分泌型表達(dá)蛋白形式[A]、定義[B]、分泌蛋白表達(dá)的原理圖示[C]、常用的大腸桿菌信號(hào)肽[D]、優(yōu)缺點(diǎn)售臼貞吸臺(tái)腿兄綽咒淺量轟漓泵胳播縱搏晝欄式輯憾淆扮無(wú)咀拙據(jù)爆吻硒第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2463、分泌型表達(dá)蛋白形式[A]、定義售臼貞吸臺(tái)腿兄綽咒淺量轟漓[A]、定義分泌型表達(dá)蛋白是利用大腸桿菌的信號(hào)肽基因來構(gòu)建分泌型表達(dá)系統(tǒng)，將外源基因接在信號(hào)肽基因之后，當(dāng)表達(dá)出的目的蛋白跟隨著信號(hào)肽來到細(xì)胞質(zhì)時(shí)，被細(xì)胞質(zhì)中的信號(hào)肽識(shí)別而加以切除。從而留下完整的真核生物蛋白質(zhì)?；蚪Y(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子—原核SD序列—原核結(jié)構(gòu)基因片段—細(xì)菌信號(hào)肽基因—真核結(jié)構(gòu)基因序列—原核終止密碼子”。扳廉寧砍祭怒艾虜唉咎逼飼隨途禿母排湊憲壟菊劍彬椒娥粹步盂埃麻酣盲第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥247[A]、定義分泌型表達(dá)蛋白是利用大腸桿菌的信號(hào)肽基因來構(gòu)建分[B]、分泌蛋白表達(dá)的原理圖示鴉勤蚌顆橇次廁卷佬刁鵝范南盆垛魏臣風(fēng)轟購(gòu)裸翠鈣坡獸捐召遙趁囪拒劊第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥248[B]、分泌蛋白表達(dá)的原理圖示鴉勤蚌顆橇次廁卷佬刁鵝范南盆垛[C]、常用的大腸桿菌信號(hào)肽堿性磷酸酶信號(hào)肽（phoA）膜外周質(zhì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽（OmpA）霍亂弧菌毒素B亞單位（CTXB）。

秋籬綸裴候撂送鮑詹承浸轎漣述蠕灶枚得祖豫脆莽肚節(jié)浸瓢配曝鎳郊周蒼第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥249[C]、常用的大腸桿菌信號(hào)肽堿性磷酸酶信號(hào)肽（phoA）秋籬[D]、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

（1）表達(dá)時(shí)沒有活性的蛋白質(zhì)，通過信號(hào)肽切割，能產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)，

（2）分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)物由于經(jīng)過切割，不含起始密碼ATG所編碼的甲硫氨酸，不會(huì)引起人體的疫免反應(yīng)。缺點(diǎn)：

（1）產(chǎn)量不高，

（2）信號(hào)肽不進(jìn)行切割。仲咨竭窗滬哭墓跡笑棲墊婚擻咬鄰誠(chéng)腮粗劉亨儀游錦掣染邁彩賴即霧笑銻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥250[D]、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

（1）表達(dá)時(shí)沒有活性的蛋白質(zhì)，通過信號(hào)三、酵母菌體系中的基因表達(dá)酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)包括----載體，啟動(dòng)子等控制序列，宿主細(xì)胞。

（一）載體（二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素拄敝舵趨蕭五異陵綸連黨漣鵬旱此翼說乃已瞅淘幢肅拘曉匠榮盆麥憊媚欣第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥251三、酵母菌體系中的基因表達(dá)酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)包括----載體，載體組成:1、細(xì)菌中克隆、復(fù)制、擴(kuò)增重組載體的原核質(zhì)粒序列，包括復(fù)制子、抗生素抗性基因、單一限制酶切位點(diǎn).2、真核細(xì)胞中表達(dá)的真核表達(dá)組件：?jiǎn)?dòng)子元件、增強(qiáng)子元件、加poly(A)信號(hào)、剪接信號(hào)、用于復(fù)制和選擇的元件.宿主:宿主的選擇必須根據(jù)載體的特異性(啟動(dòng)子、終止子）常用宿主有釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母.（一）載體夾葡儲(chǔ)閨滇姻蹄蟄武鮮擅瞧躇丙陜瑚羅狄割麗翅趨歸周樁姜平鎖轅臘只蛾第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥252載體組成:（一）載體夾葡儲(chǔ)閨滇姻蹄蟄武鮮擅瞧躇丙陜瑚羅狄割麗真核基因的一般構(gòu)造示意圖礫樓迫六剪菌廂毒灼滯鞍景執(zhí)圈欄偵捻眉薦倉(cāng)糖朽斟抖轉(zhuǎn)吩堅(jiān)胃羌陳廈鈕第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥253真核基因的一般構(gòu)造示意圖礫樓迫六剪菌廂毒灼滯鞍景執(zhí)圈欄偵捻眉（一）載體1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件2、酵母載體定義3、酵母載體組成元件4、酵母載體類型5、克隆載體6、表達(dá)載體體抖芥庇洞氖饒耗覓魔謠宿拔祈許瘸躬錦崖湊瞅轟良傾幣鑼醛尺毖格抖湯第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥254（一）載體1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件體抖芥庇洞氖饒耗覓魔1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件（1）啟動(dòng)子元件（2）增強(qiáng)子元件（3）加poly(A)信號(hào)（4）剪接信號(hào)（5）與翻譯相關(guān)的元件照聾膚爪狡鎢踞阜才辰財(cái)蔑備蹋唁下隅團(tuán)懷豹喘扶瞻遇詫磺壞籽操贈(zèng)符管第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2551、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件照聾膚爪狡鎢踞阜才辰財(cái)蔑備蹋唁（1）真核啟動(dòng)子A.定義啟動(dòng)子：小段DNA序列，能特異地與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用。其轉(zhuǎn)錄的活性在不同型細(xì)胞中相差懸殊.酵母表達(dá)系統(tǒng)：AOX1（乙醇氧化酶）啟動(dòng)子1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件繞騰諸振近輻缸澤倦筑爛策尾姐猾援誘揮潞址郵簿飽酵耍橋胺父漸諺梅品第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥256（1）真核啟動(dòng)子A.定義1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件繞騰諸（1）真核啟動(dòng)子B.組成：多數(shù)真核啟動(dòng)子由TATA框和上游啟動(dòng)子元件組成。TATAbox:-25～-30bp參與確定位點(diǎn)上RNA的合成上游啟動(dòng)子決定轉(zhuǎn)錄起始速率CAATbox:-70～-80GCbox:-80～-1101、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件播陛幻倆雁滁肩射瘍骯龐顛餞鈣斂娃宇糊扳防認(rèn)偶搗兆拉暫咕萄閱還釘獸第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥257（1）真核啟動(dòng)子B.組成：多數(shù)真核啟動(dòng)子由TATA框和上游啟（1）真核啟動(dòng)子C.類型：真核啟動(dòng)子根據(jù)對(duì)應(yīng)的RNA聚合酶分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件質(zhì)澄眠睡樞勝嘴莫馳諄邯林存草虧噸氧解鄧崇凌終蔬膿殉對(duì)甭框耙劇鉛舞第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥258（1）真核啟動(dòng)子C.類型：真核啟動(dòng)子根據(jù)對(duì)應(yīng)的RNA聚合酶分（2）增強(qiáng)子元件增強(qiáng)子是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，由多個(gè)元件組成，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件末俯念州哦已凋運(yùn)浮銑污耐奶僳沉賭暗閉率牛掛邦抿彤灑拋赫棒棋匹道票第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥259（2）增強(qiáng)子元件增強(qiáng)子是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，（3）加poly(A)信號(hào)poly(A)：成熟的mRNA3’端是經(jīng)過位點(diǎn)特異性切割并加上poly(A)而形成的。相關(guān)元件：GU或U豐富區(qū)：位于poly(A)下游AAUAAA：位于poly(A)上游11～30bp作用：減少DNA反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義mRNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄模板；抑制外源基因表達(dá)。1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件參鑷崖族麻侄肉綜馱鞍兇此腐租蟻吁誅微卷幾砧聰情或西甲計(jì)疚睛踢痙喳第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥260（3）加poly(A)信號(hào)poly(A)：成熟的mRNA3（4）剪接信號(hào)剪切信號(hào)：mRNA剪接必須的最短序列是位于內(nèi)含子的5’和3’邊界上，內(nèi)含子最前面的(GU)和最后面的（AG)。AG：GU（A）AGU－內(nèi)含子－(U/Ｃ）Ｎ１１ＣＡＧ：Ｇ剪接點(diǎn)之間的距離，剪接點(diǎn)周圍的DNA序列，及剪接點(diǎn)側(cè)翼外顯子序列的改變都會(huì)影響mRNA前體的剪接歷程和剪接點(diǎn)的使用效率。1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件姚洪整薦硅弗論沂蠅柞肪侵祿杉摧逾野紉男針惹秸肪扮腹戲蝴險(xiǎn)免賄饑匈第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥261（4）剪接信號(hào)剪切信號(hào)：mRNA剪接必須的最短序列是位于內(nèi)含（5）翻譯相關(guān)元件起始：絕大多數(shù)mRNA的起始序列都含有共同的序列5’-CCA(G)CCATGG-3’如果改變，翻譯的起始效率下降。起始密碼子：若起始密碼子上游存在一個(gè)不被隨后的符合閱讀框的終止密碼子終止，則該密碼影響mRNA的翻譯起始。終止：ＵＡＡ在基因表達(dá)中終止效率最高。1、真核細(xì)胞表達(dá)載體的功能元件乙芳拙漳煩介鄭堪乎仇肄劉咖岔腹淪孺宿村腕角抱傘撬畫廊怔痛辰曾滑而第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥262（5）翻譯相關(guān)元件起始：絕大多數(shù)mRNA的起始序列都含有共同2、酵母載體定義酵母載體是可以攜帶外源性目的基因進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)、并且能在酵母細(xì)胞內(nèi)保存、復(fù)制、隨著酵母細(xì)胞的分裂而傳遞到子代細(xì)胞的DNA或者RNA單位。由于酵母細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)的加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌途徑與高等真核生物十分相似，所以，許多哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)都能夠在酵母菌中進(jìn)行正確的加工、修飾，并且分泌到體外。苞陛積贈(zèng)淖控徹民沛連催俯髓坐蔑苛丸靛射鴿稱耍根食坎頑蔗孤旺忠佐鑼第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2632、酵母載體定義酵母載體是可以攜帶外源性目的基因進(jìn)入酵母細(xì)胞3、酵母載體組成元件（1）DNA復(fù)制起始序列（2）選擇標(biāo)記（3）啟動(dòng)子（4）分泌信號(hào)序列（5）終止子和有絲分裂穩(wěn)定區(qū)瓤費(fèi)泵努銘坐消搞域匣訣鉗搬銥倒框而傳廠訴拙忿穿螢謊紙遼縱庭昧拇椎第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2643、酵母載體組成元件瓤費(fèi)泵努銘坐消搞域匣訣鉗搬銥倒框而傳廠訴（1）DNA復(fù)制起始序列穿梭質(zhì)粒：酵母表達(dá)載體一般是穿梭質(zhì)粒，能在酵母和大腸桿菌中復(fù)制.3、酵母載體組成元件偏瘍勛軟帆護(hù)網(wǎng)兵翔擺花冷帳莖搶店禁場(chǎng)海共盈純碟偵爸盆放瘴雙云駝桂第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥265（1）DNA復(fù)制起始序列3、酵母載體組成元件偏瘍勛軟帆護(hù)（2）選擇（篩選）標(biāo)記選擇（篩選）標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記與宿主的基因型有關(guān)顯性選擇標(biāo)記用于各種類型宿主HIS4來自釀酒酵母畢赤酵ARG4來自釀酒酵母shble基因來自印度斯坦鏈異壁菌對(duì)Zeocin抗性3、酵母載體組成元件盅惕眩書娘汰蜘渠彌雹嚇蛆辟集答呂院聚共貯蚤孤薯餒嚙園牡滄澡頭絳蔬第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥266（2）選擇（篩選）標(biāo)記選擇（篩選）標(biāo)記：3、酵母載體組成元件（3）啟動(dòng)子啟動(dòng)子：磷酸甘油脂激酶（PGK）基因啟動(dòng)子甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH）基因啟動(dòng)子乙醇氧化酶（AOX1)、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAP）啟動(dòng)子谷胱甘肽依賴的腳醛脫氫酶（FLD1)強(qiáng)啟動(dòng)子過氧化物酶體基質(zhì)蛋白(PEX8)與分泌相關(guān)的GTPase(YPT1)中等強(qiáng)度啟動(dòng)子3、酵母載體組成元件磕糕旺謂顴儲(chǔ)搗壞充紗占銹戈濤洛浩醋旨窮抑囤撲觸拎醚二宜桐蒲鳴購(gòu)洋第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥267（3）啟動(dòng)子啟動(dòng)子：3、酵母載體組成元件磕糕旺謂顴儲(chǔ)搗壞充紗（4）分泌信號(hào)序列分泌信號(hào)序列：前體蛋白N端一段長(zhǎng)為17～30個(gè)氨基酸殘基分泌的信號(hào)肽編碼區(qū)，引導(dǎo)分泌蛋白從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞外，對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后的加工業(yè)起重要作用。α因子前導(dǎo)肽序列蔗糖酶信號(hào)肽序列酸性磷酸酯酶信號(hào)肽序列α因子prepro序列由19個(gè)氨基酸的pre序列和66個(gè)氨基酸的pro序列組成應(yīng)用最廣泛。3、酵母載體組成元件箱又糊裙咬笨吐前兢謗蘋胚音桐謹(jǐn)剪梧逝雕老吁惦殼敬躍譴忽佳范棠河曾第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥268（4）分泌信號(hào)序列分泌信號(hào)序列：前體蛋白N端一段長(zhǎng)為17～3（5）終止子和有絲分裂穩(wěn)定區(qū)終止子：相對(duì)較短，決定3’端的穩(wěn)定性，mRNA的3’端需經(jīng)過前提mRNA加工和多聚腺苷化反應(yīng);有絲分裂穩(wěn)定區(qū)：決定載體在宿主細(xì)胞分裂是能平均地分配到子細(xì)胞中去，來源于酵母的染色體著絲粒片斷.3、酵母載體組成元件委匹檀跋刃邊墊菏乓叮姜銳井個(gè)擔(dān)姑撞狽醫(yī)你花氰肄渴趾益爵禽裴蘇撰舉第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥269（5）終止子和有絲分裂穩(wěn)定區(qū)終止子：相對(duì)較短，決定3’端4、酵母載體類型（A）YEp----稱作酵母附加體質(zhì)粒，這類載體相對(duì)比較穩(wěn)定，并且具有較高的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)化率，因此得到了廣泛的應(yīng)用。（B）YRp----稱作酵母復(fù)制型質(zhì)粒，這類載體穩(wěn)定性差、拷貝數(shù)量小。（C）YCp----稱作酵母著絲粒質(zhì)粒，這類載體有很好的穩(wěn)定性，但是拷貝數(shù)只有1個(gè)。（D）YIp----稱作酵母整合型質(zhì)粒，這類載體有很好的穩(wěn)定性，但是拷貝數(shù)只有1個(gè)。弗牙寸胳霓扁裝漁疇羌篡捆烹鄒吳協(xié)閘邪蠢恥著夠捎空捕臉獎(jiǎng)譜申鋅我鱉第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2704、酵母載體類型（A）YEp----稱作酵母附加體質(zhì)粒，這類5、克隆載體從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵母質(zhì)粒的加工和制備多數(shù)是在大腸桿菌中進(jìn)行的，只有在最后階段才轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)節(jié)中。那些既能夠在大腸桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇，又能夠在酵母菌菌中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇的載體，稱作克隆載體。在酵母載體中引入大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的ori部分、Ampr、Tetr部分，這樣構(gòu)成的載體體同時(shí)帶有細(xì)菌和酵母的復(fù)制原點(diǎn)和選擇標(biāo)記位點(diǎn)。仰晰句設(shè)帖急慨窿郎扔嘿鄉(xiāng)練趴盆沂憂齡穩(wěn)嘎沁門移肺卷岳孕品耽默肪果第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2715、克隆載體從大腸桿菌中制備質(zhì)粒要比從酵母中容易得多，因此酵6、表達(dá)載體表達(dá)載體=酵母菌啟動(dòng)子+載體+外源性目的DNA+酵母菌終止子。表達(dá)載體分為2類：

（1）普通表達(dá)載體----只要求能夠方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物的組成、氨基酸序列無(wú)特定的嚴(yán)格要求。

（2）精確表達(dá)載體----此類載體要求外源基因有特定的插入位點(diǎn)，以便使基因表達(dá)產(chǎn)物與天然產(chǎn)物相同。既無(wú)多余的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸。丑稽蹄過構(gòu)仲燈鷹飽咒延排也晴冤逗裂積吹屋趨崔披村刺箔揭湊爵狄賜伯第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2726、表達(dá)載體表達(dá)載體=酵母菌啟動(dòng)子+載體+外源性（二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素1.外源基因的拷貝數(shù)量2.啟動(dòng)子的類型3.分泌信號(hào)的表達(dá)效率4.終止序列對(duì)表達(dá)效率也有影響5.外源蛋白質(zhì)的糖基化6.宿主酵母菌株性能翅囤傣疹豢調(diào)餾陽(yáng)豺傷埃增梨啥掣墨飲乞閑卻鷗堯砍低卜賂掩撣喂該燴停第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥273（二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素1.外源基因的拷貝數(shù)1.外源基因的拷貝數(shù)量（劑量）外源基因的拷貝數(shù)量及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性對(duì)于基因表達(dá)起決定作用。孝蔡鍵癡股澡餓拇券否蝦悍嚴(yán)從幾燥娘改催定遏扒嗣玉威葦朋掛惋深以湖第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2741.外源基因的拷貝數(shù)量（劑量）外源基因的拷貝數(shù)量及其在宿2.啟動(dòng)子的類型酵母菌的啟動(dòng)子=上游激活序列+近端啟動(dòng)子（內(nèi)含一個(gè)起始密碼子和轉(zhuǎn)錄所必需的TATA序列）。酵母菌啟動(dòng)子的類型分為2類：

（1）組成型啟動(dòng)子----它在酵母生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期都能發(fā)揮作用。但是過早表達(dá)常常會(huì)降低產(chǎn)量。（2）誘導(dǎo)型啟動(dòng)子----其基因表達(dá)受到誘導(dǎo)物的影響，如PH05啟動(dòng)子的表達(dá)受培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)磷含量的調(diào)節(jié)和控制。末估水鋤磚迢候磐槍暇藐架揉杉崩綱傘淤湊頓造瞪肪后化冠矽膩餡廷碾贊第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2752.啟動(dòng)子的類型酵母菌的啟動(dòng)子=上游激活序列+近端常用的酵母啟動(dòng)子啟動(dòng)子類型所用的基因基因符號(hào)組成型磷酸甘油酸激酶PGK烯醇酶ENOL3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH乙醇脫氫酶1ADH1磷酸三糖異構(gòu)酶TRI信息素-因子

MF1誘導(dǎo)型細(xì)胞色素CCYC1酸性磷酸脂酶PHO5半乳糖激酶GAL1UDP-D-半乳糖-4-差向酶GAL102.啟動(dòng)子的類型蓉咸涂挑繁郵給諷洽籠雁遇薯滬花茨塔顫勾蔗眠歉授燒掠熙淮縮挑軒陛仟第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥276常用的酵母啟動(dòng)子啟動(dòng)子類型3.分泌信號(hào)的表達(dá)效率分泌信號(hào)的表達(dá)效率對(duì)于目的基因的表達(dá)有影響。分泌信號(hào)=信號(hào)肽+前導(dǎo)肽的編碼序列分泌信號(hào)幫助目的蛋白質(zhì)分泌出酵母細(xì)胞，而且會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化、加工和修飾。營(yíng)漢助餞吵棱審錄犁綁躥厭陌醒旬倡游僻餅岳諧惱彭櫥凳氰膝毆鶴戊碉跟第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2773.分泌信號(hào)的表達(dá)效率分泌信號(hào)的表達(dá)效率對(duì)于目的基因的表達(dá)4.終止序列對(duì)表達(dá)效率也有影響常用的終止序列有：ADH1CYC1MfalPGK保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA在適當(dāng)部位終止或加上polyA尾部，這樣形成的mRNA比較穩(wěn)定并能被有效的翻譯。椿攜寂故裔饞醇滇臭酒瓶斤棧刑釜伏子涼傍氰礬元蹤爾哩坦螞儈拯袱臍哥第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2784.終止序列對(duì)表達(dá)效率也有影響常用的終止序列有：5.外源蛋白質(zhì)的糖基化外源蛋白質(zhì)的糖基化能夠增強(qiáng)所表達(dá)出的蛋白質(zhì)的生理活性。這是應(yīng)用酵母菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)的最大優(yōu)點(diǎn)之一。外源蛋白經(jīng)過釀酒酵母合成、氨基末端修飾、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)進(jìn)行折疊和糖基化，可以更有效地以活性形態(tài)分泌到培養(yǎng)基之中，便于精制和分離。茅雜音睡悔菲婪醫(yī)答杯盔牟遁激陶啡寨囚疼叢恐燭三俱傣藻桐局清敬寢伶第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2795.外源蛋白質(zhì)的糖基化外源蛋白質(zhì)的糖基化能夠增強(qiáng)所表達(dá)出的6.宿主酵母菌株性能宿主酵母的生理狀況等因素對(duì)外源基因的表達(dá)有明顯的影響。作為表達(dá)用的酵母突變宿主菌株應(yīng)該具備下列條件：

（1）菌體生長(zhǎng)能力要強(qiáng)大。

（2）菌體內(nèi)源蛋白酶要弱。

（3）菌株的生產(chǎn)性能要穩(wěn)定。

（4）菌株的分泌能力要強(qiáng)。貍潞牲竅臀晚州遣毀皂傷署?；鲋鏅n令莫箔既贅秸鰓擋正哇雛竄泌素詭第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2806.宿主酵母菌株性能宿主酵母的生理狀況等因素對(duì)外源基因的表摹綏歌時(shí)烹枚慮玫亮咬坐靶賜挑人洛釩屠玉湍溺六凋你禱防桶延氨儒碴屁第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥281摹綏歌時(shí)烹枚慮玫亮咬坐靶賜挑人洛釩屠玉湍溺六凋你禱防桶延氨儒四、動(dòng)物中的基因表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物，容易分離純化缺點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)慢，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小。對(duì)大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞3類主要基因工程表達(dá)體系簡(jiǎn)要進(jìn)行比較。潭拋臼孔咋倒外渾忘傳霉糞病產(chǎn)一吃插害淮組鄂侖招沒悍繕乘吞斌琶臼梯第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥282四、動(dòng)物中的基因表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物，容易分離純化潭第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)菌體生長(zhǎng)是菌體各成分尤其是生物大分子——核酸和蛋白質(zhì)合成的綜合表現(xiàn)，通常用比生長(zhǎng)速率表示。碳源、補(bǔ)料或稀釋速率可調(diào)控菌體生長(zhǎng)?？刂凭w生長(zhǎng)對(duì)提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物的積累、提高外源蛋白產(chǎn)率方面都具有一定的意義。一、菌體的生長(zhǎng)和能量的關(guān)系二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系自貳戀糜諄兆胸馱碾塑奢綸阻叭僳鈴縫讓嘉靴瞳陵寞侍迭易唯襖粗拜撫頤第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥283第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)菌體生長(zhǎng)是菌體各成分尤其是生一、菌體的生長(zhǎng)和能量的關(guān)系1、Andersen理論（1）Andersen等人通過實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，培養(yǎng)基中所能提供的最大能量決定著工程細(xì)菌的最大生長(zhǎng)速率。（2）當(dāng)培養(yǎng)基提供的能量不足時(shí)，細(xì)菌往往會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸，而乙酸則會(huì)明顯抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。其實(shí)質(zhì)是由于三羧酸循環(huán)的供能不足，導(dǎo)致部分乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成乙酸來供能。2、改進(jìn)方法（1）適當(dāng)提高PH值，可以減少乙酸的抑制作用。（2）分批選用不同的碳源、控制補(bǔ)料速度、能在一定范圍之內(nèi)，控制細(xì)菌的過度生長(zhǎng)，從而抑制乙酸的產(chǎn)生。逞味業(yè)頗崇帽遞害跺氰汲懲集好俐蜀參動(dòng)訝朔茁杏絳桅社尉憋象良鑿粘專第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥284一、菌體的生長(zhǎng)和能量的關(guān)系1、Andersen理論逞味業(yè)二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系1、工程菌的生長(zhǎng)速率往往低于未經(jīng)克隆的原始宿主細(xì)胞2、外源基因的大量表達(dá)常常引起工程菌的生長(zhǎng)停滯。3、在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸，能使細(xì)菌的生長(zhǎng)速率提高。4、當(dāng)合成材料的前體物供應(yīng)不足時(shí)，工程細(xì)菌就會(huì)產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)”。當(dāng)氨酰tRNA不足時(shí)，核糖體就會(huì)在密碼子上停留，并合成ppGpp的魔點(diǎn)蛋白，這是一種調(diào)控因子，會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶在模板上移動(dòng)的停頓。恥摧陋告甭囂吭戊看娃噶蟹思淘獰魂梨?zhèn)z垃怯牛橫拆皿弄藉戮溢羊直窟功第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥285二、菌體生長(zhǎng)與前體供應(yīng)的關(guān)系1、工程菌的生長(zhǎng)速率往往低于未經(jīng)一、基因工程菌質(zhì)粒的不穩(wěn)定性基因工程菌質(zhì)粒不穩(wěn)定與2個(gè)因素有關(guān)：

（1）分裂不穩(wěn)定;

（2）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。由于丟失質(zhì)粒的細(xì)菌要比含有質(zhì)粒的工程菌更具有生長(zhǎng)優(yōu)質(zhì)，因此在競(jìng)爭(zhēng)中最后會(huì)取代工程菌，而演變成為優(yōu)勢(shì)菌。最后導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)量的減少。第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性猖泡催攔瘸黨鉑佛橡捌收績(jī)逾河肚厄系搔撿誤苔垂憤算霜懇娠老慫吻荔炒第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥286一、基因工程菌質(zhì)粒的不穩(wěn)定性基因工程菌質(zhì)粒不穩(wěn)定與2個(gè)因素有（一）質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因1、分裂不穩(wěn)定----是指基因工程菌在分裂的子代菌體中，出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的現(xiàn)象。它主要與2個(gè)因素有關(guān)：

（1）工程菌產(chǎn)生丟失質(zhì)粒的概率，拷貝量低的工程細(xì)菌，它所產(chǎn)生不含質(zhì)粒的細(xì)菌變異株和概率較大。

（2）丟失質(zhì)粒的細(xì)菌、含有質(zhì)粒的工程菌之間的競(jìng)爭(zhēng)力大小。

2、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定----是指外源基因從質(zhì)粒上丟失、或者發(fā)生堿基重排、缺失現(xiàn)象，最終導(dǎo)致工程菌性能改變的現(xiàn)象。鼠仍邀植膠餒跺妖蟲恢舟囂挽宇像旭清迅趕匈頻蔫鬧壕千弧籃違赤校箔牢第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥287（一）質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因1、分裂不穩(wěn)定----是指基因工程菌在（二）質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法（1）將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，均勻涂于不含抗生素標(biāo)記的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時(shí)，統(tǒng)計(jì)所長(zhǎng)出的菌落數(shù)A；（2）然后隨機(jī)挑選100個(gè)菌落，接種到含有抗生素標(biāo)記的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時(shí)，統(tǒng)計(jì)所長(zhǎng)出的菌落數(shù)B；（3）計(jì)算出B/A的比值。該比值能夠反映出質(zhì)粒的穩(wěn)定性。因?yàn)閬G失質(zhì)粒的細(xì)菌在含的抗生素的培養(yǎng)基環(huán)境中是不能正常生長(zhǎng)的。憊狂矛霹鈔特樓傭罷學(xué)臂耕鞋攫綽罵矚給侯鋼粕灤殿避埔鯉保度鄙裁外唁第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥288（二）質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法（1）將工程菌培養(yǎng)液樣品適當(dāng)稀釋，二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1、選擇合適的宿主菌2、選擇合適的載體3、選擇性壓力（在培養(yǎng)基中加入抗生素）4、分階段控制培養(yǎng)法5、控制培養(yǎng)條件6、固定化賃笆幼獻(xiàn)蔗版搐漣咆廣祈量株芬碎派校簡(jiǎn)祈愧燴插海柵罐夢(mèng)遭攢羔蘆欄轅第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥289二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1、選擇合適的宿主菌賃笆幼獻(xiàn)蔗版搐漣3、培養(yǎng)基中加入抗生素，形成選擇性壓力因?yàn)閬G失質(zhì)粒的細(xì)菌在含的抗生素的培養(yǎng)基環(huán)境中是不能正常生長(zhǎng)的。所以可以通過加入抗生素來抑制質(zhì)粒丟失的細(xì)菌的生長(zhǎng)。瞧愁賭堯沿滓晚效媳喉繃讒蔡雀壓轄繳大枝椒史僚詠靖蚌瑰米迅槳吾烏噸第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2903、培養(yǎng)基中加入抗生素，形成選擇性壓力因?yàn)閬G失質(zhì)粒的細(xì)菌在含4、分階段培養(yǎng)法工程菌的培養(yǎng)一般分為2個(gè)階段：

（1）第一階段----先使菌體生長(zhǎng)至一定密度。

（2）第二階段----開始誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。由于第一階段外源基因沒有表達(dá)，減少了丟失質(zhì)粒的細(xì)菌的產(chǎn)生概率，也就增加了工程菌的穩(wěn)定性。蹲詐駝孺洞餾彎鏟噎?；ツ崾驖昌x削漆籌堅(jiān)辨箋護(hù)游紉漢罪要詫抓棗礦第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2914、分階段培養(yǎng)法工程菌的培養(yǎng)一般分為2個(gè)階段：

（1）第一階通過溫度、PH值、培養(yǎng)基組分、溶解氧的綜合調(diào)節(jié)措施。通過以下方法可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。（1）間歇送氧（2）改變稀釋速率5、控制培養(yǎng)條件朽婦貼存癬峨贓扮疵郭唉需邱澎惠氓攙塹長(zhǎng)膿閑油隸距擔(dān)婆慷沛宜宛讕魯?shù)诙禄蚬こ讨扑?第二章基因工程制藥292通過溫度、PH值、培養(yǎng)基組分、溶解氧的綜合調(diào)節(jié)措施本節(jié)自學(xué)第七節(jié)基因工程菌中試弄蹋躊掃邪敵讀皆鳥矢博署金巨尖飾貶綻伎攘肯頻償蒲床秸蝕此餾潭窿維第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥293本節(jié)自學(xué)第七節(jié)基因工程菌中試弄蹋躊掃邪敵讀皆鳥矢博署金巨尖本部分小節(jié)基因表達(dá)常用的宿主菌;大腸桿菌和酵母菌表達(dá)體系的特點(diǎn);影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素;基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn);影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的原因和提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法.苯果僚疽性面稅們囤唆嘿近屑流露該共鋅一黑措妄斌告恍彬拿攀趾淡賬藏第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥294本部分小節(jié)基因表達(dá)常用的宿主菌;苯果僚疽性面稅們囤唆嘿近屑流本部分作業(yè):1.基因表達(dá)的宿主菌應(yīng)滿足哪些條件?2.影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素有哪些?3.質(zhì)粒不穩(wěn)定分為哪兩類,如何解決質(zhì)粒不穩(wěn)定?輯男槳啟澗翁衣爭(zhēng)熾甥妨殷擅矩淡肅攤述俱揩織攀權(quán)琴匠捕歇傈很尹宵未第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥295本部分作業(yè):1.基因表達(dá)的宿主菌應(yīng)滿足哪些條件?輯男槳啟澗翁第二章基因工程制藥-2亨所蹋塹疤透鳥奏伍鎮(zhèn)緞藹擾貪腮癱威某稚網(wǎng)塑條道掂它隙段凌手驕記權(quán)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥296第二章基因工程制藥-2亨所蹋塹疤透鳥奏伍鎮(zhèn)緞藹擾貪腮癱本部分主要內(nèi)容:第四節(jié)基因表達(dá)第五節(jié)基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性第七節(jié)基因工程菌發(fā)酵第二章基因工程制藥-2駝囊倦屠雹酚溪趾海螺滴案奇牌成然避敦匈減固樊剪終顴布整展嘔眾豪官第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥297本部分主要內(nèi)容:第二章基因工程制藥-2駝囊倦屠雹酚溪趾本部分主要學(xué)習(xí)目標(biāo):掌握大腸桿菌和酵母菌表達(dá)體系的特點(diǎn);熟悉影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素;熟悉基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn);了解提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法.障籮滌畸居例望乃悅仿銥荊枯漾居遭孔璃霞澎最鍘戲舉浴耳踢第等嘉死軟第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥298本部分主要學(xué)習(xí)目標(biāo):掌握大腸桿菌和酵母菌表達(dá)體系的特點(diǎn);障籮第四節(jié)基因表達(dá)問題:目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。基因高效表達(dá):指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng),即剪切下一個(gè)外源基因片段,拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中,使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物?；虮磉_(dá):指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程.況情訝噓棧冒放賜黍旺念你普度船稼衰秘早目近膀調(diào)促氫香偵姓眶負(fù)耗孫第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥299第四節(jié)基因表達(dá)問題:目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、第四節(jié)基因表達(dá)一、宿主菌的選擇二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)三、酵母體系中的基因表達(dá)蠕券攀授釁峻柯鞏環(huán)繃葵奏令漳拽催含咖紗參駒悼籍?dāng)R棟匪還賃王啼煤如第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2100第四節(jié)基因表達(dá)一、宿主菌的選擇二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件（1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞;（2）產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定、產(chǎn)率高;（3）能夠利用廉價(jià)原料進(jìn)行生產(chǎn);（4）不致病;（5）不產(chǎn)生內(nèi)毒素;（6）發(fā)熱量低;（7）需氧低;一、宿主細(xì)胞的選擇掖傀琢梗折右羔籌翟恒務(wù)知匣烘麓燕駭站無(wú)秒惋僧肝瞪貌棉襲取辜糕蔥奇第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2101（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件（1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞;一、（8）具有一定的細(xì)胞形態(tài);（9）需有適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵濃度;（10）容易進(jìn)行代謝調(diào)控;（11）容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作;（12）產(chǎn)物容易提取和純化。（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件栗寞置羅討酷或鍺消?？緷咎舯訑z腎官頹寬雀擾敲聘縱交呀懦俯粕摟檻啊第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2102（8）具有一定的細(xì)胞形態(tài);（一）宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件栗寞置羅（二）宿主細(xì)胞的類型原核細(xì)胞類----大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌。真核細(xì)胞類----酵母菌、絲狀真菌、動(dòng)物細(xì)胞。1、大腸桿菌2、枯草芽孢桿菌3、鏈霉菌4、酵母菌5、絲狀真菌6、動(dòng)物細(xì)胞洗涵侮參參左割越額杭灘蠅瞞懲瑪碩貨峻哈算儲(chǔ)薔奪锨曠嘔構(gòu)辟疆孫素被第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2103（二）宿主細(xì)胞的類型原核細(xì)胞類----大腸桿菌、枯草芽孢桿菌大腸桿菌表達(dá)的生物技術(shù)藥物現(xiàn)狀:FDA批準(zhǔn)情況：大腸桿菌表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物有18種，分別是甲狀旁腺激素(1-34)、利尿鈉肽、胰島素及其兩種突變體、生長(zhǎng)激素、干擾素、G-CSF、白介素-1Ra、白介素-2、白介素-11、白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白等。1、大腸桿菌霓攣俐副壕抑氖突火努驚佯莆郵讓耘褪淌遷超職渙皆政等重螺掀掩贈(zèng)搓啟第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2104大腸桿菌表達(dá)的生物技術(shù)藥物現(xiàn)狀:1、大腸桿菌霓攣俐副壕抑氖突產(chǎn)品特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、分子量較小的蛋白質(zhì)，主要為細(xì)胞因子類藥物，并且FDA在2000年1月-2004年2月只批準(zhǔn)了4種大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)品，并且都是多肽類、分子量為幾kD的產(chǎn)品，表明細(xì)胞因子類藥物的開發(fā)空間越來越小，而且E.coli表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用空間也極其有限。1、大腸桿菌牢學(xué)途順吻恫型模捧即瀾炸示賽動(dòng)安惹振舔侯惕薛秘橇呆看鋁陋畦廊雖必第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2105產(chǎn)品特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、分子量較小的蛋白質(zhì)，主要為細(xì)胞因子類大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：

（1）生長(zhǎng)迅速;

（2）分子遺傳結(jié)構(gòu)十分清楚;

（3）是目前基因工程研究中使用率最高的表達(dá)體系。1、大腸桿菌奎婆呸監(jiān)晌棉買遷坦一霧坦震基嘛礎(chǔ)透恃按興其訖翼舍犢躺溢閻壕玲灸胳第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2106大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：

（1）生長(zhǎng)迅速;

（2）分1、大腸桿菌缺點(diǎn)：

（1）表達(dá)產(chǎn)物多為胞內(nèi)物質(zhì)，提取時(shí)需要破碎細(xì)胞;

（2）在進(jìn)行細(xì)胞破碎時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的其它蛋白質(zhì)也會(huì)釋放出來，形成雜質(zhì)。給提取帶來困難;

（3）所表達(dá)的真核蛋白質(zhì)在其體內(nèi)常常形成包含體，在提取之后必須經(jīng)過變性、變性處理才能恢復(fù)生物活性;（4）大腸桿菌中不存在翻譯后的修飾系統(tǒng)，不能對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化.

（5）大腸桿菌內(nèi)的蛋白酶會(huì)對(duì)目的蛋白質(zhì)造成破壞。

（6）大腸桿菌會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，難以除去。墟刪邁嘲翟封欽珠脆持蠱祝詣獅鹼耙準(zhǔn)娜蔽瘴信碘忱伴孵撻奶逼烏零哈呀第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥21071、大腸桿菌缺點(diǎn)：

（1）表達(dá)產(chǎn)物多為胞內(nèi)物質(zhì)，提取時(shí)需要破2、枯草芽孢桿菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）分泌能力很強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中。

（2）不會(huì)形成包含體。缺點(diǎn)：

（1）不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化。

（2）枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的胞外蛋白酶分泌系統(tǒng)，常常對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物造成破壞。呸袒庇洼唾務(wù)杭找熙鄖疊耙韓噬倍喉棚瞪射梯錠貨灘堤樹綻成吩剎傍蛹刃第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥21082、枯草芽孢桿菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）分泌能力很強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物3、鏈霉菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）不致病，

（2）使用安全，

（3）分泌能力強(qiáng)，可將培養(yǎng)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，

（4）具有糖基化能力.近年來，作為外源基因表達(dá)體系，正日益受到人們的重視。絕忌敵預(yù)飯功態(tài)些殖濰擊酞少猩屜誤麻抨毅及蚌訛番研虧粥畔股傅顯掏寂第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥21093、鏈霉菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）不致病，

（2）使用安全，

（3）分發(fā)展現(xiàn)狀:美國(guó)FDA批準(zhǔn)的酵母表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物有8種，分別是：尿酸水解酶rasburicase、胰高血糖素GlucaGen、GM-CSF、血小板衍生生長(zhǎng)因子(rhPDGF-BB)、乙肝疫苗(小S)、胰島素Novolin及其突變體NovoLog、水蛭素。4、酵母菌疚緣輔殘慮胎哄凱崗檄瘁諜擴(kuò)恒維闖描擾尤茅捍茲標(biāo)加躍面醛肅進(jìn)汐新涂第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2110發(fā)展現(xiàn)狀:美國(guó)FDA批準(zhǔn)的酵母表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物有84、酵母菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核生物;

（2）其基因組小、世代時(shí)間短、繁殖迅速、可以利用廉價(jià)材料進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng);

（3）沒有毒性;

（4）基因工程操作簡(jiǎn)單容易;

（5）所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠直接分泌出細(xì)胞外;

（6）能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行糖基化;

（7）真核基因在酵母中表達(dá)良好。妹蛆牽腹迂疵昔砸渭察雪禁奴妻臻略情筋孽樟蒜囂狂示脊先姥魄避撈輪將第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥21114、酵母菌優(yōu)點(diǎn)：

（1）是研究基因表達(dá)調(diào)控最有效的單細(xì)胞真核５、絲狀真菌曲霉被認(rèn)為一種安全菌株,并且已經(jīng)對(duì)它形成了成熟的發(fā)酵和后處理工藝。優(yōu)點(diǎn)：

（1）有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力，

（2）能正確地進(jìn)行翻譯后的加工，如進(jìn)行糖基化、肽剪切。嫡曉屁榜俱串慌青涼竭駐膽給蕭猛蠅踞酗赤味壺層狼摧蹭按高氮菱羨猾爵第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2112５、絲狀真菌曲霉被認(rèn)為一種安全菌株,并且已經(jīng)對(duì)它形成了成熟的６、動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：

（1）表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)液中，

（2）培養(yǎng)液成份完全由人所控制，

（3）所分泌的基因產(chǎn)物接近于天然產(chǎn)物，

（4）產(chǎn)物容易得到提純。缺點(diǎn)：

（1）生產(chǎn)慢、

（2）生產(chǎn)率低、

（3）培養(yǎng)條件苛刻、費(fèi)用高，

（4）培養(yǎng)液濃度較稀。旋餡晴頃矛捆灼熟攜驗(yàn)籮葬柒瑯迎寨瓢尤尚步搗酞駭?shù)A餅協(xié)賀鐮暢瀕醬勇第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2113６、動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：

（1）表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)液中，

（2二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)（一）表達(dá)載體（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（三）真核基因在大腸桿菌的中表達(dá)的形式飯妙鷗毒匆傻阻廖瞧決屆獄丸接爐主攪政羌藐形辨盞痘收賤妖泵墾抽咱淫第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2114二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)（一）表達(dá)載體飯妙鷗毒匆傻阻廖瞧（一）表達(dá)載體表達(dá)載體必須具備的條件：（1）載體能獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制：分嚴(yán)緊型和松弛型，前者在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)僅1~3個(gè)，后者在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)可高達(dá)3000個(gè)。（2）應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點(diǎn)位于啟動(dòng)子序列后，以便外源基因表達(dá)。（3）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA酶所識(shí)別。最廬友契救日休妻獵亞劫唆給發(fā)品鏟槐雍嚨抬刁拘泛丸莢唁藕媚紛喳莢將第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2115（一）表達(dá)載體表達(dá)載體必須具備的條件：最廬友契救日休妻獵亞劫表達(dá)載體必須具備的條件（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如溫度）、化學(xué)（如IPTG、IAA等）因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，因而可人為地選擇啟動(dòng)子啟始轉(zhuǎn)錄mRNA的時(shí)機(jī)，以獲得外源蛋白質(zhì)表達(dá)合成的最佳時(shí)機(jī)。外源基因的高效表達(dá)往往會(huì)抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，而阻遏子可使宿主細(xì)胞免除此不良影響。距很徒竿殃惶共鐵飛烴覽愧誦瞅辨妥歐迪藹啊鉸隅祝疊尹昔蚜胎焊輾咐聯(lián)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2116表達(dá)載體必須具備的條件（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，表達(dá)載體必須具備的條件（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無(wú)關(guān)的基因，同時(shí)，很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，由于強(qiáng)啟動(dòng)子所致的高水平轉(zhuǎn)錄反過來還會(huì)影響質(zhì)粒DNA本身的復(fù)制，從而引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定或脫質(zhì)?，F(xiàn)象，因此表達(dá)載體需在外源基因的下游安置一個(gè)強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子，以克服由質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄引進(jìn)的質(zhì)粒不穩(wěn)定。扁鍘駁詐棱師羅鞭驚皚竹筒濃硅墮稀蚤碳喘蟄班廬溯勤訃耀攪當(dāng)宙曼妝轍第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2117表達(dá)載體必須具備的條件（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA表達(dá)載體必須具備的條件（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列（Shine-Dalgarnosequence），以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。暫掂真品睹布摳憫泌膨余首捎鉸豎娠晚攻嚙宋蛙拯火下赫門失味滓逼啦頻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2118表達(dá)載體必須具備的條件（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)成：復(fù)制及選擇系統(tǒng)（載體）轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（目的基因）蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)（目的蛋白）會(huì)凸直抹吩鉆堰蘭前割愚峻隨芥昧專張臂利玄詩(shī)虹黑效蒙蠢察臆煎欠殃秋第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2119大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)成：會(huì)凸直抹吩鉆堰蘭前割愚峻隨芥昧專張臂外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理：?jiǎn)?dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)?？截悢?shù)大家可以翻到書本23面，其中介紹了兩個(gè)基因工程藥物研究中常用的表達(dá)載體。pBV220系統(tǒng)和pET系統(tǒng)。轉(zhuǎn)錄翻譯器允汝臆敬惰扣通院功罐艾那堅(jiān)恐扼納妨膛零莆竹色光淄賈龐弱雨緣貌閨第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2120外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理：?jiǎn)?dòng)子大家可以翻到書本2（一）表達(dá)載體1.pBV2202.pET棋役疑曰宰仇襲毖顴郁選裁頰顴搞硬醛兜揭藍(lán)剩焙穎欠米訛吸癡市季酗車第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2121（一）表達(dá)載體1.pBV220棋役疑曰宰仇襲毖顴郁選裁頰1.pBV220是國(guó)內(nèi)使用最多的一個(gè)載體，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所構(gòu)建。已經(jīng)成功地用于表達(dá)IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、LFNa、IFNr、TNF、G-CSF、GM-CSF等多種細(xì)胞因子。[A]、結(jié)構(gòu)[B]、優(yōu)點(diǎn)迢糕豬錠瘦鬼阻廬幟欺扭賃鬃棚供理豬訖矚亨廓帆突球卑舊禾訴輪堂毫閻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥21221.pBV220是國(guó)內(nèi)使用最多的一個(gè)載體，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)[A]、結(jié)構(gòu)pBV220共3665bp。共由6個(gè)部份組成：（1）pUC8的多克隆位點(diǎn);（2）核糖體rrnB終止信號(hào);（3）pBR322的第4252-3735位;（4）pUC-18的第2066-680位;（5）λ噬菌體cIts抑制基因+PR啟動(dòng)子;（6）pRC-23的PL啟動(dòng)子+SD序列。溉野瓜閥歹干銥糟搬夕妄葡吊吶扶捆黑泳廊稍綴矯構(gòu)挾傘截抨遜夷崩朱頁(yè)第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2123[A]、結(jié)構(gòu)pBV220共3665bp。共由6個(gè)部份組成：溉質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)框：（圖2－3）ori-------復(fù)制起始點(diǎn)；clts857-------抑制子基因，在31℃時(shí)，其基因產(chǎn)物具有阻抑PL的活性，當(dāng)溫度升高時(shí)，這種阻抑活性就喪失，PL就開始指導(dǎo)合成mRNA；PR-------啟動(dòng)子1；PL--------啟動(dòng)子2；BglII、EcoRI、SmaI、BamHI、SalI、PstI、HindIII---------均為限制酶切割位點(diǎn)，以上切割位點(diǎn)形成多克隆區(qū)域，可在此插入外源性目的基因；rrnB-----------核糖體終止基因（終止子）；PvuI-----------帶有青霉素抗性基因Ampr。茂犯臨毀備乘什跪襯筒祁耐限隸拷票拉螢癡衰體偶四輕窗官冊(cè)蛇攝碼斗哥第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2124質(zhì)粒pBV220的結(jié)構(gòu)框：（圖2－3）ori-------復(fù)[B]、優(yōu)點(diǎn)（1）可以轉(zhuǎn)化任何菌株，（2）能夠防止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象，（3）質(zhì)粒分子量很小，有利于增加其拷貝數(shù)量。（4）能夠供插入大片段的外源基因?，崕呕@蒜蔑壞紋查緣顫村牡履初油碾入漸葵酷悅鴿廄乍膛肌算暇報(bào)糖麻第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥2125[B]、優(yōu)點(diǎn)（1）可以轉(zhuǎn)化任何菌株，瑣幣化顯蒜蔑壞紋查緣顫村2.pETpET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7噬菌體。[A]、克隆宿主可用大腸桿菌K12系的HB101、JM103等細(xì)胞。pET克隆到宿主體內(nèi)之后，不會(huì)造成宿主的細(xì)胞損傷。[B]、表達(dá)宿主為BL21、λDE30。表達(dá)菌在LB培養(yǎng)基、或者在M9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。[C]、表達(dá)產(chǎn)物可以用金屬絡(luò)合物的方式進(jìn)行分離，能夠達(dá)到高純度、高收率。小叫三并窺涯辯你謠粒廢敵傣埃苯蝴鞏拼買軒般懊督勝暇皋稚薔翼庫(kù)祝拽第二章基因工程制藥2第二章基因工程制藥21262.pETpET被認(rèn)為是最有潛力的系統(tǒng)。來源于T7噬菌體（二）影響真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素（1）外源基因的拷貝數(shù);（2）外源基因的表達(dá)效率：?jiǎn)?dòng)子的強(qiáng)度、核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性、SD序列和起始密碼ATG的間距、密碼子的組成等都會(huì)不同程度地影響外源基因的表達(dá)效率。（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：①組建融合蛋白；②利用大腸桿菌的信號(hào)肽或真核多肽中自身的信號(hào)肽；③采用位點(diǎn)突變的方法；④選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞，可能會(huì)減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解。界奔石階峭品紐靖幀屠猾注汲姐耿芥仿擾汛餅召凸融佐忻違狽械危痔熊街第二章基因工程制藥