分子生物學(xué)分子雜交技術(shù)課件

分子雜交及生物芯片技術(shù)申川軍廣州中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室分子雜交及生物芯片技術(shù)申川軍參考書屈伸劉志國(guó)參考書屈伸劉志國(guó)2目錄

第一章生物大分子制備和分析常用技術(shù)

第二章蛋白質(zhì)、核酸的提取與分離

第三章PCR技術(shù)

第四章分子雜交與印跡技術(shù)

第五章分子克隆技術(shù)

第六章外源基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

第七章蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)

第八章分子標(biāo)技術(shù)

第九章分子改造技術(shù)

第十章測(cè)序及人工合成技術(shù)

第十一章基因組學(xué)技術(shù)

第十二章蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

第十三章生物芯片技術(shù)

第十四章生物信息學(xué)技術(shù)

目錄

3參考書馬文麗

鄭文嶺

彭翼飛

參考書馬文麗

鄭文嶺

彭翼飛

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目錄第一章核酸的分子結(jié)構(gòu)與分子雜交的基本原理第二章核酸分子雜交的類型第一節(jié)固相核酸分子雜交類型一、菌落原位雜交（colonyinsituhybridization）二、斑點(diǎn)雜交（dotblot）三、southern印跡雜交（southernblot）四、northern印跡雜交（northernblot）五、組織原位雜交（tissueinsituhybridization）第三章核酸探針的種類、標(biāo)記及檢測(cè)第一節(jié)核酸探針的種類dna探針cdna探針rna探針寡核苷酸探針第二節(jié)核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè)放射性同位素非放射性核酸探針第四章核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化探針選擇標(biāo)記方法濃度雜交率雜交最適溫度雜交的嚴(yán)格性反應(yīng)時(shí)間雜交促進(jìn)劑第五章斑點(diǎn)雜交

5第六章southern印跡雜交第一節(jié)southern印跡雜交的基本原理一、dna從凝膠到膜上的轉(zhuǎn)移方法二、southern雜交膜三、核酸探針的標(biāo)記第二節(jié)southern印跡法的基本過程一、dna樣品的酶切和電泳二、準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)移的凝膠三、dna從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物四、探針標(biāo)記五、雜交六、洗膜七、雜交結(jié)果的檢測(cè)八、雜交膜的重復(fù)使用九、注意事項(xiàng)十、雜交嚴(yán)謹(jǐn)性第七章northern印跡雜交第八章原位雜交第九章菌落原位雜交第十章dna芯片技術(shù)第六章southern印跡雜交6基本概念變性/復(fù)性：分子雜交：異源互補(bǔ)的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過程稱為分子雜交。分子雜交技術(shù)：凝膠電泳分離待測(cè)DNA、RNA、Pr并轉(zhuǎn)移固定到支持物或結(jié)合物上，然后與探針/抗體雜交分析。探針(Probe)：已知序列的標(biāo)記單鏈核酸片斷，用于檢測(cè)與其互補(bǔ)的待測(cè)核酸?；靖拍钭冃?復(fù)性：7BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).Basepairingoccursinduplex8基本概念原位雜交（Insituhybridization,ISH）：菌落原位雜交(ColonyISH)組織原位雜交(TissueISH)：胚胎原位雜交(EmbryoISH)：斑點(diǎn)/狹縫雜交(Dot/slotblot)：基本概念原位雜交（Insituhybridization9基本概念Bio-chip（生物芯片）DNAchip/microarrayGenechip/microarrayOligonucleotidemicroarraycDNAchipProteinchipmicroRNAchipLab-on-chip（芯片實(shí)驗(yàn)室）基本概念Bio-chip（生物芯片）10分子生物學(xué)分子雜交技術(shù)課件11分子生物學(xué)分子雜交技術(shù)課件12分子雜交技術(shù)生物大分子的印跡雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)生物大分子的印跡雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)定義：凝膠電泳分離待測(cè)DNA、RNA、Pr并轉(zhuǎn)移固定到結(jié)合物上，然后與探針/抗體雜交分析原理：核酸變復(fù)性（序列互補(bǔ)）/抗原-抗體基本工藝：凝膠電泳（原位處理）樣品轉(zhuǎn)移及固定雜交分析（免疫結(jié)合分析）分子雜交技術(shù)定義：凝膠電泳分離待測(cè)DNA、RNA、Pr并轉(zhuǎn)移14分子雜交技術(shù)1969，Insituhybridization（ISH）1975，Southern，Southernblot:DNA1977，Alwine，Northernblot：RNA1979，Towbin，Westernblot：Pr1982，Reinher，Easternblot：Pr(IEF)分子雜交技術(shù)1969，Insituhybridizat15分子雜交技術(shù)探針探針基本條件（特點(diǎn)）標(biāo)記物（32p,35S,125I,Digoxigenin,FITC）單鏈核酸（ssDNA，sscDNA(更常用)）高特異性（~500bp）標(biāo)記物穩(wěn)定靈敏，檢測(cè)方便安全分子雜交技術(shù)探針探針基本條件（特點(diǎn)）16分子雜交技術(shù)探針探針的種類DNAprobe（基因copy數(shù)、病原基因診斷）cDNAprobe（基因表達(dá)等最常用）RNAprobe（ISH）Oligonuleotide-probe（25~50bp；基因診斷，SNP分析、測(cè)序、點(diǎn)突變檢測(cè)）分子雜交技術(shù)探針探針的種類17分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記物放射性標(biāo)記物（[α-*N]-dNTP）32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)非放射性標(biāo)記物半抗原：生物素、地高辛熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記物18分子雜交技術(shù)探針-32P-dNTP結(jié)構(gòu)A、G、C或TNHHPP32POOOOOOHOHOHHOOOHHHHOCH2分子雜交技術(shù)探針-32P-dNTP結(jié)構(gòu)A、G、19分子雜交技術(shù)探針分子雜交技術(shù)探針20分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記隨機(jī)引物法缺口平移法(DNaseIandDNA聚合酶I)末端標(biāo)記法堿性磷酸酶-T4多核苷酸激酶[γ-32p]-ATP標(biāo)記DNA/RNA-5′末端轉(zhuǎn)移酶（poly(N*)n）T4DNA聚合酶/Klenow片斷（粘末端補(bǔ)平）分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記21分子雜交技術(shù)探針探針純化乙醇沉淀法凝膠過濾法（G-50Spincolumn）分子雜交技術(shù)探針探針純化22分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）支持物：硝酸纖維素膜（NC膜）尼龍膜N+-nylon（DNA/RNA）中性膜PVDF膜（westernblot）分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）支持物：23分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）方法：毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）方法：24分子雜交技術(shù)—印跡濕濾紙緩沖液濾紙橋凝膠硝酸纖維素膜吸水紙玻璃板支持臺(tái)容器重物毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法分子雜交技術(shù)—印跡濕濾紙緩沖液濾紙橋凝膠硝酸纖吸水紙玻璃板支25分子雜交技術(shù)—印跡尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–濾紙電極電轉(zhuǎn)移法分子雜交技術(shù)—印跡尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–26分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移法-1h分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移法-1h27分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移裝置分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移裝置28分子雜交技術(shù)—印跡Westernblot(SDS及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng))分子雜交技術(shù)—印跡Westernblot(SDS-PAG29分子雜交技術(shù)—影響因素離子強(qiáng)度(高-消除靜電斥力-利于雜交)溫度（低于Tm20-25℃）有機(jī)試劑（去離子甲酰胺）-降低Tm樣品/探針分子的大小和復(fù)雜程度洗滌條件（高嚴(yán)謹(jǐn)性，洗去非特異性結(jié)合探針）支持物添加物（吸附DNA探針，使DNA接觸面增大）分子雜交技術(shù)—影響因素離子強(qiáng)度(高-消除靜電斥力-利于雜交)30#預(yù)雜交

為減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)核酸的非特異性結(jié)合，雜交前用封閉物將這些非特異位點(diǎn)封閉。變性的非特異性DNA：常用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA。當(dāng)與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個(gè)背景覆蓋一層。由于它們與探針無(wú)同源性，在交雜反應(yīng)中可大大減少探針的非特異性結(jié)合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點(diǎn)的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。#預(yù)雜交為減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)31分子雜交技術(shù)—基本流程樣品及探針制備樣品電泳分離轉(zhuǎn)膜預(yù)雜交雜交洗膜分析（壓片、顯色、熒光觀察等）分子雜交技術(shù)—基本流程樣品及探針制備32分子雜交技術(shù)SouthernblotDNA提取酶切電泳/拍照轉(zhuǎn)膜/固定探針制備預(yù)雜交雜交洗膜掃磷屏分子雜交技術(shù)Southernblot33分子雜交技術(shù)UV交聯(lián)儀多用途254nm紫外輻射系統(tǒng)，主要用于將核酸交聯(lián)于膜上。還用于瓊脂凝膠中DNA的切割，RecA突變篩選，胸腺二聚體產(chǎn)生的部分限制性內(nèi)切酶消化，UV滅菌消除PCR污染。另紫外滅菌-聚合物紫外處理。分子雜交技術(shù)UV交聯(lián)儀多用途254nm紫34分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用DNA多態(tài)性分析（RFLP分析/SNP/SSCP/RAPD）基因突變檢測(cè)基因copy數(shù)檢測(cè)重組子篩選DNA指紋分析測(cè)序分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用35分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用DNA指紋分析血跡中的DNA分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用血跡中的DNA36分子雜交技術(shù)Northernblot基因表達(dá)分析mRNA長(zhǎng)度及半定量分析RNA分子（TRIzol）甲醛變性電泳至膜上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用10xSSC轉(zhuǎn)移RNA吸附有RNA片段的膜（亞甲藍(lán)染色）帶有RNA片段的凝膠分子雜交技術(shù)NorthernblotRNA分子（TRIz37分子雜交技術(shù)Westernblot蛋白提取/樣品準(zhǔn)備SDS電轉(zhuǎn)/麗春紅S染色封閉一抗孵育洗滌一抗二抗孵育洗膜結(jié)果觀察/顯色（Dig-AP/FITC）組織蛋白分子雜交技術(shù)Westernblot組織蛋白38分子雜交技術(shù)ISH胚胎/組織制備固定消化/再固定/洗滌RNA探針制備封閉雜交/洗滌一抗/洗滌二抗/洗滌顯色(Dig-、FITC、Cy5)抗衰老基因Klotho原位雜交圖斑馬魚krox20基因原位雜交圖3,5菱腦節(jié)分子雜交技術(shù)ISH抗衰老基因Klotho原位雜交圖斑馬魚k39分子雜交技術(shù)FISH分子雜交技術(shù)FISH40生物芯片Biochip生物芯片Biochip生物芯片定義：在斑點(diǎn)雜交基礎(chǔ)上，模擬制備大規(guī)模集成電路的基本原理，集成了探針原位合成、照明平板印刷、精密控制、激光共聚焦顯微技術(shù)發(fā)展來的一門分子生物學(xué)技術(shù)原理：將大量樣本固定于較小的支持物上，然后與標(biāo)記好的待測(cè)樣品雜交，再檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，從而判斷樣本中待測(cè)DNA、RNA、Pr等分子數(shù)量或活性狀態(tài)特點(diǎn)：高通量、微型化、集約化、標(biāo)準(zhǔn)化等生物芯片定義：在斑點(diǎn)雜交基礎(chǔ)上，模擬制備大規(guī)模集成電路的基本42生物芯片生物芯片43生物芯片種類微陣列芯片（基因芯片/蛋白芯片/細(xì)胞芯片等）微流控芯片（屬于主動(dòng)式芯片，如樣品制備芯片、PCR芯片、毛細(xì)管電泳芯片和色譜芯片等）芯片實(shí)驗(yàn)室（以生物芯片為基礎(chǔ)的集成化分析系統(tǒng);可完成如樣品制備、試劑輸送、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測(cè)、信息處理和傳遞等一系列復(fù)雜工作）生物芯片種類44生物芯片基本流程：芯片制備原位合成法原位光照蝕刻微量點(diǎn)樣法樣品制備（Sample-Cy3；Control-Cy5）分子雜交檢測(cè)分析（Confocus、CCD）生物芯片基本流程：45生物芯片原位光照蝕刻原理石英片氫化后封閉設(shè)計(jì)11um見方窗口遮罩對(duì)封閉部分光解將nt加入通過化學(xué)偶合連接到晶片上更換不同的遮罩進(jìn)行UV光解加入nt進(jìn)行化學(xué)偶合反應(yīng)重復(fù)上兩步可合成所需長(zhǎng)度及序列的寡核甘酸生物芯片原位光照蝕刻原理46生物芯片微量點(diǎn)樣制備生物芯片微量點(diǎn)樣制備47生物芯片激光共聚焦顯微鏡生物芯片激光共聚焦顯微鏡48生物芯片應(yīng)用抗體芯片（AbMicroarray380）第一張商品化的抗體芯片是由美國(guó)BDClontech公司推出的。這是一張用于研究抗體的芯片，芯片上排列了378種已知蛋白的單抗，這些單抗對(duì)應(yīng)的蛋白都是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上十分重要的蛋白，涉及信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等廣泛的領(lǐng)域。通過這張芯片，在一次實(shí)驗(yàn)中就能夠比較幾百種蛋白的表達(dá)變化生物芯片應(yīng)用抗體芯片（AbMicroarray3849生物芯片應(yīng)用測(cè)序基因芯片的測(cè)序原理圖生物芯片應(yīng)用測(cè)序基因芯片的測(cè)序原理圖50生物芯片基因表達(dá)生物芯片基因表達(dá)51生物芯片應(yīng)用基因診斷DNA結(jié)構(gòu)檢測(cè)RNA表達(dá)檢測(cè)能診斷癌癥的基因芯片生物芯片應(yīng)用基因診斷能診斷癌癥的基因芯片52生物芯片應(yīng)用藥物研究與開發(fā)與藥物代謝相關(guān)基因芯片生物芯片應(yīng)用藥物研究與開發(fā)與藥物代謝相關(guān)基因芯片53生物芯片應(yīng)用中醫(yī)藥研究中藥特性中藥藥理中藥藥效生物芯片應(yīng)用中醫(yī)藥研究54生物芯片應(yīng)用用藥個(gè)體化檢測(cè)個(gè)體化藥物治療基因檢測(cè)芯片生物芯片應(yīng)用用藥個(gè)體化檢測(cè)個(gè)體化藥物治療基因檢測(cè)芯片55分子雜交及生物芯片技術(shù)申川軍廣州中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室分子雜交及生物芯片技術(shù)申川軍參考書屈伸劉志國(guó)參考書屈伸劉志國(guó)57目錄

第一章生物大分子制備和分析常用技術(shù)

第二章蛋白質(zhì)、核酸的提取與分離

第三章PCR技術(shù)

第四章分子雜交與印跡技術(shù)

第五章分子克隆技術(shù)

第六章外源基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

第七章蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)

第八章分子標(biāo)技術(shù)

第九章分子改造技術(shù)

第十章測(cè)序及人工合成技術(shù)

第十一章基因組學(xué)技術(shù)

第十二章蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

第十三章生物芯片技術(shù)

第十四章生物信息學(xué)技術(shù)

目錄

58參考書馬文麗

鄭文嶺

彭翼飛

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目錄第一章核酸的分子結(jié)構(gòu)與分子雜交的基本原理第二章核酸分子雜交的類型第一節(jié)固相核酸分子雜交類型一、菌落原位雜交（colonyinsituhybridization）二、斑點(diǎn)雜交（dotblot）三、southern印跡雜交（southernblot）四、northern印跡雜交（northernblot）五、組織原位雜交（tissueinsituhybridization）第三章核酸探針的種類、標(biāo)記及檢測(cè)第一節(jié)核酸探針的種類dna探針cdna探針rna探針寡核苷酸探針第二節(jié)核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè)放射性同位素非放射性核酸探針第四章核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化探針選擇標(biāo)記方法濃度雜交率雜交最適溫度雜交的嚴(yán)格性反應(yīng)時(shí)間雜交促進(jìn)劑第五章斑點(diǎn)雜交

60第六章southern印跡雜交第一節(jié)southern印跡雜交的基本原理一、dna從凝膠到膜上的轉(zhuǎn)移方法二、southern雜交膜三、核酸探針的標(biāo)記第二節(jié)southern印跡法的基本過程一、dna樣品的酶切和電泳二、準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)移的凝膠三、dna從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物四、探針標(biāo)記五、雜交六、洗膜七、雜交結(jié)果的檢測(cè)八、雜交膜的重復(fù)使用九、注意事項(xiàng)十、雜交嚴(yán)謹(jǐn)性第七章northern印跡雜交第八章原位雜交第九章菌落原位雜交第十章dna芯片技術(shù)第六章southern印跡雜交61基本概念變性/復(fù)性：分子雜交：異源互補(bǔ)的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過程稱為分子雜交。分子雜交技術(shù)：凝膠電泳分離待測(cè)DNA、RNA、Pr并轉(zhuǎn)移固定到支持物或結(jié)合物上，然后與探針/抗體雜交分析。探針(Probe)：已知序列的標(biāo)記單鏈核酸片斷，用于檢測(cè)與其互補(bǔ)的待測(cè)核酸?；靖拍钭冃?復(fù)性：62BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra-andinter-molecularinteractionsinsingle-strandedRNA(orDNA).Basepairingoccursinduplex63基本概念原位雜交（Insituhybridization,ISH）：菌落原位雜交(ColonyISH)組織原位雜交(TissueISH)：胚胎原位雜交(EmbryoISH)：斑點(diǎn)/狹縫雜交(Dot/slotblot)：基本概念原位雜交（Insituhybridization64基本概念Bio-chip（生物芯片）DNAchip/microarrayGenechip/microarrayOligonucleotidemicroarraycDNAchipProteinchipmicroRNAchipLab-on-chip（芯片實(shí)驗(yàn)室）基本概念Bio-chip（生物芯片）65分子生物學(xué)分子雜交技術(shù)課件66分子生物學(xué)分子雜交技術(shù)課件67分子雜交技術(shù)生物大分子的印跡雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)生物大分子的印跡雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)定義：凝膠電泳分離待測(cè)DNA、RNA、Pr并轉(zhuǎn)移固定到結(jié)合物上，然后與探針/抗體雜交分析原理：核酸變復(fù)性（序列互補(bǔ)）/抗原-抗體基本工藝：凝膠電泳（原位處理）樣品轉(zhuǎn)移及固定雜交分析（免疫結(jié)合分析）分子雜交技術(shù)定義：凝膠電泳分離待測(cè)DNA、RNA、Pr并轉(zhuǎn)移69分子雜交技術(shù)1969，Insituhybridization（ISH）1975，Southern，Southernblot:DNA1977，Alwine，Northernblot：RNA1979，Towbin，Westernblot：Pr1982，Reinher，Easternblot：Pr(IEF)分子雜交技術(shù)1969，Insituhybridizat70分子雜交技術(shù)探針探針基本條件（特點(diǎn)）標(biāo)記物（32p,35S,125I,Digoxigenin,FITC）單鏈核酸（ssDNA，sscDNA(更常用)）高特異性（~500bp）標(biāo)記物穩(wěn)定靈敏，檢測(cè)方便安全分子雜交技術(shù)探針探針基本條件（特點(diǎn)）71分子雜交技術(shù)探針探針的種類DNAprobe（基因copy數(shù)、病原基因診斷）cDNAprobe（基因表達(dá)等最常用）RNAprobe（ISH）Oligonuleotide-probe（25~50bp；基因診斷，SNP分析、測(cè)序、點(diǎn)突變檢測(cè)）分子雜交技術(shù)探針探針的種類72分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記物放射性標(biāo)記物（[α-*N]-dNTP）32p(14d)、35S(87d)、3H(12y)、125I(60d)非放射性標(biāo)記物半抗原：生物素、地高辛熒光素：異硫氰酸熒光素（FITC）分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記物73分子雜交技術(shù)探針-32P-dNTP結(jié)構(gòu)A、G、C或TNHHPP32POOOOOOHOHOHHOOOHHHHOCH2分子雜交技術(shù)探針-32P-dNTP結(jié)構(gòu)A、G、74分子雜交技術(shù)探針分子雜交技術(shù)探針75分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記隨機(jī)引物法缺口平移法(DNaseIandDNA聚合酶I)末端標(biāo)記法堿性磷酸酶-T4多核苷酸激酶[γ-32p]-ATP標(biāo)記DNA/RNA-5′末端轉(zhuǎn)移酶（poly(N*)n）T4DNA聚合酶/Klenow片斷（粘末端補(bǔ)平）分子雜交技術(shù)探針探針標(biāo)記76分子雜交技術(shù)探針探針純化乙醇沉淀法凝膠過濾法（G-50Spincolumn）分子雜交技術(shù)探針探針純化77分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）支持物：硝酸纖維素膜（NC膜）尼龍膜N+-nylon（DNA/RNA）中性膜PVDF膜（westernblot）分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）支持物：78分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）方法：毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法分子雜交技術(shù)—印跡印跡（轉(zhuǎn)膜）方法：79分子雜交技術(shù)—印跡濕濾紙緩沖液濾紙橋凝膠硝酸纖維素膜吸水紙玻璃板支持臺(tái)容器重物毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法分子雜交技術(shù)—印跡濕濾紙緩沖液濾紙橋凝膠硝酸纖吸水紙玻璃板支80分子雜交技術(shù)—印跡尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–濾紙電極電轉(zhuǎn)移法分子雜交技術(shù)—印跡尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+–81分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移法-1h分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移法-1h82分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移裝置分子雜交技術(shù)—印跡真空轉(zhuǎn)移裝置83分子雜交技術(shù)—印跡Westernblot(SDS及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng))分子雜交技術(shù)—印跡Westernblot(SDS-PAG84分子雜交技術(shù)—影響因素離子強(qiáng)度(高-消除靜電斥力-利于雜交)溫度（低于Tm20-25℃）有機(jī)試劑（去離子甲酰胺）-降低Tm樣品/探針分子的大小和復(fù)雜程度洗滌條件（高嚴(yán)謹(jǐn)性，洗去非特異性結(jié)合探針）支持物添加物（吸附DNA探針，使DNA接觸面增大）分子雜交技術(shù)—影響因素離子強(qiáng)度(高-消除靜電斥力-利于雜交)85#預(yù)雜交

為減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)核酸的非特異性結(jié)合，雜交前用封閉物將這些非特異位點(diǎn)封閉。變性的非特異性DNA：常用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA。當(dāng)與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個(gè)背景覆蓋一層。由于它們與探針無(wú)同源性，在交雜反應(yīng)中可大大減少探針的非特異性結(jié)合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點(diǎn)的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。#預(yù)雜交為減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)86分子雜交技術(shù)—基本流程樣品及探針制備樣品電泳分離轉(zhuǎn)膜預(yù)雜交雜交洗膜分析（壓片、顯色、熒光觀察等）分子雜交技術(shù)—基本流程樣品及探針制備87分子雜交技術(shù)SouthernblotDNA提取酶切電泳/拍照轉(zhuǎn)膜/固定探針制備預(yù)雜交雜交洗膜掃磷屏分子雜交技術(shù)Southernblot88分子雜交技術(shù)UV交聯(lián)儀多用途254nm紫外輻射系統(tǒng)，主要用于將核酸交聯(lián)于膜上。還用于瓊脂凝膠中DNA的切割，RecA突變篩選，胸腺二聚體產(chǎn)生的部分限制性內(nèi)切酶消化，UV滅菌消除PCR污染。另紫外滅菌-聚合物紫外處理。分子雜交技術(shù)UV交聯(lián)儀多用途254nm紫89分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用DNA多態(tài)性分析（RFLP分析/SNP/SSCP/RAPD）基因突變檢測(cè)基因copy數(shù)檢測(cè)重組子篩選DNA指紋分析測(cè)序分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用90分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用DNA指紋分析血跡中的DNA分子雜交技術(shù)Southernblot應(yīng)用血跡中的DNA91分子雜交技術(shù)Northernblot基因表達(dá)分析mRNA長(zhǎng)度及半定量分析RNA分子（TRIzol）甲醛變性電泳至膜上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用10xSSC轉(zhuǎn)移RNA吸附有RNA片段的膜（亞甲藍(lán)染色）帶有RNA片段的凝膠分子雜交技術(shù)NorthernblotRNA分子（TRIz92分子雜交技術(shù)Westernblot蛋白提取/樣品準(zhǔn)備SDS電轉(zhuǎn)/麗春紅S染色封閉一抗孵育洗滌一抗二抗孵育洗膜結(jié)果觀察/顯色（Dig-AP/FITC）組織蛋白分子雜交技術(shù)Westernblot組織蛋白93分子雜交技術(shù)ISH胚胎/組織制備固定消化/再固定/洗滌RNA探針制備封閉雜交/洗滌一抗/洗滌二抗/洗滌顯色(Dig-、FITC、Cy5)抗衰老基因Klotho原位雜交圖斑馬魚krox20基因原位雜交圖3,5菱腦節(jié)分子雜交技術(shù)ISH抗衰老基因Klotho原位雜交圖斑馬魚k94分子雜交