免疫分析方法課件

免疫分析方法免疫分析方法1

免疫學方法在食品分析中正得到越來越廣泛的運用，其中酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）已經(jīng)在食品工業(yè)中廣泛應用，它能夠用于測定人們希望含有的物質，以及不希望含有的物質。例如現(xiàn)在人們所關注的食品安全性問題中一些物質的檢測：殺蟲劑、藥物殘留物、激素、生長素、微生物毒素、真菌毒素或腸毒素、天然毒素，以及一些添加劑。免疫分析法具備有效的靈敏度、特異性、快速和低成本的優(yōu)點；可對大量的樣品進行常規(guī)分析；能夠用于樣品的定性篩選，也能夠對樣品進行定量測定以確定樣品中待測組分的含量。免疫分析技術免疫學方法在食品分析中正得到越來越廣泛的運用，2免疫分析技術的分類標記免疫分析技術非標記的免疫分析技術免疫擴散免疫電泳酶聯(lián)免疫分析放射免疫分析熒光免疫技術化學發(fā)光免疫技術膠體金免疫技術免疫分析技術的分類標記免疫分析技術非標記的免疫分析技術免疫3

抗原及相應的抗體分子在凝膠中擴散相遇，達到合適濃度比例時形成抗原抗體復合體沉淀的技術。可以檢測特定的抗原或抗體?？乖c抗體成分的一種定性與半定量分析方法，通常采用半固態(tài)透明瓊脂凝膠作為支持介質。置于孔中的抗原和抗體相向擴散，在兩者濃度比例適當處相遇后如能結合形成復合物則形成沉淀線。分為單向擴散（singleimmunodiffusion）、放射狀擴散（radialimmunodiffusion）和雙向擴散（doubleimmunodiffusion）等。1.1免疫擴散1、非標記免疫分析技術抗原及相應的抗體分子在凝膠中擴散相遇，達到合4實驗原理

可溶性抗原和相應抗體在含有電解質的瓊脂凝膠中擴散相遇，特異性地結合，在比例合適處，形成肉眼可見的沉淀物的一種免疫血清學技術。（一）單向擴散實驗一種定量實驗，將一定量的抗體混合于瓊脂內，傾注于玻片上，凝固后，在瓊脂層上打孔，再將抗原加入孔中，使其向四周擴散?？乖贵w復合物形成的沉淀環(huán)直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標準抗原制成標準曲線，則未知標本中的抗原含量即可從標準曲線中求出。本實驗主要用于檢查標本中各種免疫球蛋白和血清IgG含量。（二）雙向擴散實驗抗原抗體在一定pH和離子存在的瓊脂糖凝膠中相向擴散，一定時間后，兩者相遇而形成不明顯的抗原抗體聚合物并繼續(xù)擴散，當擴散至兩者的適當比例時便形成大的抗原抗體復合物而出現(xiàn)明顯沉淀，形成垂直于擴散方向的免疫沉淀線即等價線。實驗原理51.2免疫電泳免疫電泳是一種將區(qū)帶電泳和雙向免疫擴散相結合的免疫化學分析技術。1.2免疫電泳免疫電泳是一種將區(qū)帶電泳和雙向免疫擴散相結合6

實驗原理先將抗原樣品在瓊脂平板上進行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而被分離成肉眼不可見的區(qū)帶。停止電泳后，在與電泳方向平行的槽內加入相應抗血清，使抗原和抗體呈雙向擴散，已分離的各抗原與相應抗體在瓊脂中擴散而相遇，在二者比例合適處形成肉眼可見的沉淀弧。實驗原理先將抗原樣品在瓊脂平板上進行電泳7根據(jù)沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與已知標準抗原進行比較，可分析、鑒定樣品中所含的抗原成分及其性質。根據(jù)沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與已知標準抗原進行比較，可分析、8

采用熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應，通過對免疫復合物中的標記物的測定，達到對免疫反應進行監(jiān)測的目的。2、免疫標記技術采用熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體（或92.1酶聯(lián)免疫法免疫酶技術：把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理有機地結合起來。它具有免疫熒光試驗和放射免疫試驗的優(yōu)點，并克服上述兩種方法的缺點。酶標記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長，免疫酶技術的敏感性接近放射免疫試驗，可直接肉眼觀察也可借助簡單的儀器作定量測定，所得結果比較客觀。2.1酶聯(lián)免疫法免疫酶技術：把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催10ELISA的基本原理和方法ELISA的種類和變化ELISA的特點ELISA的應用實例酶聯(lián)免疫吸附法ELISAELISA的基本原理和方法ELISA的種類和變化ELI11基本原理

ELISA是一種免疫測定（immunoassay，IA）基礎:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，由此進行定性或定量分析。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）基本原理12酶及其底物

酶結合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結的產物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應。酶及其底物13免疫分析方法課件14ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素的ELISA

ELISA的種類和變化（一）雙抗體夾心法15（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原16步驟：A將已知抗體吸附于載體上，溫育后清洗；B加入待檢標本溶液，使溶液中的抗原與吸附的抗體結合，溫育后清洗；C加入酶標記特異性抗體，溫育后清洗；D加入酶作用底物，產生顯色反應，顏色的改變與所加的待檢標本溶液中的抗原量成正比。步驟：17間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢18步驟：A將已知可溶性抗原吸附于載體（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），經(jīng)溫育后清洗；B加入待檢稀釋血清，若血清中有相應特異性抗體存在則與吸附的抗原結合，溫育后清洗；C加入酶標記的抗球蛋白抗體，此時酶標記抗抗體與吸附的抗原抗體復合物結合，溫育后清洗；D加入酶作用底物（或稱基質），酶分解底物并顯色，用光電比色計測定底物顯色深淺，即可推知抗體量。步驟：19（三）競爭法

此法可用于檢測小分子抗原。（三）競爭法此法可用于檢測小分子抗原。20步驟：A將已知抗體吸附于固相載體表面，溫育后清洗；B將可能含抗原的待檢溶液和酶標記的已知抗原溶液以適當比例混合，加入已包被的載體孔中，溫育后清洗；C加入酶作用的底物，產生顯色反應。色深表示結合的酶標記抗原多，而待檢溶液中未標記的抗原量少；反之，色淺表示結合的酶標記抗原少，而待檢溶液中抗原量多。步驟：21ELISA特點特點一：靈敏性該測定法的靈敏度來自酶。眾所周知,酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應，產生可供觀察的顯色反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。特點二：特異性其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。

ELISA特點22飼料安全檢測農藥的檢測疾病診斷ELISA應用實例

飼料安全檢測農藥的檢測疾病診斷ELISA應用實例

23

飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）

甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測中的應用ELISA用于農藥殘留的檢測飼料中鹽酸克倫特羅的測定甲胺磷殘留分析ELISA在飼料24河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農藥的檢測：河豚毒素植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘主要有除25ELISA檢測“非典型肺炎”冠狀病毒ELISA在結締組織病早期診斷中的應用檢測抗異質性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風濕性關節(jié)炎（PtA）33抗體ELISA在疾病診斷中的作用ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體ELISA檢測“非典型肺炎”冠狀病毒ELISA在結締26ELISA法測定SARS抗體效價SARS抗體效價的測定．目前國內外報道的定性檢測方法主要有：間接免疫熒光法(IFA)、病毒中和蝕斑法和ELISA方法。由于ELISA方法具有靈敏度高，操作簡便，樣本處理量大，可定量測定等優(yōu)點。我們選擇了ELISA法進行改進．建立了SARSIgG抗體效價定量測定的方法。經(jīng)初步驗證，該方法的穩(wěn)定性、準確度、重復性、精密度、特異性、線性和范圍等均能達到免疫學定量測定方法的要求．適用于血漿及靜脈注射用人SARS免疫球蛋白制品的SARSIgG抗體效價檢測和質量控制。ELISA法測定SARS抗體效價27ELISA試劑盒商業(yè)資訊ELISA試劑盒商業(yè)資訊28ELISA試劑盒ELISA試劑盒29免疫分析方法課件30DNM-9602G酶標分析儀DNM-9602標配酶標分析儀

DNM-9602A酶標分析儀幾種酶標分析儀DNM-9602G酶標分析儀DNM-9602標配酶標分析儀312.2放射免疫標記技術放射免疫測定（radioimmunoassay，RIA）是1959年由Berson和Yalow首先用于糖尿病患者胰島素含量的測定，是一種將同位素分析的靈敏性和抗原抗體反應的特異性這兩大特點結合起來的免疫標記測定技術。女科學家R.Yalow（美,1921~）1950’末發(fā)明（胰島素），1977年獲諾貝爾醫(yī)學獎2.2放射免疫標記技術放射免疫測定（radioimmunoa32放射免疫優(yōu)缺點其優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、精確性好、樣品用量少，而且不需要復雜的提純步驟。缺點是需要特殊的儀器設備和一定的防護條件，而且有些同位素標記物的半衰期較短以及試驗廢物難以處理，對環(huán)境造成放射性污染。放射免疫優(yōu)缺點33基本原理放射免疫測定是建立在待測抗原和標記抗原對有限量抗體進行競爭性結合的基礎上。待測抗原是指人體內某種微量活性物質（如微生物＆寄生蟲抗原、激素、維生素、酶、藥物等），而標記抗原使將已知的上述物質標記上放射性同位素，具有示蹤作用。（1）競爭結合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：常用標記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年測量儀器（1）γ計數(shù)儀（2）β液閃儀免疫分析方法課件34放射免疫分析的臨床應用臨床常用近200種（1）腫瘤相關抗原的測定：AFP、CEA、CA199、CA-125、CA153、CA724、CYFRA211、PSA等（2）激素的測定：下丘腦-垂體-甲狀腺軸激素，下丘腦-垂體-性腺軸激素，下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸激素，胃腸道激素，心血管激素，甲狀旁腺素與降鈣素，生長激素等（3）非激素蛋白質的測定：鐵蛋白、各種尿微量蛋白、銅藍蛋白、肌紅蛋白、血栓素、III型前膠原肽、層黏蛋白等（4）酶的測定：前列腺酸性磷酸酶、SOD、NSE等（5）藥物及維生素的測定：地高辛、葉酸、VitB12等（6）免疫分子的測定：各種Ig、抗DNA、IL、CD、CIC（7）病原學研究：現(xiàn)已基本淘汰，但細菌代謝產物的測定仍有一定的價值（8）其它：甘膽酸、透明質酸等放射免疫分析的臨床應用臨床常用近200種35基本原理放射免疫測定是建立在待測抗原和標記抗原對有限量抗體進行競爭性結合的基礎上。待測抗原是指人體內某種微量活性物質（如微生物＆寄生蟲抗原、激素、維生素、酶、藥物等），而標記抗原使將已知的上述物質標記上放射性同位素，具有示蹤作用。（1）競爭結合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：常用標記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年測量儀器（1）γ計數(shù)儀（2）β液閃儀免疫分析方法課件36應用：放射性免疫檢測四環(huán)素類藥物殘留測試原理本方法的基本原理是微生物細胞表面存在著能與各種四環(huán)素類藥物共有功能基團相結合的特異性位點，能與各種四環(huán)素類藥物發(fā)生相應的微生物受體反應。檢測四環(huán)素類藥物殘留時，同時加入微生物受體結合物和『3HI標記過的金霉素。如果樣品中殘留有四環(huán)素類藥物，就會同[3H1標記過的金霉素競爭結合微生物受體結合物的相關位點。用液體閃爍計數(shù)儀測定樣品反應后的【3HJ含量的cpm值(countperminute，即每分鐘脈沖數(shù))，cpm值與樣品中的四環(huán)素類藥物殘留量成反比。免疫分析方法課件37免疫熒光技術

免疫熒光分析(Immunofluorescenceassay，IFA)始創(chuàng)于40年代初，1942年Coons等多次報道用異氰酸熒光素標記抗體．檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，當時由于此種熒光素標記物的性能較差，未能推廣使用。直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能較為優(yōu)良的異硫氰酸熒光黃。Mashall等(1958)對熒光抗體的標記方法又進行改進，從而使免疫熒光技術逐漸推廣應用。

2.3熒光免疫分析（IFA）免疫熒光技術

2.3熒光免疫分析（IFA）38常用熒光免疫的類型（1）熒光免疫染色：主要用于抗原抗體的定位，用熒光顯微鏡觀察（2）熒光免疫測定a.熒光偏振免疫測定（FPIA）b.熒光酶免疫測定（FEIA）（3）時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）常用熒光免疫的類型（1）熒光免疫染色：主要用于抗原抗體的定位39基本原理

免疫熒光技術是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結合。以熒光素作為標記物，與已知的抗體(或抗原)結合、但不影響其免疫學特性。然后將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復合物及其存在部位。在實際工作中，由于用熒光素標記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術。

基本原理

40熒光及熒光素

熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發(fā)光；停止能量供給，發(fā)光亦瞬即停止。熒光素是一種能吸收激發(fā)光的光能產生熒光，并能作為染料使用的有機化合物，亦稱熒光色素。目前用于標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃(FITC)、四乙基羅丹明及四甲基異硫氰酸羅丹明。熒光及熒光素

41熒光抗體染色方法

直接法：這是熒光抗體技術最簡單和基本的方法。滴加熒光抗體于待檢標本片上，經(jīng)反應和洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。標本中如有相應抗原存在，即與熒光抗體特異結合，在鏡下可見有熒光的抗原抗體復合物。此法的優(yōu)點是簡單、特異。但其缺點是檢查每種抗原均需制備相應的特異性熒光抗體，且敏感性低于間接法。

間接法：根據(jù)抗球蛋白試驗的原理，用熒光素標記抗球蛋白抗體(簡稱標記抗抗體)的方法。

熒光抗體染色方法

42免疫熒光技術的最重要的三部分（一）熒光物質

熒光素系由異硫氰基與蛋白質分子中的堿性氨基耦聯(lián)而完成標記。許多物質都可產生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。我總結了一下要能用作熒光物質需要滿足以下幾點：a:具備化學上的活潑集團，易于蛋白質結合，未與蛋白質結合的色素及降解產物容易消除b:能發(fā)射可見的，對視覺敏感的熒光顏色c:熒光效率強，與蛋白質結合后性質比較穩(wěn)定，不影響標記物活性，且具有無毒和不具附加性的抗原性d:熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明e:于蛋白質結合的方法快速而簡單免疫熒光技術的最重要的三部分（一）熒光物質

43現(xiàn)在主要應用的熒光物質1、異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。

2、四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。

3、四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。

現(xiàn)在主要應用的熒光物質44（三）標記蛋白

用于熒光標記的蛋白質，多用于特異性抗體或抗原成分，因抗原理化特異性差別甚大，不易高效標記遠較抗體標記少，用于標記的抗體要求效價高，特異性強，

標記后活性損失小。雖然單克隆抗體效價高，特異性強，親和力強，但經(jīng)與熒光素標記后，理論活性僅是標記前的50％左右。故常用標記抗鼠lg的方式以彌補（三）標記蛋白45熒光檢測儀:A:熒光顯微鏡B:熒光分光光度計C:流式細胞儀（FCM）

熒光檢測儀:46流式細胞儀(FCM)

流式細胞儀(FCM)是目前分析細胞學的最據(jù)代表性的先進儀器，是流體噴射技術，激光技術，空氣計數(shù)，－射線能譜術，電子計算機以及顯微影分光光度計等等高技術密切結合的一種先進儀器，已廣泛應用于免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細胞表面標志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細胞。

流式細胞儀(FCM)472.4膠體金免疫技（CGIA）

基本原理:以膠體金作為示蹤標記物，主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點。2.4膠體金免疫技（CGIA）基本原理:以膠體482.5化學發(fā)光免疫技術（LIA）1.原理：（1）LIA：在氧化還原反應中電子被激發(fā)，可釋放光子，使魯米諾（氨基苯二酰肼類）發(fā)光劑發(fā)光。用發(fā)光劑標記抗原或抗體（2）發(fā)光酶免疫測定（LEIA）：用能催化發(fā)光反應的酶（如葡萄糖氧化酶）標記抗原或抗體，酶可使發(fā)光劑發(fā)光。該法經(jīng)酶促放大，更靈敏根據(jù)發(fā)光的強弱對抗原或抗體定量2.優(yōu)點：無放射性，故現(xiàn)正逐步取代RIA2.5化學發(fā)光免疫技術（LIA）1.原理：49acs180全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)免疫分析試劑盒acs180全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)免疫分析試劑盒50參考文獻綜合的[1]黃昊.免疫分析方法的現(xiàn)狀及進展[A].2004年全國醫(yī)學裝備學術研討會論文集[C].2004.[1]張海鵬.免疫分析方法在毒物毒品檢測中的應用與進展[J].讀與寫(教育教學刊),2008,5(8)_2.[1]龐華.標記免疫分析技術及其進展[J].國外醫(yī)學(放射醫(yī)學核醫(yī)學分冊),2002,26(5)_4.酶聯(lián)免疫[1]張占軍王富花酶聯(lián)免疫吸附技術及其在食品安全檢測中的應用食品研究與開發(fā)-2011年1期[2]王燕萍詹峰加樣方式對競爭法ELISA的影響及其對策現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志-2011年4期[3]魏春華王捷王江濤ELISA實驗常見問題分析及對策《中國誤診學雜志》2011年11卷1期[4]唐軍惡性腫瘤放射免疫治療技術的研究進展中國醫(yī)藥生物技術-2010年5期[5]勞海苗吳英松現(xiàn)代免疫分析方法最新進展醫(yī)學研究雜志-2010年10期參考文獻綜合的51參考文獻非標記的（免疫、擴散）[1]李翠蓉瞿鷗.應用免疫擴散試驗檢測豬瘟預防效果[J].試驗研究2009(7).[2]孫剛杜宗,高忠信姜玉嫻顏世波孫建蔣淑英.應用瓊脂免疫擴散試驗檢測豬偽狂犬病抗體的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)2000(4).[3]謝海濤顏向軍.42例多發(fā)性骨髓瘤的血清免疫電泳分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學2008年2月第26卷第1期.[4]陳夢佳，陳藝林，金偉平，譚建新.火箭免疫電泳法測定腦膜炎球菌多糖菌苗多糖含量研究[J].中國熱帶醫(yī)學2008(12)熒光[1]朱天禮,張葵.時間分辨熒光免疫技術在乙肝病毒標志物檢測中的應用[J].臨床輸血與檢驗,2008,10(1)_3.[1]徐艷霞,謝金玲,李忠信等.時間分辨熒光免疫技術在乙肝兩對半測定中的應用[J].臨床合理用藥雜志,2010,03(22).[1]張欣,劉煜垚,薛運周等.時間分辨熒光免疫分析法檢測C反應蛋白方法的建立及應用[J].山東醫(yī)藥,2010,50(23).[1]金晶,賴衛(wèi)華,涂祖新等.時間分辨熒光免疫分析技術的研究進展及在食品安全領域中的應用[J].食品科學,2006,27(12)_4.[1]陳康.熒光免疫分析儀基本組成、原理及進展[J].中國醫(yī)療設備,2009,24(2)_3.參考文獻非標記的（免疫、擴散）52參考文獻放射[1]林杰,黃曉蓉,鄭晶等.放射免疫法快速檢測豬尿樣中的四環(huán)素類藥物殘留[J].飼料工業(yè),2009,30(15)_3.[2]/p-6858255.html化學發(fā)光[1]謝瑋,趙枰,陶國華等.化學發(fā)光免疫分析測定胰島素及C肽在2型糖尿病診斷中的臨床應用[J].標記免疫分析與臨床,2009,16(5)_3.[1]柳光芬.化學發(fā)光免疫技術對乙型肝炎兩對半定量檢測的臨床意義[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2009,6(14)_2.膠體金[1]呂伸,王杉,常文保等.膠體金免疫分析方法的進展[J].武漢大學學報（自然科學版）,2000,46(4)_7.參考文獻放射53ThankYou!ThankYou!54免疫分析方法免疫分析方法55

免疫學方法在食品分析中正得到越來越廣泛的運用，其中酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）已經(jīng)在食品工業(yè)中廣泛應用，它能夠用于測定人們希望含有的物質，以及不希望含有的物質。例如現(xiàn)在人們所關注的食品安全性問題中一些物質的檢測：殺蟲劑、藥物殘留物、激素、生長素、微生物毒素、真菌毒素或腸毒素、天然毒素，以及一些添加劑。免疫分析法具備有效的靈敏度、特異性、快速和低成本的優(yōu)點；可對大量的樣品進行常規(guī)分析；能夠用于樣品的定性篩選，也能夠對樣品進行定量測定以確定樣品中待測組分的含量。免疫分析技術免疫學方法在食品分析中正得到越來越廣泛的運用，56免疫分析技術的分類標記免疫分析技術非標記的免疫分析技術免疫擴散免疫電泳酶聯(lián)免疫分析放射免疫分析熒光免疫技術化學發(fā)光免疫技術膠體金免疫技術免疫分析技術的分類標記免疫分析技術非標記的免疫分析技術免疫57

抗原及相應的抗體分子在凝膠中擴散相遇，達到合適濃度比例時形成抗原抗體復合體沉淀的技術。可以檢測特定的抗原或抗體。抗原與抗體成分的一種定性與半定量分析方法，通常采用半固態(tài)透明瓊脂凝膠作為支持介質。置于孔中的抗原和抗體相向擴散，在兩者濃度比例適當處相遇后如能結合形成復合物則形成沉淀線。分為單向擴散（singleimmunodiffusion）、放射狀擴散（radialimmunodiffusion）和雙向擴散（doubleimmunodiffusion）等。1.1免疫擴散1、非標記免疫分析技術抗原及相應的抗體分子在凝膠中擴散相遇，達到合58實驗原理

可溶性抗原和相應抗體在含有電解質的瓊脂凝膠中擴散相遇，特異性地結合，在比例合適處，形成肉眼可見的沉淀物的一種免疫血清學技術。（一）單向擴散實驗一種定量實驗，將一定量的抗體混合于瓊脂內，傾注于玻片上，凝固后，在瓊脂層上打孔，再將抗原加入孔中，使其向四周擴散?？乖贵w復合物形成的沉淀環(huán)直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標準抗原制成標準曲線，則未知標本中的抗原含量即可從標準曲線中求出。本實驗主要用于檢查標本中各種免疫球蛋白和血清IgG含量。（二）雙向擴散實驗抗原抗體在一定pH和離子存在的瓊脂糖凝膠中相向擴散，一定時間后，兩者相遇而形成不明顯的抗原抗體聚合物并繼續(xù)擴散，當擴散至兩者的適當比例時便形成大的抗原抗體復合物而出現(xiàn)明顯沉淀，形成垂直于擴散方向的免疫沉淀線即等價線。實驗原理591.2免疫電泳免疫電泳是一種將區(qū)帶電泳和雙向免疫擴散相結合的免疫化學分析技術。1.2免疫電泳免疫電泳是一種將區(qū)帶電泳和雙向免疫擴散相結合60

實驗原理先將抗原樣品在瓊脂平板上進行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而被分離成肉眼不可見的區(qū)帶。停止電泳后，在與電泳方向平行的槽內加入相應抗血清，使抗原和抗體呈雙向擴散，已分離的各抗原與相應抗體在瓊脂中擴散而相遇，在二者比例合適處形成肉眼可見的沉淀弧。實驗原理先將抗原樣品在瓊脂平板上進行電泳61根據(jù)沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與已知標準抗原進行比較，可分析、鑒定樣品中所含的抗原成分及其性質。根據(jù)沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與已知標準抗原進行比較，可分析、62

采用熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應，通過對免疫復合物中的標記物的測定，達到對免疫反應進行監(jiān)測的目的。2、免疫標記技術采用熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體（或632.1酶聯(lián)免疫法免疫酶技術：把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理有機地結合起來。它具有免疫熒光試驗和放射免疫試驗的優(yōu)點，并克服上述兩種方法的缺點。酶標記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長，免疫酶技術的敏感性接近放射免疫試驗，可直接肉眼觀察也可借助簡單的儀器作定量測定，所得結果比較客觀。2.1酶聯(lián)免疫法免疫酶技術：把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催64ELISA的基本原理和方法ELISA的種類和變化ELISA的特點ELISA的應用實例酶聯(lián)免疫吸附法ELISAELISA的基本原理和方法ELISA的種類和變化ELI65基本原理

ELISA是一種免疫測定（immunoassay，IA）基礎:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，由此進行定性或定量分析。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）基本原理66酶及其底物

酶結合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結的產物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應。酶及其底物67免疫分析方法課件68ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素的ELISA

ELISA的種類和變化（一）雙抗體夾心法69（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原70步驟：A將已知抗體吸附于載體上，溫育后清洗；B加入待檢標本溶液，使溶液中的抗原與吸附的抗體結合，溫育后清洗；C加入酶標記特異性抗體，溫育后清洗；D加入酶作用底物，產生顯色反應，顏色的改變與所加的待檢標本溶液中的抗原量成正比。步驟：71間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢72步驟：A將已知可溶性抗原吸附于載體（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），經(jīng)溫育后清洗；B加入待檢稀釋血清，若血清中有相應特異性抗體存在則與吸附的抗原結合，溫育后清洗；C加入酶標記的抗球蛋白抗體，此時酶標記抗抗體與吸附的抗原抗體復合物結合，溫育后清洗；D加入酶作用底物（或稱基質），酶分解底物并顯色，用光電比色計測定底物顯色深淺，即可推知抗體量。步驟：73（三）競爭法

此法可用于檢測小分子抗原。（三）競爭法此法可用于檢測小分子抗原。74步驟：A將已知抗體吸附于固相載體表面，溫育后清洗；B將可能含抗原的待檢溶液和酶標記的已知抗原溶液以適當比例混合，加入已包被的載體孔中，溫育后清洗；C加入酶作用的底物，產生顯色反應。色深表示結合的酶標記抗原多，而待檢溶液中未標記的抗原量少；反之，色淺表示結合的酶標記抗原少，而待檢溶液中抗原量多。步驟：75ELISA特點特點一：靈敏性該測定法的靈敏度來自酶。眾所周知,酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應，產生可供觀察的顯色反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。特點二：特異性其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗原抗體的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。

ELISA特點76飼料安全檢測農藥的檢測疾病診斷ELISA應用實例

飼料安全檢測農藥的檢測疾病診斷ELISA應用實例

77

飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）

甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測中的應用ELISA用于農藥殘留的檢測飼料中鹽酸克倫特羅的測定甲胺磷殘留分析ELISA在飼料78河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農藥的檢測：河豚毒素植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘主要有除79ELISA檢測“非典型肺炎”冠狀病毒ELISA在結締組織病早期診斷中的應用檢測抗異質性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風濕性關節(jié)炎（PtA）33抗體ELISA在疾病診斷中的作用ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體ELISA檢測“非典型肺炎”冠狀病毒ELISA在結締80ELISA法測定SARS抗體效價SARS抗體效價的測定．目前國內外報道的定性檢測方法主要有：間接免疫熒光法(IFA)、病毒中和蝕斑法和ELISA方法。由于ELISA方法具有靈敏度高，操作簡便，樣本處理量大，可定量測定等優(yōu)點。我們選擇了ELISA法進行改進．建立了SARSIgG抗體效價定量測定的方法。經(jīng)初步驗證，該方法的穩(wěn)定性、準確度、重復性、精密度、特異性、線性和范圍等均能達到免疫學定量測定方法的要求．適用于血漿及靜脈注射用人SARS免疫球蛋白制品的SARSIgG抗體效價檢測和質量控制。ELISA法測定SARS抗體效價81ELISA試劑盒商業(yè)資訊ELISA試劑盒商業(yè)資訊82ELISA試劑盒ELISA試劑盒83免疫分析方法課件84DNM-9602G酶標分析儀DNM-9602標配酶標分析儀

DNM-9602A酶標分析儀幾種酶標分析儀DNM-9602G酶標分析儀DNM-9602標配酶標分析儀852.2放射免疫標記技術放射免疫測定（radioimmunoassay，RIA）是1959年由Berson和Yalow首先用于糖尿病患者胰島素含量的測定，是一種將同位素分析的靈敏性和抗原抗體反應的特異性這兩大特點結合起來的免疫標記測定技術。女科學家R.Yalow（美,1921~）1950’末發(fā)明（胰島素），1977年獲諾貝爾醫(yī)學獎2.2放射免疫標記技術放射免疫測定（radioimmunoa86放射免疫優(yōu)缺點其優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、精確性好、樣品用量少，而且不需要復雜的提純步驟。缺點是需要特殊的儀器設備和一定的防護條件，而且有些同位素標記物的半衰期較短以及試驗廢物難以處理，對環(huán)境造成放射性污染。放射免疫優(yōu)缺點87基本原理放射免疫測定是建立在待測抗原和標記抗原對有限量抗體進行競爭性結合的基礎上。待測抗原是指人體內某種微量活性物質（如微生物＆寄生蟲抗原、激素、維生素、酶、藥物等），而標記抗原使將已知的上述物質標記上放射性同位素，具有示蹤作用。（1）競爭結合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：常用標記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年測量儀器（1）γ計數(shù)儀（2）β液閃儀免疫分析方法課件88放射免疫分析的臨床應用臨床常用近200種（1）腫瘤相關抗原的測定：AFP、CEA、CA199、CA-125、CA153、CA724、CYFRA211、PSA等（2）激素的測定：下丘腦-垂體-甲狀腺軸激素，下丘腦-垂體-性腺軸激素，下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸激素，胃腸道激素，心血管激素，甲狀旁腺素與降鈣素，生長激素等（3）非激素蛋白質的測定：鐵蛋白、各種尿微量蛋白、銅藍蛋白、肌紅蛋白、血栓素、III型前膠原肽、層黏蛋白等（4）酶的測定：前列腺酸性磷酸酶、SOD、NSE等（5）藥物及維生素的測定：地高辛、葉酸、VitB12等（6）免疫分子的測定：各種Ig、抗DNA、IL、CD、CIC（7）病原學研究：現(xiàn)已基本淘汰，但細菌代謝產物的測定仍有一定的價值（8）其它：甘膽酸、透明質酸等放射免疫分析的臨床應用臨床常用近200種89基本原理放射免疫測定是建立在待測抗原和標記抗原對有限量抗體進行競爭性結合的基礎上。待測抗原是指人體內某種微量活性物質（如微生物＆寄生蟲抗原、激素、維生素、酶、藥物等），而標記抗原使將已知的上述物質標記上放射性同位素，具有示蹤作用。（1）競爭結合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：常用標記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年測量儀器（1）γ計數(shù)儀（2）β液閃儀免疫分析方法課件90應用：放射性免疫檢測四環(huán)素類藥物殘留測試原理本方法的基本原理是微生物細胞表面存在著能與各種四環(huán)素類藥物共有功能基團相結合的特異性位點，能與各種四環(huán)素類藥物發(fā)生相應的微生物受體反應。檢測四環(huán)素類藥物殘留時，同時加入微生物受體結合物和『3HI標記過的金霉素。如果樣品中殘留有四環(huán)素類藥物，就會同[3H1標記過的金霉素競爭結合微生物受體結合物的相關位點。用液體閃爍計數(shù)儀測定樣品反應后的【3HJ含量的cpm值(countperminute，即每分鐘脈沖數(shù))，cpm值與樣品中的四環(huán)素類藥物殘留量成反比。免疫分析方法課件91免疫熒光技術

免疫熒光分析(Immunofluorescenceassay，IFA)始創(chuàng)于40年代初，1942年Coons等多次報道用異氰酸熒光素標記抗體．檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，當時由于此種熒光素標記物的性能較差，未能推廣使用。直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能較為優(yōu)良的異硫氰酸熒光黃。Mashall等(1958)對熒光抗體的標記方法又進行改進，從而使免疫熒光技術逐漸推廣應用。

2.3熒光免疫分析（IFA）免疫熒光技術

2.3熒光免疫分析（IFA）92常用熒光免疫的類型（1）熒光免疫染色：主要用于抗原抗體的定位，用熒光顯微鏡觀察（2）熒光免疫測定a.熒光偏振免疫測定（FPIA）b.熒光酶免疫測定（FEIA）（3）時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）常用熒光免疫的類型（1）熒光免疫染色：主要用于抗原抗體的定位93基本原理

免疫熒光技術是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結合。以熒光素作為標記物，與已知的抗體(或抗原)結合、但不影響其免疫學特性。然后將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復合物及其存在部位。在實際工作中，由于用熒光素標記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術。

基本原理

94熒光及熒光素

熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發(fā)光；停止能量供給，發(fā)光亦瞬即停止。熒光素是一種能吸收激發(fā)光的光能產生熒光，并能作為染料使用的有機化合物，亦稱熒光色素。目前用于標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃(FITC)、四乙基羅丹明及四甲基異硫氰酸羅丹明。熒光及熒光素

95熒光抗體染色方法

直接法：這是熒光抗體技術最簡單和基本的方法。滴加熒光抗體于待檢標本片上，經(jīng)反應和洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。標本中如有相應抗原存在，即與熒光抗體特異結合，在鏡下可見有熒光的抗原抗體復合物。此法的優(yōu)點是簡單、特異。但其缺點是檢查每種抗原均需制備相應的特異性熒光抗體，且敏感性低于間接法。

間接法：根據(jù)抗球蛋白試驗的原理，用熒光素標記抗球蛋白抗體(簡稱標記抗抗體)的方法。

熒光抗體染色方法

96免疫熒光技術的最重要的三部分（一）熒光物質

熒光素系由異硫氰基與蛋白質分子中的堿性氨基耦聯(lián)而完成標記。許多物質都可產生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。我總結了一下要能用作熒光物質需要滿足以下幾點：a:具備化學上的活潑集團，易于蛋白質結合，未與蛋白質結合的色素及降解產物容易消除b:能發(fā)射可見的，對視覺敏感的熒光顏色c:熒光效率強，與蛋白質結合后性質比較穩(wěn)定，不影響標記物活性，且具有無毒和不具附加性的抗原性d:熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明e:于蛋白質結合的方法快速而簡單免疫熒光技術的最重要的三部分（一）熒光物質

97現(xiàn)在主要應用的熒光物質1、異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。

2、四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。

3、四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。

現(xiàn)在主要應用的熒光物質98（三）標記蛋白

用于熒光標記的蛋白質，多用于特異性抗體或抗原成分，因抗原理化特異性差別甚大，不易高效標記遠較抗體標記少，用于標記的抗體要求效價高，特異性強，

標記后活性損失小。雖然單克隆抗體效價高，特異性強，親和力強，但經(jīng)與熒光素標記后，理論活性僅是標記前的50％左右。故常用標記抗鼠lg的方式以彌補（三）標記蛋白99熒光檢測儀:A:熒光顯微鏡B:熒光分光光度計C:流式細胞儀（FCM）

熒光檢測儀:100流式細胞儀(FCM)

流式細胞儀(FCM)是目前分析細胞學的最據(jù)代表性的先進儀器，是流體噴射技術，激光技術，空氣計數(shù)，－射線能譜術，電子計算機以及顯微影分光光度計等等高技術密切結合的一種先進儀器，已廣泛應用于免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細胞表面標志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細胞。

流式細胞儀(FCM)1012.4膠體金免疫技（CGIA）