第四章 微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(制藥工程)

1、第四章 細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)4.1 微生物反應(yīng)過程的質(zhì)量和能量衡算4.1.1 微生物反應(yīng)過程的質(zhì)量衡算微生物反應(yīng)中參與反應(yīng)的培養(yǎng)基成分多，反應(yīng)途徑復(fù)雜。如果把微生物反應(yīng)看成是生成多種產(chǎn)物的復(fù)合反應(yīng)：碳源+氧+氮源=菌體+有機(jī)產(chǎn)物+二氧化碳+水CHmOn+aO2+bNH3cCHxOyNz+dCHuOvNw+eCO2+fH2O呼吸商：呼吸商：細(xì)胞生長(zhǎng)過程中放出的CO2與消耗的O2的摩爾比消耗速率產(chǎn)生速率2222/OCOOOCOYRQ22CO式中: CO2 為一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)放出的CO2量(mol、Kmol) ；4.1.2 微生物反應(yīng)過程的得率系數(shù)n得率系數(shù)是對(duì)碳源等物質(zhì)生成細(xì)胞或其他產(chǎn)物

2、的潛力進(jìn)行定量評(píng)價(jià)的重要參數(shù)。消耗1克基質(zhì)生成細(xì)胞的克數(shù)稱為細(xì)胞得率或生長(zhǎng)得率。SXSXmmY消耗基質(zhì)的質(zhì)量生成細(xì)胞的質(zhì)量/SXSXrrdtSddtdXSddXY/ /n對(duì)底物的細(xì)胞得率系數(shù)n對(duì)底物的產(chǎn)物得率系數(shù)SSPYmmP/消耗基質(zhì)的質(zhì)量生成代謝產(chǎn)物的質(zhì)量n與碳元素相關(guān)的得率系數(shù)YC：當(dāng)基質(zhì)為碳源，一部分被同化為細(xì)胞組成成分，其余部分被異化分解為CO2和代謝產(chǎn)物。SXSXSSXXCYmmY/)(基質(zhì)含碳量消耗基質(zhì)的質(zhì)量細(xì)胞含碳量生成細(xì)胞的質(zhì)量X XC C和和S SC C-單位質(zhì)量細(xì)胞的含碳量和單位質(zhì)量基質(zhì)的含碳量單位質(zhì)量細(xì)胞的含碳量和單位質(zhì)量基質(zhì)的含碳量n與氧相關(guān)的得率系數(shù)YO：生成細(xì)胞質(zhì)

3、量與消耗氧的比值。消耗氧的質(zhì)量生成細(xì)胞的質(zhì)量OY舉例：C6H12O6+aO2+bNH3cC4.4OH7.3N0.86O1.2+dH2O+eCO2已知：葡萄糖中的碳2/3轉(zhuǎn)化為細(xì)胞中的碳1.1.計(jì)算計(jì)算c c值值2.2.計(jì)算計(jì)算e e值值3.3.根據(jù)原子的平衡關(guān)系計(jì)算根據(jù)原子的平衡關(guān)系計(jì)算b,d,ab,d,a值值4.4.求求Y YX/SX/S5.5.求求Y YX/OX/O4.2 細(xì)胞生長(zhǎng)的非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)4.2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)描述方法（1）微生物反應(yīng)過程細(xì)胞群體 細(xì)菌群體的復(fù)雜性細(xì)菌群體的復(fù)雜性：通常1mL培養(yǎng)液中含有107108個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞都經(jīng)歷生長(zhǎng)、成熟、衰亡的過程，同時(shí)伴有退化、變異多

4、多 相：相：體系中有液相、固相、氣相，性質(zhì)不同，相內(nèi)、相間有反應(yīng)、傳質(zhì)多組份：多組份：細(xì)胞組成復(fù)雜,蛋白質(zhì)、脂肪、糖、核酸、維生素、無機(jī)鹽、水等,培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物，代謝產(chǎn)物非線性：非線性：生化反應(yīng)過程復(fù)雜,不能用線性方程描述（2）細(xì)菌群體描述的簡(jiǎn)化微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是對(duì)細(xì)菌群體而言，而不是對(duì)單一細(xì)胞不考慮細(xì)胞之間的差異，性質(zhì)上取平均值。此模型為確定論模型；考慮細(xì)胞之間的差異為概率論模型把細(xì)胞視為單組成，忽略環(huán)境變化對(duì)菌體組成的影響，所建立的模型為非結(jié)構(gòu)性模型.它是在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上建立的經(jīng)驗(yàn)或半經(jīng)驗(yàn)關(guān)聯(lián)模型假設(shè)細(xì)胞生長(zhǎng)過程，各子成份均以相同的比例生長(zhǎng)把細(xì)胞和培養(yǎng)液視為一相（液相）,不考慮培養(yǎng)液和

5、細(xì)胞之間的物質(zhì)傳遞作用,即均一化模型對(duì)細(xì)胞群體的描述模型 （3）反應(yīng)速率的定義 絕對(duì)速率dtdcrXXdtdcrdtdcr22OOSS dtdHrdtdcrdtdcrVHCOCOPPV22 相對(duì)速率細(xì)胞生長(zhǎng)比速率細(xì)胞生長(zhǎng)比速率底物消耗比速率底物消耗比速率氧消耗比速率氧消耗比速率產(chǎn)物生成比速率產(chǎn)物生成比速率反應(yīng)熱生成比速率反應(yīng)熱生成比速率 hJ/kg q h h h h -1-1-1-1dtdHc1dtdcc1qdtdcc1qdtdcc1qdtdcc1VxHPXPOxOSxSxxV22比速率與催化活性物質(zhì)的量有關(guān)。因此比速率的大小反映了細(xì)胞活力的大小。比速率與催化活性物質(zhì)的量有關(guān)。因此比速率的大

6、小反映了細(xì)胞活力的大小。4.2.2 無抑制細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)式中式中:cS限制性底物質(zhì)量濃度，限制性底物質(zhì)量濃度，g/L；Ks飽和常數(shù)，其值等于生長(zhǎng)比速率恰為最大生長(zhǎng)比速率的濃度一半時(shí)飽和常數(shù)，其值等于生長(zhǎng)比速率恰為最大生長(zhǎng)比速率的濃度一半時(shí)的限制性底物濃度。的限制性底物濃度。SSSmaxcKc 當(dāng)限制性底物濃度很低時(shí)，當(dāng)限制性底物濃度很低時(shí)，csKs時(shí)，若繼續(xù)提高底物濃度，細(xì)胞生長(zhǎng)速率基本不變。時(shí)，若繼續(xù)提高底物濃度，細(xì)胞生長(zhǎng)速率基本不變。此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)比速率與底物濃度無關(guān)，為零級(jí)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)比速率與底物濃度無關(guān)，為零級(jí)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。SSmaxcKXmaxxcrSSSmaxcKcXSSS

7、maxXxxccKccdtdcr18)-(4 St0S0XXtS/XccccY48)-(4 )cc (Y1cc0XXS/X0SS50)-(4 XXS/X0SSXS/X0SmaxxccY1cKcY1cr49)-(4 X0XXS/X0SS0XXS/X0Smaxxc)cc (Y1cK)cc (Y1crLttSSSecKc/max102 . 4 . 2 . 4Xdxxckdtdcr穩(wěn)定期動(dòng)力學(xué)Xdxdckdtdcr細(xì)胞死亡動(dòng)力學(xué)3 . 4 . 2 . 44.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)延遲期、穩(wěn)定期、死亡起和細(xì)胞維持動(dòng)力學(xué)細(xì)胞生長(zhǎng)延遲期、穩(wěn)定期、死亡起和細(xì)胞維持動(dòng)力學(xué)4.2.4.1 延遲期動(dòng)力學(xué)延遲期動(dòng)力學(xué)Xxd

8、cdtdcrm4 . 4 . 2 . 4細(xì)胞維持期動(dòng)力學(xué)4.2.5 溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響RTEdRTEXdxxdaeAkAeckdtdcr/0/4.3 底物消耗與產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)4.3.1 底物消耗動(dòng)力學(xué)碳源碳源簡(jiǎn)單的碳化合物簡(jiǎn)單的碳化合物能量以能量以ATP形式儲(chǔ)存形式儲(chǔ)存分解分解氧氧從細(xì)胞排出從細(xì)胞排出COCO2 2和水和水新細(xì)胞物質(zhì)新細(xì)胞物質(zhì)以復(fù)雜的生以復(fù)雜的生化物質(zhì)排除化物質(zhì)排除維持能量供給維持能量供給圖圖4-10 細(xì)胞中碳的利用及能置的來源與消耗途徑細(xì)胞中碳的利用及能置的來源與消耗途徑(1) 底物消耗速率與消耗比速率底物消耗速率與消耗比速率16)-(4 /Sx

9、SxSxSXrrdtdmdtdmdmdmY72)-(4 XsssmaxS/XXS/XXS/XSccKcY1cY1rY1r73)-(4 sssmaxS/XSXScKcY1rc1qmaxS/Xmax, SY1：q令74)-(4 sssmax,SScKcqq底物最大消耗比速率底物最大消耗比速率底物底物消耗消耗比速率比速率 單位體積培養(yǎng)液中的細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)攝取單位體積培養(yǎng)液中的細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)攝取(消耗消耗)氧的氧的量稱為攝氧率量稱為攝氧率(OUR)或氧的消耗速率，可表示為：或氧的消耗速率，可表示為：75)-(4 XO/XOrY1r276)-(4 O/XOY1q2與細(xì)胞濃度之比，為耗氧比速率，或稱為

10、呼吸強(qiáng)度。與細(xì)胞濃度之比，為耗氧比速率，或稱為呼吸強(qiáng)度。2Or77)-(4 XOOcqr22 當(dāng)?shù)孜锛仁悄茉从质翘荚磿r(shí)、就應(yīng)考慮維持能所消耗的當(dāng)?shù)孜锛仁悄茉从质翘荚磿r(shí)、就應(yīng)考慮維持能所消耗的底物。維持能用于維持其滲透壓，修復(fù)底物。維持能用于維持其滲透壓，修復(fù)DNA、RNA和其他大和其他大分子。維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生命活性。因此，對(duì)底物消耗動(dòng)力分子。維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生命活性。因此，對(duì)底物消耗動(dòng)力學(xué)方程中必須考慮維持能這一項(xiàng)。學(xué)方程中必須考慮維持能這一項(xiàng)。 底物消耗速率可表示為底物消耗速率可表示為(2) 包括維持能的底物消耗動(dòng)力學(xué)包括維持能的底物消耗動(dòng)力學(xué)78)-(4 XXS/X*SmcrY1rSGx

11、*S/XmmY72)-(4 XsssmaxS/XXS/XXS/XSccKcY1cY1rY1rXSXSrYr/14.3.2 代謝產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)一相關(guān)模型： 是指產(chǎn)物的生成與細(xì)胞的生長(zhǎng)過程相關(guān)，即產(chǎn)物通常是基質(zhì)的分解代謝產(chǎn)物(如乙醇發(fā)酵)或代謝過程的中間產(chǎn)物(如氨基酸發(fā)酵),代謝產(chǎn)物的生成與細(xì)胞的生長(zhǎng)是同步的。 產(chǎn)物的生成速率為： XX/PXX/PPPcYrYdtdcrX/PPYq等式兩邊除以X，則有：Pq說明：第一項(xiàng)與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)，第二項(xiàng)無關(guān) ；、由細(xì)胞生理特性與生長(zhǎng)條件而定，只有通過對(duì)不同的細(xì)胞代謝過程進(jìn)行研究，才能找出其與細(xì)胞生長(zhǎng)條件、環(huán)境因素的關(guān)系。 二部分相關(guān)模型： 產(chǎn)物的生成與細(xì)胞生長(zhǎng)

12、部分相關(guān)。動(dòng)力學(xué)方程為：XXPcrr三非相關(guān)模型： 產(chǎn)物的生成與細(xì)胞的生長(zhǎng)無直接關(guān)系，特點(diǎn)是當(dāng)細(xì)胞處于生長(zhǎng)階段時(shí)，并無產(chǎn)物積累，而當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)停止后，產(chǎn)物卻大量生成 。4.4 微生物受熱死亡動(dòng)力學(xué)生物體種類相對(duì)耐熱性營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞及酵母噬菌體和病毒霉菌孢子細(xì)菌芽孢各種不同微生物在含濕加熱時(shí)所呈現(xiàn)的相對(duì)耐熱性各種不同微生物在含濕加熱時(shí)所呈現(xiàn)的相對(duì)耐熱性設(shè)計(jì)滅菌操作，必須以細(xì)菌芽孢作為殺滅對(duì)象，因?yàn)橐獨(dú)缌搜挎?，其他雜菌一定也殺滅。這一點(diǎn)，既是食品滅菌的依據(jù)，同時(shí)也是發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌操作的基礎(chǔ)。n微生物受熱死亡的原因主要是因高溫使微生物體內(nèi)的一些重要蛋白質(zhì)，如酶等發(fā)生變性，從而導(dǎo)致微生物無法生存而死亡。n微

13、生物受熱死亡的規(guī)律有很多類型，但常見的是對(duì)數(shù)死亡律，也稱對(duì)數(shù)殘存律。-dN/dt=kN其中：N是活菌體濃度，以活菌體個(gè)數(shù)/mlK是比死亡速率常數(shù)，min-1t是時(shí)間對(duì)數(shù)死亡律-dN/dt=kNln(N/N0)=-ktN=N0exp(-kt)t=2.303log(N/N0)/kk值反應(yīng)了微生物耐熱性的強(qiáng)弱，越小表明微生物越不易熱死；反之越易熱死。生物體種類k值營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞及酵母細(xì)菌芽孢各種不同微生物各種不同微生物k值值dNR/dt=-kRNRdNS/dt=-krNR-kSNSkr耐熱芽孢的比失活速率常數(shù)，kS耐敏感中間芽孢的比失活速率常數(shù)，聯(lián)立求解微分方程組的：N/N0=kRexp(kSt)-kS/

14、krexp(-krt)/(kR-kS)死亡速率常數(shù)k與溫度的關(guān)系，可用阿累尼烏斯公式來表示： K=Aexp(-E/RT)或 lnK=lnA- E/RTA:A:頻率常數(shù)，頻率常數(shù)，min-1min-1EE：死亡活化能，：死亡活化能，J/molJ/molT T：絕對(duì)溫度：絕對(duì)溫度R R：氣體常數(shù)：氣體常數(shù)E/RE/R：微生物受熱死亡時(shí)對(duì)溫度敏感性的度量，越大，隨溫度的變化越敏感。：微生物受熱死亡時(shí)對(duì)溫度敏感性的度量，越大，隨溫度的變化越敏感。絕對(duì)溫度的倒數(shù)，1/T對(duì)數(shù)比死亡速率常數(shù)，lnk斜率， -E/Rn當(dāng)培養(yǎng)基加熱滅菌時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)雜菌被殺滅的同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也被破壞，如何解決這一矛盾？n對(duì)表達(dá)式

15、lnK=lnA- E/(RT)取微分：dlnK=- E/Rd(1/T)方程中，E越大，對(duì)于同樣的d(1/T)， dlnK變化越大。n微生物受熱死亡的活化能一般要比營(yíng)養(yǎng)成分熱分解的活化能大的多，這就意味著當(dāng)溫度升高時(shí)，微生物的死亡速率要比營(yíng)養(yǎng)成分的破壞速率增加的多，這就是為什么采用高溫、瞬時(shí)滅菌-HTST (High Temperature Short Time)。n一般芽孢的E約為293100J/mol，營(yíng)養(yǎng)成分的E約為83740J/mol。n嗜熱脂肪芽孢桿菌的死亡和維生素B1的熱分解距離：溫度從105 升高到130 ，芽孢的K值將從0.1min-1增加至26.82min-1，增大268268

16、倍；但同樣的溫度變化， B1的K值從0.019min-1增加至0.117min-1，增大6.166.16倍。滅菌溫度， 需要的滅菌時(shí)間，min維生素B1的損失，%1001001101101201201301301401401501501232123211411411.811.81.371.370.1770.1770.02520.025299.9999.9995.795.749.649.614.814.83.953.951.01.0不同滅菌溫度和不同滅菌時(shí)間下，維生素不同滅菌溫度和不同滅菌時(shí)間下，維生素B1B1的破壞對(duì)照的破壞對(duì)照滅菌度滅菌度N/NN/N0 0=10=10-16-164.5 培養(yǎng)

17、基滅菌的工程設(shè)計(jì)整個(gè)滅菌過程由加熱、保溫和冷卻三個(gè)階段組成，每一階段均有菌體的死亡，整個(gè)間歇過程的滅菌作用是這三個(gè)階段的總和。ttdtRTEAkdtNN000)/exp(ln總ttdtRTEAkdtNN000)/exp(ln總在保溫階段，K為常數(shù)，可以直接積分，在升溫和冷卻階段K是變化的，即溫度T是時(shí)間的函數(shù)，而且這些經(jīng)驗(yàn)函數(shù)關(guān)系非常復(fù)雜（一般不推介使用這些公式），積分過程很復(fù)雜，往往使用數(shù)值法求解；加熱和冷卻可以從一些手冊(cè)中查得。TTNVVNNN00lnln總VT培養(yǎng)基的總體積；N0VT每批培養(yǎng)基開始的雜菌總數(shù)； NVT培養(yǎng)基滅菌后的雜菌數(shù)。如果殘留一個(gè)雜菌，如果營(yíng)養(yǎng)物充足，經(jīng)過24小時(shí)，倍

18、增時(shí)間20分鐘計(jì)算，這個(gè)雜菌將繁殖成 (2)72;如果一個(gè)雜菌不留，則NVT=0，這也辦不到，如果達(dá)到此滅菌度，滅菌時(shí)間需無窮大；實(shí)際計(jì)算中常常取NVT=10-3，表示1000次發(fā)酵中，將可能由于滅菌不當(dāng)而殘留一個(gè)雜菌。NVT通常根據(jù)操作難易、滅菌費(fèi)用、產(chǎn)品和培養(yǎng)基的代價(jià)等多方面因素決定。加熱階段保溫階段冷卻階段一般來講，完成整個(gè)滅菌周期約3-5小時(shí)，各階段對(duì)滅菌的貢獻(xiàn)大致如下：加熱/ 總=0.20;保溫/ 總=0.75；保溫/ 總=0.05盡量縮短加熱時(shí)間，可減少營(yíng)養(yǎng)物的減少。n與間歇滅菌相同，連續(xù)滅菌也需要加熱、保溫和冷卻三個(gè)階段；n間歇滅菌這三個(gè)階段在空間上相同，在時(shí)間上不同；n連續(xù)滅菌

19、這三個(gè)過程同時(shí)發(fā)生，但在空間上不同，因此需要有加熱設(shè)備、保溫設(shè)別和冷卻設(shè)備。4.5 細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的估計(jì)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的目的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的目的1.確定反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度之間的函數(shù)關(guān)系，這實(shí)際上是確立速率方確定反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度之間的函數(shù)關(guān)系，這實(shí)際上是確立速率方程的基本形式；程的基本形式；2.確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)，例如細(xì)胞反應(yīng)器中的確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)，例如細(xì)胞反應(yīng)器中的Ks和和max的值；的值；3.確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)與反應(yīng)條件，例如溫度、確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)與反應(yīng)條件，例如溫度、pH等因素的關(guān)系。等因素的關(guān)系。動(dòng)力學(xué)方程是否合適，動(dòng)力學(xué)參數(shù)的值是否正確，取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)力學(xué)方程是否合適，動(dòng)力學(xué)參數(shù)的值是否正確，取