高分子藥物載體課件

張琰華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院基因傳遞系統(tǒng)

張琰基因傳遞系統(tǒng)

1RNA干擾技術(shù)（RNAinterference，RNAi）

RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象.它是一種跨越多種種屬的古老的生物途徑,同時它的出現(xiàn)為生物學(xué)家提供了一種快速、簡便的反向遺傳學(xué)技術(shù),在后基因組時代功能基因的研究中具有重要的應(yīng)用前景.2.基因治療RNA干擾技術(shù)（RNAinterference，RNA2RNA干擾的核心內(nèi)容是siRNA(RNA(smallinterferingRNA),它利用了由小干擾RNA引起的生物細胞內(nèi)同源基因的特異性沉默(silencing)現(xiàn)象，其本質(zhì)是siRNA與對應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解，從而阻止mRNA的翻譯。RNAi是生物進化的結(jié)果，是生物體對病毒基因等外源核酸侵入的一種保護性反應(yīng)。它普遍存在于各種生物，具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達ｍRNA的生物學(xué)功能。RNA干擾現(xiàn)象不僅能提供一種經(jīng)濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定，基因治療等方面開辟一條新思路。2.基因治療RNA干擾的核心內(nèi)容是siRNA(RNA(smallint3（一）RNAi的發(fā)現(xiàn)1990年,為加深矮牽?；?petunias)的紫色,Jorgensen等導(dǎo)入了一個強啟動子控制的色素基因。結(jié)果許多花瓣顏色并未加深,反而呈雜色甚至白色。這是由于轉(zhuǎn)基因和同源的內(nèi)源基因的表達都被抑制了，Jorgensen把這個現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression)。P35S色素基因Ti質(zhì)粒＋色素基因重組轉(zhuǎn)化繁殖美國科學(xué)家安德魯-費里和克拉格-米洛因為發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象而獲得了2006年度諾貝爾醫(yī)學(xué)獎（一）RNAi的發(fā)現(xiàn)1990年,為加深矮牽?；?petu41998年,AndrewFire等在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中的研究證明,在正義RNA阻斷基因表達的試驗中,真正起作用的是雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)。他們將dsRNA注入線蟲體內(nèi)后可抑制序列同源基因的表達,并證實這種抑制主要作用于轉(zhuǎn)錄之后,所以又稱RNAi為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)1999年,Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次發(fā)現(xiàn),21～25nt的dsRNA的出現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虺聊种匾?而在轉(zhuǎn)基因正確表達的植株中則未出現(xiàn)。1998年,AndrewFire等在秀麗隱桿線蟲(C.5Hammond等進行的細胞提取物核酸酶活性實驗，證明了這些小分子雙鏈RNA（siRNA）在RNAi中的作用。隨后人們陸續(xù)在果蠅(Drosophila)、錐蟲(Trypanosomes)、渦蟲(Planaria)、斑馬魚(Zebrafish)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大小鼠和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象。Hammond等進行的細胞提取物核酸酶活性實驗，證明了這些6RNAi技術(shù)的應(yīng)用基因功能研究：利用RNAi技術(shù)使目的基因沉默，研究基因的功能。如利用RNAi技術(shù)證明ag-1基因與擬南芥花的發(fā)育有關(guān)。Chiou-FenChuangandElliotM.Meyerowitz*PNASApril25,2000vol.97No.94985–4990RNAi技術(shù)的應(yīng)用基因功能研究：利用RNAi技術(shù)使目的基因7RNAi技術(shù)的應(yīng)用2.臨床應(yīng)用：RNAi機制可作為真核生物的基因組免疫系統(tǒng),抑制外源和內(nèi)源有害基因的表達。

★利用RNAi技術(shù)把與病毒基因具同源性的siRNA引入感染細胞將會抑制病毒的增殖,這為病毒相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。

★利用RNAi技術(shù)抑制過度表達的癌基因?qū)拱┌Y表型逆轉(zhuǎn)或病程得以控制。RNAi技術(shù)的應(yīng)用2.臨床應(yīng)用：RNAi機制可作為真核83.基因的傳遞系統(tǒng)

一個理想的基因傳遞系統(tǒng)應(yīng)具備以下重要的性質(zhì):①攜帶性能

②安全性③緩釋作用能攜帶足夠數(shù)量的目的基因?qū)C體沒有毒性、致病性或免疫原性,具有生物降解性或良好的生物相容性控制基因的釋放,延長基因的表達時間,改善基因治療的效果3.基因的傳遞系統(tǒng)

一個理想的基因傳遞系統(tǒng)應(yīng)具備以下重要的9理想的基因傳遞系統(tǒng)④穩(wěn)定性載體系統(tǒng)本身應(yīng)穩(wěn)定,而且要保護攜帶的基因免受核酸酶等的破壞

⑤靶向性能

可有效地將目的基因輸送至靶細胞內(nèi)理想的基因傳遞系統(tǒng)④穩(wěn)定性載體系統(tǒng)本身應(yīng)穩(wěn)定,⑤靶向性能10理想的基因傳遞系統(tǒng)⑥可促進目的基因從內(nèi)吞小泡釋放進入胞漿；⑦可促進目的基因轉(zhuǎn)運入核；⑧可調(diào)控基因輸入后在體內(nèi)的表達,因為表達失控的后果將是非常嚴重的。理想的基因傳遞系統(tǒng)⑥可促進目的基因從內(nèi)吞小泡釋放進入胞漿；11傳遞系統(tǒng)在已進行的基因傳遞系統(tǒng)的臨床研究中,反轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)占首位,共計150多個治療方案,病例數(shù)達1200多人；脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)位于第二,治療方案70多個,病例數(shù)達700多人;腺病毒傳遞系統(tǒng)位于第三,治療方案約70個,病例數(shù)達400多人;排在后面的基因傳遞系統(tǒng)依次是產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細胞、Pox病毒、DNA載體和腺相關(guān)病毒。傳遞系統(tǒng)在已進行的基因傳遞系統(tǒng)的臨床研究中,反轉(zhuǎn)錄病毒傳12(一)病毒基因傳遞系統(tǒng)

病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱病毒載體(viralvector),是野生型病毒經(jīng)改造除去致病性后得到的基因輸送系統(tǒng)其主要特點是轉(zhuǎn)染相對高效,但安全性較差。(一)病毒基因傳遞系統(tǒng)病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱病毒載體13基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)控其適度表達。

常用的載體有兩類：病毒載體和非病毒載體。

病毒載體：

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體等；

非病毒載體：

與病毒載體的主要區(qū)別在于：采用理化方法將治療基因轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)?；蜉d體的選擇基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)14

治療基因?qū)胧荏w細胞的方法

化學(xué)方法物理方法膜融合法病毒載體法質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移法基因轉(zhuǎn)移方法

磷酸鈣法DEAE－葡聚糖法

電穿孔法粒子轟擊法（基因槍法）

15(二)非病毒基因傳遞系統(tǒng)

非病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱非病毒載體(non-viralvector),可以克服病毒載體的很多缺陷,己越來越引起科學(xué)家的重視。目前已進入臨床研究的主要是陽離子脂質(zhì)體和DNA載體。非病毒基因傳遞系統(tǒng)的主要特點是安全性好,但轉(zhuǎn)染相對低效。(二)非病毒基因傳遞系統(tǒng)

非病毒基因傳遞系統(tǒng)也16

非病毒載體系統(tǒng)實際上是將需要導(dǎo)入的外源基因視為藥物，將其運送到特定的細胞或組織器官。

非病毒載體系統(tǒng)實際上是將需要導(dǎo)入的外源基因視17(1)DNA載體

DNA載體又稱質(zhì)粒DNA(plasmidDNA)或裸DNA(nakedDNA),可能是最簡單的非病毒傳遞系統(tǒng)。用于基因治療的質(zhì)粒DNA產(chǎn)品與一般的藥品很類似,需要有一定的劑型和質(zhì)量標準。純化質(zhì)粒DNA的安全性較好,不會引起炎癥反應(yīng)等,適用面也較廣,劑量可以因人而異。(1)DNA載體

DNA載體又稱質(zhì)粒DNA18

DNA載體

裸DNA(nakedDNA)未經(jīng)包裝的質(zhì)粒載體，是結(jié)構(gòu)最簡單的非病毒載體。由于在體內(nèi)易被降解破壞（缺乏保護性外包裝）又無靶向性（缺乏可被靶細胞識別的成分），故多采用直接注射或基因槍等物理方法直接導(dǎo)入靶組織或靶器官,如皮膚、骨骼肌、心肌或腫瘤等。利用本法將編碼抗原的基因?qū)肫は?，可激發(fā)機體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，被稱為DNA疫苗（DNAvaccine），是一種較有前途的免疫方法。DNA載體裸DNA(nakedDNA)未經(jīng)包裝19DNA載體質(zhì)粒DNA在靶細胞中的表達效率較低,持續(xù)時間較短,因此需要的劑量比較大。一般在一個療程的治療中需要毫克數(shù)量級的質(zhì)粒DNA如何進行質(zhì)粒DNA的大規(guī)模生產(chǎn)DNA載體質(zhì)粒DNA在靶細胞中的表達效率較低,持續(xù)20

脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。

基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，并進行表達。

(2)脂質(zhì)體載體

(2)脂質(zhì)體載體

21(2)脂質(zhì)體載體

用脂質(zhì)體作為載體進行基因輸送的研究已有20多年,這是因為脂質(zhì)體可促進大分子物質(zhì)對細胞膜的穿透。陽離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體

pH敏感型脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體

(2)脂質(zhì)體載體

用脂質(zhì)體作為載體進行基因輸送的研22脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖23(a)陽離子脂質(zhì)體陽離子脂質(zhì)體(cationicliposomes)是基因治療中應(yīng)用最多的非病毒傳遞系統(tǒng)一般由帶正電荷的脂類與中性脂類按一定的摩爾比組成。(a)陽離子脂質(zhì)體陽離子脂質(zhì)體(cationiclipo24(a)陽離子脂質(zhì)體用于制備陽離子脂質(zhì)體的陽離子脂類大多是合成的雙鏈季銨鹽型兩性分子主要作用就是提供正電荷，增加與DNA的縮合一般化學(xué)穩(wěn)定性較好,可以生物降解,但均有一定的細胞毒性。

(a)陽離子脂質(zhì)體用于制備陽離子脂質(zhì)體的陽離子脂類大多是合成25(b)中性脂質(zhì)體中性脂類的作用是穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜、降低陽離子脂質(zhì)的毒性、特別是促進脂質(zhì)體對細胞的滲透。膽固醇(Chol)磷酯酰膽堿(PC)磷酯酰乙醇胺(PE)二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)二油?；字Ｒ掖及?DOPE)(b)中性脂質(zhì)體中性脂類的作用是穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜、降低陽離子脂26高分子藥物載體課件27陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率影響因素1.粒徑

內(nèi)吞小泡的大小約在80～200nm之間,因此內(nèi)吞作用是一個體積限制性步驟,這就要求所制備的陽離子脂質(zhì)體大小適宜,而且復(fù)合物也應(yīng)足夠小,或者說縮合應(yīng)比較完全；陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率影響因素1.粒徑28

由于復(fù)合物的形成是一個自發(fā)的過程,控制起來有一定難度,而且復(fù)合物還可能進一步聚集,因此一般是將脂質(zhì)體和DNA分別包裝,臨用時再進行混合。

1.粒徑1.粒徑29

陽離子脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性是一個重要的問題,陽離子脂質(zhì)體在血液循環(huán)中會帶上負電荷,而且容易發(fā)生聚集或破裂,釋放出DNA。用聚乙二醇等進行修飾可在一定程度上降低復(fù)合物與血液成份的相互作用。2.穩(wěn)定性2.穩(wěn)定性301.具有多個正電荷頭部的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率高,可能是與DNA作用更牢、縮合較好有關(guān)；2.二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）

具有很強的細胞膜去穩(wěn)定化作用,可以提高DNA的轉(zhuǎn)染效率,隨著DOPE比例增加,轉(zhuǎn)染效率隨之提高,但脂質(zhì)體在血中的穩(wěn)定性也會下降。1.具有多個正電荷頭部的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率高,可能是與DNA31(c)陰離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體(anionicliposomes)所用的陰離子脂質(zhì)包括磷酯酰絲氨酸、心肌磷脂和二棕櫚磷脂酰甘油等。由于載體與DNA都帶負電,為了提高包封效率常需在制備脂質(zhì)體時加入鈣。陰離子脂質(zhì)體的特點是可將低聚核苷酸定位于細胞核,而且可延長低聚核苷酸在細胞內(nèi)的保留時間。對陰離子脂質(zhì)體的研究還比較少。(c)陰離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體(anioniclipo32(d)pH敏感型脂質(zhì)體

PH敏感脂質(zhì)體(pH-sensitiveliposomes)是一種具有細胞內(nèi)靶向和控制藥物(如基因、肽、蛋白質(zhì))釋放的功能性脂質(zhì)體。

(d)pH敏感型脂質(zhì)體PH敏感脂質(zhì)體(pH-sen33pH敏感型脂質(zhì)體膜融合機制1.在酸性條件下，即在核內(nèi)體形成后幾分鐘內(nèi)，進入溶酶體之前，pH從7.4減至5.3～6.3左右時，可導(dǎo)致脂肪酯羧基的質(zhì)子化，而引起六角晶相的形成，2.pH敏感脂質(zhì)體膜發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，促使脂質(zhì)體膜與核內(nèi)體/溶酶體膜的融合，3.將包封的物質(zhì)導(dǎo)入胞漿及主動靶向病變組織，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除。

pH敏感型脂質(zhì)體膜融合機制1.在酸性條件下，即在核內(nèi)體形成34(e)融合脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體是在制備脂質(zhì)體時加入融合劑而獲得。常用融合劑包括PEG、甘油、PVA、以及重組病毒的細胞膜或某些病毒蛋白。DOPE也具有融合劑的性質(zhì),主要用于陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的制備。目前應(yīng)用還比較少。(e)融合脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體是在制備脂質(zhì)體時加入融合劑而獲353.陽離子聚合物

陽離子聚合物(cationicpolymer)與DNA可以在電荷作用下發(fā)生縮合,形成穩(wěn)定的復(fù)合物,防止DNA的降解,其大小可在100nm以下,表面帶正電,有利于與靶細胞的吸附。這類載體的安全性較好,容易制備,不足之處是缺乏靶向性,而且單獨應(yīng)用時轉(zhuǎn)染效率比較低。3.陽離子聚合物

陽離子聚合物(cationic363.陽離子聚合物可選擇的陽離子聚合物聚氨基化合物聚氨基酸星狀樹突體3.陽離子聚合物可選擇的陽離子聚合物聚氨基化合物37陽離子聚合物基因載體陽離子聚合物基因載體38聚乙烯亞胺(PEI)PEI是一種比較常用的陽離子聚合物具有高度分枝的結(jié)構(gòu),內(nèi)部的氨基與末端的氨基可在不同的pH下離子化,有較強的緩沖性能聚乙烯亞胺(PEI)PEI是一種比較常用的陽離子聚合物39PEIPEI有較強的緩沖性能：一方面：有利于DNA的穩(wěn)定性；另一方面：PEI在酸性條件下構(gòu)象改變可促進DNA從內(nèi)吞小泡中的釋放PEIPEI有較強的緩沖性能：40乳糖化肝細胞乳糖化肝細胞41星狀樹突體星狀樹突體(starburstdendrimers)的核心分子至少有三個具化學(xué)活性的側(cè)鏈,在這些化學(xué)活性部位與其他同樣的分子聚合,如此反復(fù),產(chǎn)生一個類似球型的分枝狀聚合物。典型的星狀樹突體是聚氨基酰胺(polyamidoamine)。星狀樹突體星狀樹突體(starburstdendrime42星狀樹突體星狀樹突體的聚合過程是可以控制的,因此可以獲得不同粒度大小的產(chǎn)物。這類載體用于體外實驗已很成功目前正在研制可生物降解的,或者可形成圓筒狀的星狀樹突體。由于具有分枝結(jié)構(gòu),星狀樹突體也具緩沖性能,可促進DNA從內(nèi)吞小泡中釋放。星狀樹突體星狀樹突體的聚合過程是可以控制的,因此可以獲43聚氨基酸雖然有4種帶正電的氨基酸,但用于基因輸送的聚氨基酸幾乎只有聚賴氨酸在20世紀60年代就已有文獻報道。聚氨基酸/DNA復(fù)合物缺乏靶向性,而且由于是線性的結(jié)構(gòu),不能促進復(fù)合物從內(nèi)吞小泡中釋放DNA,因此往往需要進行一些修飾以改善其性能。聚氨基酸雖然有4種帶正電的氨基酸,但用于基因輸送的聚44修飾的聚賴氨酸基因載體修飾的聚賴氨酸基因載體454.納米粒載體

納米粒傳輸系統(tǒng)具有前述理想的基因傳遞系統(tǒng)具備的很多重要性質(zhì),特別是安全性、穩(wěn)定性和緩釋作用明顯。進行適當(dāng)修飾后可提高其靶向性和轉(zhuǎn)染效率。目前應(yīng)用較多的制備納米粒的材料有明膠、殼聚糖等。4.納米粒載體

納米粒傳輸系統(tǒng)具有前述理想的基因傳遞系統(tǒng)具465.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化

可以說到目前為止,所有的非病毒基因輸送系統(tǒng)都并不十分理想,總有一些不足之處,需要進行優(yōu)化與完善。1.在提高靶向性方面,常用的方法是受體介導(dǎo)或抗體介導(dǎo)的方法5.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化可以說到目前為止,所有的非47受體介導(dǎo)的基因載體運輸受體介導(dǎo)的基因載體運輸485.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化2.促進DNA從內(nèi)吞小泡中釋放3.促進DNA的轉(zhuǎn)運入核4.載體輸送系統(tǒng)中基因的表達5.安全性6.各種載體與各種修飾方法進行組合5.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化2.促進DNA從內(nèi)吞小泡中49非病毒載體的一些進展基因縫線將裸DNA直接涂粘或通過大分子多聚物偶聯(lián)到手術(shù)縫合線上，進行血管、肌肉和組織的縫合而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移；基因球囊和基因支架用大分子多聚物將基因載體黏附于球囊導(dǎo)管或支架表面的方法完成對心血管系統(tǒng)內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移；非病毒載體的一些進展基因縫線50基因針

應(yīng)用魚精蛋白將基因載體黏附在針灸針上，刺入肌肉組織內(nèi)并施加短暫的高壓脈沖電刺激，使細胞膜結(jié)構(gòu)暫時性松動，產(chǎn)生納米級小孔洞，可實現(xiàn)局部組織的高效基因轉(zhuǎn)移。這些方法使血管或骨骼肌的局部性基因轉(zhuǎn)移更為有效而方便。

基因針51纖維蛋白凝固－溶解將基因載體與可溶性纖維蛋白原混合成復(fù)合液，從體外注射至血管周圍，在凝血酶和組織凝血因子作用下，可溶性的纖維蛋白原和基因載體的復(fù)合物被轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘膹?fù)合物，黏附在血管周圍，7-14天后在內(nèi)源性纖溶酶的作用下，纖維蛋白自行溶解，從而實現(xiàn)血管外膜的基因轉(zhuǎn)移。纖維蛋白凝固－溶解52溫度敏感性多聚物

可通過使多聚物膨脹縮小的溫度變化來控制DNA的釋放，如生物可降解的PEG–poly(D,L-lacticacid-co-glycolicacid)(PLGA)為非離子親水三聯(lián)多聚物，呈溫度依賴性溶液-凝膠態(tài)轉(zhuǎn)換。在室溫（4-20℃）為液狀，而在體溫（>30℃）則轉(zhuǎn)換成凝膠狀。因而在體外易于與質(zhì)粒DNA形成多聚物溶液，而進入體內(nèi)后即在注射部位轉(zhuǎn)換成水凝膠，緩慢釋放質(zhì)粒DNA，從而延長轉(zhuǎn)染時間溫度敏感性多聚物53

世界上第一個正式被批準用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗。

54（一）遺傳病的基因治療研究

已知人類有4000多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為40％～50％。但真正了解病因，能進行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見遺傳病。

1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細胞(如皮膚細胞，骨髓細胞等)中表達并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴重后果(如不治療難以存活等)?？晒┻x擇并符合上述4條以上要求的不過只有30余種遺傳病。遺傳病基因治療必須符合以下要求：（一）遺傳病的基因治療研究已知人類有4000多種551．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥2．珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病3．血友病和其他血漿蛋白缺乏癥4．苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病5．萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征6．家族性高膽固醇血癥7．囊性纖維化病1．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶56（二）惡性腫瘤基因治療研究

（1）通過基因置換和基因補充，導(dǎo)入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；

腫瘤發(fā)生是一個極為復(fù)雜的過程，許多基因的突變會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。（2）抑制癌基因的活性，通過干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）增強腫瘤細胞的免疫原性，通過對腫瘤組織進行細胞因子修飾，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤細胞的溶解和排斥反應(yīng)；（4）通過導(dǎo)入“自殺基因”殺傷癌細胞。（二）惡性腫瘤基因治療研究（1）通過基因置換和基因補充，導(dǎo)入57

1.腫瘤基因治療的基本策略

從實際應(yīng)用于臨床治療的角度來看，腫瘤基因治療的策略包括：(1)直接殺傷腫瘤細胞或抑制其生長。(2)增強機體免疫系統(tǒng)，間接殺傷或抑制腫瘤細胞。(3)改善腫瘤常規(guī)治療方法，提高療效。1.腫瘤基因治療的基本策略58

2.腫瘤基因治療的常用方法

?基因干預(yù)技術(shù)：通過基因干預(yù)，使得腫瘤細胞過度表達的癌基因得到抑制，從而降低其惡性表型。

?自殺基因治療—分子化療：直接殺死腫瘤細胞。

?腫瘤的免疫基因治療：以激發(fā)機體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細胞功能。

?提高化療效果的輔助基因治療：藥物增敏基因治療；耐藥基因治療。

2.腫瘤基因治療的常用方法59

3.自殺基因治療

基本原理：向腫瘤細胞內(nèi)導(dǎo)入某些真核細胞中不存在的酶基因（自殺基因），這些基因表達的特異性酶可以催化對真核細胞無毒或低毒的藥物前體，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚?yīng)的抗代謝藥物，進而選擇性地將轉(zhuǎn)染了該基因的腫瘤細胞“自殺”。這些基因也相應(yīng)地被稱為“自殺基因”。自殺基因治療是目前腫瘤基因治療領(lǐng)域中的研究熱點之一3.自殺基因治療基本原理：向腫瘤細胞內(nèi)導(dǎo)入某些真60

自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達必須局限于腫瘤細胞中，而不傷及正常細胞。

①利用免疫脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)等技術(shù)進行定向基因轉(zhuǎn)移。②利用病毒載體進行基因轉(zhuǎn)移。③腫瘤特異性基因轉(zhuǎn)錄。④腫瘤內(nèi)直接注射。

自殺基因轉(zhuǎn)移常用方法自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達必須局限于腫瘤614.腫瘤的免疫基因治療

激發(fā)機體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法。主要包括細胞因子（或受體）基因治療和抗原抗體基因治療兩大類。4.腫瘤的免疫基因治療625.提高化療效果的輔助基因治療

臨床上對腫瘤患者進行化療時，通常面臨兩大難題：（1）是患者機體內(nèi)的腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度存在差異，特別是某些經(jīng)過多次化療的患者，其體內(nèi)的腫瘤細胞已經(jīng)產(chǎn)生了多藥耐藥性，對多種化療藥物產(chǎn)生交差耐受，最終導(dǎo)致化療失敗。（2）是大劑量的化療可能導(dǎo)致患者的正常細胞，特別是骨髓造血細胞的功能受到抑制。

5.提高化療效果的輔助基因治療臨床上對腫瘤患者進行化63

(1)藥物增敏基因治療

將雞鈣調(diào)素（calmodulin,CaM）基因?qū)胄∈笕橄侔┘毎闏127，結(jié)果僅需低劑量的長春新堿或長春花堿即可明顯抑制該細胞株的生長。對其作用原理進行研究后發(fā)現(xiàn)，CaM基因的表達產(chǎn)物作為細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的重要物質(zhì)，明顯增加了腫瘤細胞對長春新堿或長春花堿的吸收量而相應(yīng)減少了排出量，從而提高了腫瘤細胞內(nèi)化療藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。

為了使化療藥物能夠最大程度地殺死腫瘤細胞，可以考慮將某些藥物增敏基因?qū)肽[瘤細胞，特別是對化療藥物原本不敏感的腫瘤細胞，使其對抗腫瘤藥物的敏感性大大增加，從而達到增強化療效果的目的。

(1)藥物增敏基因治療將雞鈣調(diào)素（calmod64(2)耐藥基因治療

在解決化療所致骨髓細胞造血功能受到嚴重抑制的問題方面，通過向腫瘤患者的骨髓細胞導(dǎo)入某種耐藥基因，如mdr-1基因等，以增強骨髓細胞的抗藥性，以便耐受大劑量的化療藥物，以達到徹底殺滅腫瘤細胞的目的。

目前除了開發(fā)針對腫瘤細胞耐藥性產(chǎn)生機制的拮抗劑，如用于阻斷P-糖蛋白所引發(fā)多藥耐藥的戊脈安（verapamil）和用于阻斷GSH合成的丁硫氨酸亞砜胺（BSO）等。還采用基因干擾技術(shù)，在基因水平阻斷耐藥基因的表達，使腫瘤細胞喪失多藥耐藥性，從而易于被化療藥物殺死。

(2)耐藥基因治療在解決化療所致骨髓細胞造血功能65（三）病毒性疾病的基因治療研究

據(jù)統(tǒng)計，75%的人類傳染病是由病毒引起的。病毒感染人體后不僅可能急性發(fā)病，還可以在人體內(nèi)長期潛伏，造成終身傷害。病毒還是造成先天畸形的重要因素之一。研究表明，它與某些癌癥、自身免疫性疾病和內(nèi)分泌疾病也存在一定的聯(lián)系。迄今為止，臨床上對絕大多數(shù)病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治療手段，而在眾多開展的抗病毒治療方案中，抗病毒基因治療十分引人注目。（三）病毒性疾病的基因治療研究據(jù)統(tǒng)計，75%的人661．調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答

（1）將細胞因子(如干擾素、白細胞介素等)的基因，導(dǎo)入機體免疫細胞，激活免疫細胞并促進其增殖分化，增強機體的細胞和體液免疫應(yīng)答，促進機體清除病毒感染細胞和游離病毒。（2）將能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，導(dǎo)入機體，表達的抗原不僅可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性抗體，還可以引發(fā)特異性的細胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生對野生致病病毒攻擊的防御作用。1．調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答（1）將細胞因子(如干擾素、白細胞介672．抗病毒復(fù)制：（1）抑制病毒與宿主細胞結(jié)合：即阻斷病毒表面抗原決定簇與宿主細胞受體間的特異性結(jié)合。

（2）干擾病毒基因組的轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控。

（3）抑制病毒基因組的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成。

（4）RNA干擾技術(shù)。

（5）將抗病毒蛋白質(zhì)基因，如2ˊ→5ˊ腺苷酸合成酶等基因，導(dǎo)入機體細胞并持續(xù)表達，可以激活核酸酶F，降解病毒RNA，對RNA病毒的感染產(chǎn)生明顯的抵抗作用。根據(jù)病毒在機體細胞中復(fù)制周期的各個環(huán)節(jié)來設(shè)計的，主要包括：2．抗病毒復(fù)制：（1）抑制病毒與宿主細胞結(jié)合：即阻斷病毒68

基因治療的問題與展望

治療基因調(diào)控元件的選擇；安全高效載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)移技術(shù)的選擇；靶細胞的選擇?；蛑委煹膯栴}與展望69華東理工大學(xué)2010—2011學(xué)年第1學(xué)期《高分子藥物載體》課程論文2010.10班級

學(xué)號

姓名

開課學(xué)院材料學(xué)院任課教師張琰成績

論文題目：綜述納米技術(shù)在高分子藥物載體系統(tǒng)構(gòu)建中的應(yīng)用；綜述高分子材料在基因藥物載體系統(tǒng)中的研究進展；(3)綜述抗腫瘤藥物載體系統(tǒng)的研究進展論文要求：任選一題，根據(jù)論文題目，通過查閱文獻資料，內(nèi)容能夠反映教師要求，舉例恰當(dāng)，論文格式符合規(guī)范（參見華東理工大學(xué)學(xué)報）。2000字左右。包括中文摘要、關(guān)鍵詞、正文和參考文獻。不可以整篇抄襲，如果抄襲，論文以零分計。教師評語：評分項目各項分值得分內(nèi)容與要求的吻合情況（5）摘要（10）關(guān)鍵詞（5）綜述內(nèi)容（50）正文組織結(jié)構(gòu)（15）參考文獻及標注（15）教師簽名2010年月日華東理工大學(xué)2010—2011學(xué)年第1學(xué)期論文要求：教師評語70論文提交郵箱：macromoleculezy@163.com論文提交截止時間：2010年11月30日論文提交郵箱：71

張琰華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院基因傳遞系統(tǒng)

張琰基因傳遞系統(tǒng)

72RNA干擾技術(shù)（RNAinterference，RNAi）

RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象.它是一種跨越多種種屬的古老的生物途徑,同時它的出現(xiàn)為生物學(xué)家提供了一種快速、簡便的反向遺傳學(xué)技術(shù),在后基因組時代功能基因的研究中具有重要的應(yīng)用前景.2.基因治療RNA干擾技術(shù)（RNAinterference，RNA73RNA干擾的核心內(nèi)容是siRNA(RNA(smallinterferingRNA),它利用了由小干擾RNA引起的生物細胞內(nèi)同源基因的特異性沉默(silencing)現(xiàn)象，其本質(zhì)是siRNA與對應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解，從而阻止mRNA的翻譯。RNAi是生物進化的結(jié)果，是生物體對病毒基因等外源核酸侵入的一種保護性反應(yīng)。它普遍存在于各種生物，具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達ｍRNA的生物學(xué)功能。RNA干擾現(xiàn)象不僅能提供一種經(jīng)濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術(shù)手段，而且有可能在基因功能測定，基因治療等方面開辟一條新思路。2.基因治療RNA干擾的核心內(nèi)容是siRNA(RNA(smallint74（一）RNAi的發(fā)現(xiàn)1990年,為加深矮牽牛花(petunias)的紫色,Jorgensen等導(dǎo)入了一個強啟動子控制的色素基因。結(jié)果許多花瓣顏色并未加深,反而呈雜色甚至白色。這是由于轉(zhuǎn)基因和同源的內(nèi)源基因的表達都被抑制了，Jorgensen把這個現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression)。P35S色素基因Ti質(zhì)粒＋色素基因重組轉(zhuǎn)化繁殖美國科學(xué)家安德魯-費里和克拉格-米洛因為發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象而獲得了2006年度諾貝爾醫(yī)學(xué)獎（一）RNAi的發(fā)現(xiàn)1990年,為加深矮牽牛花(petu751998年,AndrewFire等在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中的研究證明,在正義RNA阻斷基因表達的試驗中,真正起作用的是雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)。他們將dsRNA注入線蟲體內(nèi)后可抑制序列同源基因的表達,并證實這種抑制主要作用于轉(zhuǎn)錄之后,所以又稱RNAi為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)1999年,Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次發(fā)現(xiàn),21～25nt的dsRNA的出現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虺聊种匾?而在轉(zhuǎn)基因正確表達的植株中則未出現(xiàn)。1998年,AndrewFire等在秀麗隱桿線蟲(C.76Hammond等進行的細胞提取物核酸酶活性實驗，證明了這些小分子雙鏈RNA（siRNA）在RNAi中的作用。隨后人們陸續(xù)在果蠅(Drosophila)、錐蟲(Trypanosomes)、渦蟲(Planaria)、斑馬魚(Zebrafish)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大小鼠和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象。Hammond等進行的細胞提取物核酸酶活性實驗，證明了這些77RNAi技術(shù)的應(yīng)用基因功能研究：利用RNAi技術(shù)使目的基因沉默，研究基因的功能。如利用RNAi技術(shù)證明ag-1基因與擬南芥花的發(fā)育有關(guān)。Chiou-FenChuangandElliotM.Meyerowitz*PNASApril25,2000vol.97No.94985–4990RNAi技術(shù)的應(yīng)用基因功能研究：利用RNAi技術(shù)使目的基因78RNAi技術(shù)的應(yīng)用2.臨床應(yīng)用：RNAi機制可作為真核生物的基因組免疫系統(tǒng),抑制外源和內(nèi)源有害基因的表達。

★利用RNAi技術(shù)把與病毒基因具同源性的siRNA引入感染細胞將會抑制病毒的增殖,這為病毒相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。

★利用RNAi技術(shù)抑制過度表達的癌基因?qū)拱┌Y表型逆轉(zhuǎn)或病程得以控制。RNAi技術(shù)的應(yīng)用2.臨床應(yīng)用：RNAi機制可作為真核793.基因的傳遞系統(tǒng)

一個理想的基因傳遞系統(tǒng)應(yīng)具備以下重要的性質(zhì):①攜帶性能

②安全性③緩釋作用能攜帶足夠數(shù)量的目的基因?qū)C體沒有毒性、致病性或免疫原性,具有生物降解性或良好的生物相容性控制基因的釋放,延長基因的表達時間,改善基因治療的效果3.基因的傳遞系統(tǒng)

一個理想的基因傳遞系統(tǒng)應(yīng)具備以下重要的80理想的基因傳遞系統(tǒng)④穩(wěn)定性載體系統(tǒng)本身應(yīng)穩(wěn)定,而且要保護攜帶的基因免受核酸酶等的破壞

⑤靶向性能

可有效地將目的基因輸送至靶細胞內(nèi)理想的基因傳遞系統(tǒng)④穩(wěn)定性載體系統(tǒng)本身應(yīng)穩(wěn)定,⑤靶向性能81理想的基因傳遞系統(tǒng)⑥可促進目的基因從內(nèi)吞小泡釋放進入胞漿；⑦可促進目的基因轉(zhuǎn)運入核；⑧可調(diào)控基因輸入后在體內(nèi)的表達,因為表達失控的后果將是非常嚴重的。理想的基因傳遞系統(tǒng)⑥可促進目的基因從內(nèi)吞小泡釋放進入胞漿；82傳遞系統(tǒng)在已進行的基因傳遞系統(tǒng)的臨床研究中,反轉(zhuǎn)錄病毒傳遞系統(tǒng)占首位,共計150多個治療方案,病例數(shù)達1200多人；脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)位于第二,治療方案70多個,病例數(shù)達700多人;腺病毒傳遞系統(tǒng)位于第三,治療方案約70個,病例數(shù)達400多人;排在后面的基因傳遞系統(tǒng)依次是產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細胞、Pox病毒、DNA載體和腺相關(guān)病毒。傳遞系統(tǒng)在已進行的基因傳遞系統(tǒng)的臨床研究中,反轉(zhuǎn)錄病毒傳83(一)病毒基因傳遞系統(tǒng)

病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱病毒載體(viralvector),是野生型病毒經(jīng)改造除去致病性后得到的基因輸送系統(tǒng)其主要特點是轉(zhuǎn)染相對高效,但安全性較差。(一)病毒基因傳遞系統(tǒng)病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱病毒載體84基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)控其適度表達。

常用的載體有兩類：病毒載體和非病毒載體。

病毒載體：

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體等；

非病毒載體：

與病毒載體的主要區(qū)別在于：采用理化方法將治療基因轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)?；蜉d體的選擇基因治療關(guān)鍵步驟之一，是將治療基因高效轉(zhuǎn)移入患者體內(nèi)、并能調(diào)85

治療基因?qū)胧荏w細胞的方法

化學(xué)方法物理方法膜融合法病毒載體法質(zhì)粒DNA直接轉(zhuǎn)移法基因轉(zhuǎn)移方法

磷酸鈣法DEAE－葡聚糖法

電穿孔法粒子轟擊法（基因槍法）

86(二)非病毒基因傳遞系統(tǒng)

非病毒基因傳遞系統(tǒng)也稱非病毒載體(non-viralvector),可以克服病毒載體的很多缺陷,己越來越引起科學(xué)家的重視。目前已進入臨床研究的主要是陽離子脂質(zhì)體和DNA載體。非病毒基因傳遞系統(tǒng)的主要特點是安全性好,但轉(zhuǎn)染相對低效。(二)非病毒基因傳遞系統(tǒng)

非病毒基因傳遞系統(tǒng)也87

非病毒載體系統(tǒng)實際上是將需要導(dǎo)入的外源基因視為藥物，將其運送到特定的細胞或組織器官。

非病毒載體系統(tǒng)實際上是將需要導(dǎo)入的外源基因視88(1)DNA載體

DNA載體又稱質(zhì)粒DNA(plasmidDNA)或裸DNA(nakedDNA),可能是最簡單的非病毒傳遞系統(tǒng)。用于基因治療的質(zhì)粒DNA產(chǎn)品與一般的藥品很類似,需要有一定的劑型和質(zhì)量標準。純化質(zhì)粒DNA的安全性較好,不會引起炎癥反應(yīng)等,適用面也較廣,劑量可以因人而異。(1)DNA載體

DNA載體又稱質(zhì)粒DNA89

DNA載體

裸DNA(nakedDNA)未經(jīng)包裝的質(zhì)粒載體，是結(jié)構(gòu)最簡單的非病毒載體。由于在體內(nèi)易被降解破壞（缺乏保護性外包裝）又無靶向性（缺乏可被靶細胞識別的成分），故多采用直接注射或基因槍等物理方法直接導(dǎo)入靶組織或靶器官,如皮膚、骨骼肌、心肌或腫瘤等。利用本法將編碼抗原的基因?qū)肫は?，可激發(fā)機體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，被稱為DNA疫苗（DNAvaccine），是一種較有前途的免疫方法。DNA載體裸DNA(nakedDNA)未經(jīng)包裝90DNA載體質(zhì)粒DNA在靶細胞中的表達效率較低,持續(xù)時間較短,因此需要的劑量比較大。一般在一個療程的治療中需要毫克數(shù)量級的質(zhì)粒DNA如何進行質(zhì)粒DNA的大規(guī)模生產(chǎn)DNA載體質(zhì)粒DNA在靶細胞中的表達效率較低,持續(xù)91

脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。

基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，并進行表達。

(2)脂質(zhì)體載體

(2)脂質(zhì)體載體

92(2)脂質(zhì)體載體

用脂質(zhì)體作為載體進行基因輸送的研究已有20多年,這是因為脂質(zhì)體可促進大分子物質(zhì)對細胞膜的穿透。陽離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體

pH敏感型脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體

(2)脂質(zhì)體載體

用脂質(zhì)體作為載體進行基因輸送的研93脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖94(a)陽離子脂質(zhì)體陽離子脂質(zhì)體(cationicliposomes)是基因治療中應(yīng)用最多的非病毒傳遞系統(tǒng)一般由帶正電荷的脂類與中性脂類按一定的摩爾比組成。(a)陽離子脂質(zhì)體陽離子脂質(zhì)體(cationiclipo95(a)陽離子脂質(zhì)體用于制備陽離子脂質(zhì)體的陽離子脂類大多是合成的雙鏈季銨鹽型兩性分子主要作用就是提供正電荷，增加與DNA的縮合一般化學(xué)穩(wěn)定性較好,可以生物降解,但均有一定的細胞毒性。

(a)陽離子脂質(zhì)體用于制備陽離子脂質(zhì)體的陽離子脂類大多是合成96(b)中性脂質(zhì)體中性脂類的作用是穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜、降低陽離子脂質(zhì)的毒性、特別是促進脂質(zhì)體對細胞的滲透。膽固醇(Chol)磷酯酰膽堿(PC)磷酯酰乙醇胺(PE)二油?；字Ｄ憠A(DOPC)二油?；字Ｒ掖及?DOPE)(b)中性脂質(zhì)體中性脂類的作用是穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜、降低陽離子脂97高分子藥物載體課件98陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率影響因素1.粒徑

內(nèi)吞小泡的大小約在80～200nm之間,因此內(nèi)吞作用是一個體積限制性步驟,這就要求所制備的陽離子脂質(zhì)體大小適宜,而且復(fù)合物也應(yīng)足夠小,或者說縮合應(yīng)比較完全；陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率影響因素1.粒徑99

由于復(fù)合物的形成是一個自發(fā)的過程,控制起來有一定難度,而且復(fù)合物還可能進一步聚集,因此一般是將脂質(zhì)體和DNA分別包裝,臨用時再進行混合。

1.粒徑1.粒徑100

陽離子脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性是一個重要的問題,陽離子脂質(zhì)體在血液循環(huán)中會帶上負電荷,而且容易發(fā)生聚集或破裂,釋放出DNA。用聚乙二醇等進行修飾可在一定程度上降低復(fù)合物與血液成份的相互作用。2.穩(wěn)定性2.穩(wěn)定性1011.具有多個正電荷頭部的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率高,可能是與DNA作用更牢、縮合較好有關(guān)；2.二油?；字Ｒ掖及罚―OPE）

具有很強的細胞膜去穩(wěn)定化作用,可以提高DNA的轉(zhuǎn)染效率,隨著DOPE比例增加,轉(zhuǎn)染效率隨之提高,但脂質(zhì)體在血中的穩(wěn)定性也會下降。1.具有多個正電荷頭部的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率高,可能是與DNA102(c)陰離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體(anionicliposomes)所用的陰離子脂質(zhì)包括磷酯酰絲氨酸、心肌磷脂和二棕櫚磷脂酰甘油等。由于載體與DNA都帶負電,為了提高包封效率常需在制備脂質(zhì)體時加入鈣。陰離子脂質(zhì)體的特點是可將低聚核苷酸定位于細胞核,而且可延長低聚核苷酸在細胞內(nèi)的保留時間。對陰離子脂質(zhì)體的研究還比較少。(c)陰離子脂質(zhì)體陰離子脂質(zhì)體(anioniclipo103(d)pH敏感型脂質(zhì)體

PH敏感脂質(zhì)體(pH-sensitiveliposomes)是一種具有細胞內(nèi)靶向和控制藥物(如基因、肽、蛋白質(zhì))釋放的功能性脂質(zhì)體。

(d)pH敏感型脂質(zhì)體PH敏感脂質(zhì)體(pH-sen104pH敏感型脂質(zhì)體膜融合機制1.在酸性條件下，即在核內(nèi)體形成后幾分鐘內(nèi)，進入溶酶體之前，pH從7.4減至5.3～6.3左右時，可導(dǎo)致脂肪酯羧基的質(zhì)子化，而引起六角晶相的形成，2.pH敏感脂質(zhì)體膜發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，促使脂質(zhì)體膜與核內(nèi)體/溶酶體膜的融合，3.將包封的物質(zhì)導(dǎo)入胞漿及主動靶向病變組織，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除。

pH敏感型脂質(zhì)體膜融合機制1.在酸性條件下，即在核內(nèi)體形成105(e)融合脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體是在制備脂質(zhì)體時加入融合劑而獲得。常用融合劑包括PEG、甘油、PVA、以及重組病毒的細胞膜或某些病毒蛋白。DOPE也具有融合劑的性質(zhì),主要用于陽離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的制備。目前應(yīng)用還比較少。(e)融合脂質(zhì)體融合脂質(zhì)體是在制備脂質(zhì)體時加入融合劑而獲1063.陽離子聚合物

陽離子聚合物(cationicpolymer)與DNA可以在電荷作用下發(fā)生縮合,形成穩(wěn)定的復(fù)合物,防止DNA的降解,其大小可在100nm以下,表面帶正電,有利于與靶細胞的吸附。這類載體的安全性較好,容易制備,不足之處是缺乏靶向性,而且單獨應(yīng)用時轉(zhuǎn)染效率比較低。3.陽離子聚合物

陽離子聚合物(cationic1073.陽離子聚合物可選擇的陽離子聚合物聚氨基化合物聚氨基酸星狀樹突體3.陽離子聚合物可選擇的陽離子聚合物聚氨基化合物108陽離子聚合物基因載體陽離子聚合物基因載體109聚乙烯亞胺(PEI)PEI是一種比較常用的陽離子聚合物具有高度分枝的結(jié)構(gòu),內(nèi)部的氨基與末端的氨基可在不同的pH下離子化,有較強的緩沖性能聚乙烯亞胺(PEI)PEI是一種比較常用的陽離子聚合物110PEIPEI有較強的緩沖性能：一方面：有利于DNA的穩(wěn)定性；另一方面：PEI在酸性條件下構(gòu)象改變可促進DNA從內(nèi)吞小泡中的釋放PEIPEI有較強的緩沖性能：111乳糖化肝細胞乳糖化肝細胞112星狀樹突體星狀樹突體(starburstdendrimers)的核心分子至少有三個具化學(xué)活性的側(cè)鏈,在這些化學(xué)活性部位與其他同樣的分子聚合,如此反復(fù),產(chǎn)生一個類似球型的分枝狀聚合物。典型的星狀樹突體是聚氨基酰胺(polyamidoamine)。星狀樹突體星狀樹突體(starburstdendrime113星狀樹突體星狀樹突體的聚合過程是可以控制的,因此可以獲得不同粒度大小的產(chǎn)物。這類載體用于體外實驗已很成功目前正在研制可生物降解的,或者可形成圓筒狀的星狀樹突體。由于具有分枝結(jié)構(gòu),星狀樹突體也具緩沖性能,可促進DNA從內(nèi)吞小泡中釋放。星狀樹突體星狀樹突體的聚合過程是可以控制的,因此可以獲114聚氨基酸雖然有4種帶正電的氨基酸,但用于基因輸送的聚氨基酸幾乎只有聚賴氨酸在20世紀60年代就已有文獻報道。聚氨基酸/DNA復(fù)合物缺乏靶向性,而且由于是線性的結(jié)構(gòu),不能促進復(fù)合物從內(nèi)吞小泡中釋放DNA,因此往往需要進行一些修飾以改善其性能。聚氨基酸雖然有4種帶正電的氨基酸,但用于基因輸送的聚115修飾的聚賴氨酸基因載體修飾的聚賴氨酸基因載體1164.納米粒載體

納米粒傳輸系統(tǒng)具有前述理想的基因傳遞系統(tǒng)具備的很多重要性質(zhì),特別是安全性、穩(wěn)定性和緩釋作用明顯。進行適當(dāng)修飾后可提高其靶向性和轉(zhuǎn)染效率。目前應(yīng)用較多的制備納米粒的材料有明膠、殼聚糖等。4.納米粒載體

納米粒傳輸系統(tǒng)具有前述理想的基因傳遞系統(tǒng)具1175.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化

可以說到目前為止,所有的非病毒基因輸送系統(tǒng)都并不十分理想,總有一些不足之處,需要進行優(yōu)化與完善。1.在提高靶向性方面,常用的方法是受體介導(dǎo)或抗體介導(dǎo)的方法5.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化可以說到目前為止,所有的非118受體介導(dǎo)的基因載體運輸受體介導(dǎo)的基因載體運輸1195.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化2.促進DNA從內(nèi)吞小泡中釋放3.促進DNA的轉(zhuǎn)運入核4.載體輸送系統(tǒng)中基因的表達5.安全性6.各種載體與各種修飾方法進行組合5.非病毒基因輸送系統(tǒng)的優(yōu)化2.促進DNA從內(nèi)吞小泡中120非病毒載體的一些進展基因縫線將裸DNA直接涂粘或通過大分子多聚物偶聯(lián)到手術(shù)縫合線上，進行血管、肌肉和組織的縫合而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移；基因球囊和基因支架用大分子多聚物將基因載體黏附于球囊導(dǎo)管或支架表面的方法完成對心血管系統(tǒng)內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移；非病毒載體的一些進展基因縫線121基因針

應(yīng)用魚精蛋白將基因載體黏附在針灸針上，刺入肌肉組織內(nèi)并施加短暫的高壓脈沖電刺激，使細胞膜結(jié)構(gòu)暫時性松動，產(chǎn)生納米級小孔洞，可實現(xiàn)局部組織的高效基因轉(zhuǎn)移。這些方法使血管或骨骼肌的局部性基因轉(zhuǎn)移更為有效而方便。

基因針122纖維蛋白凝固－溶解將基因載體與可溶性纖維蛋白原混合成復(fù)合液，從體外注射至血管周圍，在凝血酶和組織凝血因子作用下，可溶性的纖維蛋白原和基因載體的復(fù)合物被轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘膹?fù)合物，黏附在血管周圍，7-14天后在內(nèi)源性纖溶酶的作用下，纖維蛋白自行溶解，從而實現(xiàn)血管外膜的基因轉(zhuǎn)移。纖維蛋白凝固－溶解123溫度敏感性多聚物

可通過使多聚物膨脹縮小的溫度變化來控制DNA的釋放，如生物可降解的PEG–poly(D,L-lacticacid-co-glycolicacid)(PLGA)為非離子親水三聯(lián)多聚物，呈溫度依賴性溶液-凝膠態(tài)轉(zhuǎn)換。在室溫（4-20℃）為液狀，而在體溫（>30℃）則轉(zhuǎn)換成凝膠狀。因而在體外易于與質(zhì)粒DNA形成多聚物溶液，而進入體內(nèi)后即在注射部位轉(zhuǎn)換成水凝膠，緩慢釋放質(zhì)粒DNA，從而延長轉(zhuǎn)染時間溫度敏感性多聚物124

世界上第一個正式被批準用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗。

125（一）遺傳病的基因治療研究

已知人類有4000多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為40％～50％。但真正了解病因，能進行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見遺傳病。

1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細胞(如皮膚細胞，骨髓細胞等)中表達并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴重后果(如不治療難以存活等)?？晒┻x擇并符合上述4條以上要求的不過只有30余種遺傳病。遺傳病基因治療必須符合以下要求：（一）遺傳病的基因治療研究已知人類有4000多種1261．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥2．珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病3．血友病和其他血漿蛋白缺乏癥4．苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病5．萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征6．家族性高膽固醇血癥7．囊性纖維化病1．腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶127（二）惡性腫瘤基因治療研究

（1）通過基因置換和基因補充，導(dǎo)入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；

腫瘤發(fā)生是一個極為復(fù)雜的過程，許多基因的突變會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。（2）抑制癌基因的活性，通過干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）增強腫瘤細胞的免疫原性，通過對腫瘤組織進行細胞因子修飾，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤細胞的溶解和排斥反應(yīng)；（4）通過導(dǎo)入“自殺基因”殺傷癌細胞。（二）惡性腫瘤基因治療研究（1）通過基因置換和基因補充，導(dǎo)入128

1.腫瘤基因治療的基本策略

從實際應(yīng)用于臨床治療的角度來看，腫瘤基因治療的策略包括：(1)直接殺傷腫瘤細胞或抑制其生長。(2)增強機體免疫系統(tǒng)，間接殺傷或抑制腫瘤細胞。(3)改善腫瘤常規(guī)治療方法，提高療效。1.腫瘤基因治療的基本策略129

2.腫瘤基因治療的常用方法

?基因干預(yù)技術(shù)：通過基因干預(yù)，使得腫瘤細胞過度表達的癌基因得到抑制，從而降低其惡性表型。

?自殺基因治療—分子化療：直接殺死腫瘤細胞。

?腫瘤的免疫基因治療：以激發(fā)機體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細胞功能。

?提高化療效果的輔助基因治療：藥物增敏基因治療；耐藥基因治療。

2.腫瘤基因治療的常用方法130

3.自殺基因治療

基本原理：向腫瘤細胞內(nèi)導(dǎo)入某些真核細胞中不存在的酶基因（自殺基因），這些基因表達的特異性酶可以催化對真核細胞無毒或低毒的藥物前體，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚?yīng)的抗代謝藥物，進而選擇性地將轉(zhuǎn)染了該基因的腫瘤細胞“自殺”。這些基因也相應(yīng)地被稱為“自殺基因”。自殺基因治療是目前腫瘤基因治療領(lǐng)域中的研究熱點之一3.自殺基因治療基本原理：向腫瘤細胞內(nèi)導(dǎo)入某些真131

自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達必須局限于腫瘤細胞中，而不傷及正常細胞。

①利用免疫脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)等技術(shù)進行定向基因轉(zhuǎn)移。②利用病毒載體進行基因轉(zhuǎn)移。③腫瘤特異性基因轉(zhuǎn)錄。④腫瘤內(nèi)直接注射。

自殺基因轉(zhuǎn)移常用方法自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達必須局限于腫瘤1324.腫瘤的免疫基因治療

激發(fā)機體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法。主要包括細胞因子（或受體）基因治療和抗原抗體基因治療兩大類。4.腫瘤的免疫基因治療1335.提高化療效果的輔助基因治療

臨床上對腫瘤患者進行化療時，通常面臨兩大難題：（1）是患者機體內(nèi)的腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度存