轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)培訓(xùn)課件

轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1一、轉(zhuǎn)基因動物的概念

所謂轉(zhuǎn)基因動物就是把外源性目的基因?qū)雱游锏氖芫鸦蚱淠遗呒毎?，后改用注入受精卵的任何一個前核，并在細胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或囊胚細胞篩選出來，采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動物（fostermother）的子宮內(nèi),使之發(fā)育成具表達目的基因的胚胎動物,并能傳給下一代。這樣，生育的動物為轉(zhuǎn)基因動物。這類動物由于外源性目的基因的穩(wěn)定存在而賦于子代動物個體。2轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)一、轉(zhuǎn)基因動物的概念所謂轉(zhuǎn)基因動物就是把外源性目的21.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展簡介轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)是重組DNA技術(shù)和胚胎技術(shù)發(fā)展的必然結(jié)果。重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，使人類首次可以分離并擴增足夠數(shù)量的遺傳物質(zhì)DNA。早在20世紀(jì)60年代末和70年代初，就有人向蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA，研究mRNA能不能在動物卵細胞和早期胚胎中翻譯。1974年，Jaenisch和Mintz首次報道通過向移植之前的小鼠囊胚注射SV40的DNA，在發(fā)育成的幼鼠體內(nèi)檢測到了SV40DNA序列的存在。1976年，Jaenisch又報道了通過用反轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠的胚胎，使病毒DNA整合到小鼠的基因組中。1980年，Gordon等人首先報道了用顯微注射純化DNA的方法，獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。但是，在這些早期的實驗中，使用的基因結(jié)構(gòu)未曾認(rèn)真地設(shè)計和構(gòu)建，大多是使用容易得到的材料進行試驗，實驗結(jié)果僅僅表明使用DNA顯微注射的方法可以將外源基因?qū)胄∈蠓N系之中。并沒有檢測被導(dǎo)入的基因的生理作用。3轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展簡介轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)是重組DNA技術(shù)和3轉(zhuǎn)基因超級鼠1982年，英國的《自然》雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實驗小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大鼠生長激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?培育出具快速生長效應(yīng)的“轉(zhuǎn)基因超級鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快2～3倍，體積大一倍。4轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)4轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)41.2轉(zhuǎn)基因的方法5轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.2轉(zhuǎn)基因的方法5轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)51)顯微注射法:將DNA注射到胚胎的細胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。6轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1)顯微注射法:將DNA注射到胚胎的細胞核內(nèi)，再把注射過D62)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：最早用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，利用逆轉(zhuǎn)錄載體將遺傳信息以RNA分子的形式，在逆轉(zhuǎn)錄整合酶和逆轉(zhuǎn)錄基因組末端的特異性核酸序列的作用下，反轉(zhuǎn)錄并整合到宿主基因組中去，最終得到轉(zhuǎn)基因小鼠。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體未成為一種主導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)因為自身的缺陷：1）反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量太小，可以插入的目標(biāo)基因最大允許長度是8kb；2）逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳穩(wěn)定性很差，諸如缺失、堿基對替換、插入、重組等，會隨著復(fù)制周期數(shù)的增加而增加；3）滴度低。病毒滴度大多數(shù)情況下是通過子代病毒顆粒在靶細胞上的表達水平測定的。7轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)2)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：最早用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，利用逆轉(zhuǎn)73)胚胎干細胞法：將轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞注射入受體囊胚腔，可參與嵌合體的形成，將來出生的動物的生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因，通過雜交繁育得到純合目的基因的個體，即為轉(zhuǎn)基因動物。其優(yōu)點是：在將胚胎干細胞植入胚胎前，可以在體外選擇一個特殊的基因型，用外源DNA轉(zhuǎn)染以后，胚胎干細胞可以被克隆，繼而可以篩選含有整合外源DNA的細胞用于細胞融合，由此可以得到很多遺傳上相同的轉(zhuǎn)基因動物。缺點是：許多嵌合體轉(zhuǎn)基因動物生殖細胞內(nèi)不含有轉(zhuǎn)基因。目前，胚胎干細胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟。8轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)3)胚胎干細胞法：將轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞注射入受體囊胚腔，可參與8顯微注射胚胎的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染ES細胞DNA載體任何克隆的DNA，除去載體序列的完好的線性形式重組的或野生型的逆轉(zhuǎn)錄病毒克隆的DNA或逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA導(dǎo)入顯微注射到原核除去透明帶后的感染電轉(zhuǎn)移或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎發(fā)育階段1-細胞期1-細胞期或稍晚全能性ES細胞胚胎移植輸卵管子宮囊胚腔，然后子宮首代的基因型通常非嵌合體鑲嵌的嵌合體新生鼠篩查斑點印跡，Southern印跡或PCRSouthern印跡或PCR皮色和Southern印跡或PCRDNA整合拷貝數(shù)1～2001隨選擇的方法和導(dǎo)入的DNA而變首代動物可能含轉(zhuǎn)基因的百分比10％-30％5％-40％可達100％新導(dǎo)入DNA的表達經(jīng)常差增強子誘捕，基因誘捕整合隨機，非同源，多拷貝，單位點用逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)（LTRs）顯然為隨機隨機或定點，取決于DNA導(dǎo)入方法首代動物的生殖系遺傳經(jīng)常經(jīng)常偶爾成問題優(yōu)點方法簡便，許多不同構(gòu)件均成功表達用逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs為單位點同源重組；體外轉(zhuǎn)化選擇；用逆轉(zhuǎn)錄病毒有多種插入缺點顯微注射導(dǎo)致胚胎物理損傷；多拷貝整合；缺乏同源重組插入表達水平低；難達到高滴度組織培養(yǎng)系統(tǒng)困難9轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)顯微注射胚胎的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染ES細胞DNA載體任何克隆的DN9

1.3轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景

1、研究基因的結(jié)構(gòu)與功能，了解動物生命現(xiàn)象的內(nèi)在本質(zhì)。2、建立多種疾病的動物模型，研究發(fā)病機理及治療方法。3、改善動物生產(chǎn)性能，提高動物育種效率。4、作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器?？梢酝ㄟ^家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價的人體藥用蛋白。10轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.3轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景10轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1011轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)11轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)11二、基因敲除動物的概念基因敲除（geneknockout）：是80年代初出現(xiàn)的一項新的基因工程技術(shù)。采用同源重組的方法,用體外合成的無效基因或突變基因取代相應(yīng)正?；?再應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動物,即為基因敲除動物。12轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)二、基因敲除動物的概念基因敲除（geneknockout122.1基因敲除的方法13轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)2.1基因敲除的方法13轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)131)利用基因同源重組進行基因敲除基因載體的構(gòu)建ES細胞的獲得外源DNA導(dǎo)入選擇篩選已擊中的細胞ES細胞的囊胚注射表型研究得到純合體14轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1)利用基因同源重組進行基因敲除基因載體的構(gòu)建14轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?41.1打靶載體的構(gòu)建基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標(biāo)記基因等非同源序列，其中同源序列是同源重組效率的關(guān)鍵因素?；虼虬休d體有基因插入型載體(Gene-insertionvector)和基因置換型載體(Gene—replacementvector)。把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，成為重組載體?；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴テ渖砉δ?，所以一般設(shè)計為替換型載體。15轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.1打靶載體的構(gòu)建基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序15現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細胞也有使用。常用的鼠的種系是１２９及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎干細胞系也逐漸被發(fā)展應(yīng)用。1.2ES細胞獲得16轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞161.3外源DNA導(dǎo)入外源DNA導(dǎo)入的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。目前應(yīng)用最廣的是顯微注射法。Capecchi報道，用顯微注射法導(dǎo)入可得到很高的轉(zhuǎn)染效率，占接受外源DNA細胞的10％~20％，但顯微注射每次只能注射一個細胞，而電穿孔法可同時使許多細胞得到轉(zhuǎn)染。Mansour等研究發(fā)現(xiàn)電穿孔可使1％的ES細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法利用某些病毒與組織細胞有特異的親合力，可用于時空特異性基因打靶。17轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.3外源DNA導(dǎo)入外源DNA導(dǎo)入的方式主要有顯微注射法、17轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)培訓(xùn)課件181.5ES細胞的囊胚注射19轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.5ES細胞的囊胚注射19轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)19將囊胚移植到假孕母鼠子宮內(nèi)20轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)將囊胚移植到假孕母鼠子宮內(nèi)20轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)20通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的。由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。1.6嵌合體動物表型研究1.7得到純合體基因敲除動物21轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解目的基因變化前后212)條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設(shè)置一個可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。外顯子外顯子目標(biāo)外顯子PGKneoloxPloxP外顯子MatingwithCREmice：CRE外顯子外顯子loxP外顯子FloxP22轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)2)條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾2223轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)23轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)23誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cre/loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制Cre表達的啟動子的活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)的特點，通過對誘導(dǎo)劑給予時間的控制或利用Cre基因定位表達系統(tǒng)中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)的過程在時間上的可控性，從而在1oxP動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術(shù)。人們可以通過對誘導(dǎo)劑給予時間的預(yù)先設(shè)計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見的幾種誘導(dǎo)性類型如下：四環(huán)素誘導(dǎo)型(圖)；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。3)可誘導(dǎo)的條件性基因敲除法誘導(dǎo)性基因敲除優(yōu)點：①誘導(dǎo)基因突變的時間可人為控制；②可避免因基因突變而致死胎的問題③在2個loxP位點之間的重組率較高；④如用病毒或配體／DNA復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來介導(dǎo)Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉(zhuǎn)基因動物的過程。24轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cre/loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用24四環(huán)素誘導(dǎo)的基因敲除過程示例圖25轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)四環(huán)素誘導(dǎo)的基因敲除過程示例圖25轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)25四環(huán)素誘導(dǎo)的條件性基因敲除過程示例圖26轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)四環(huán)素誘導(dǎo)的條件性基因敲除過程示例圖26轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)26利用隨機插入突變進行基因敲除原理：此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標(biāo)細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細胞。根據(jù)細胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆轉(zhuǎn)率病毒可用于動植物細胞的插入；對于植物細胞而言農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子比較常用；噬菌體可用于細菌基因敲除。27轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)利用隨機插入突變進行基因敲除原理：此法利用某些能隨機插入基因274)基因捕獲法基因捕獲法是最近發(fā)展起來的利用隨機插入突變進行基因敲除的新型方法，其原理可見下圖。通?；虿东@載體包括一個無啟動子的報道基因，通常是neo基因，neo基因插入到ES細胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實現(xiàn)表達的ES克隆可以很容易地在含G418的選擇培養(yǎng)基中篩選出來，從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活的克隆應(yīng)該100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來獲得此方法的優(yōu)點：用常規(guī)方法進行基因敲除研究需耗費大量的時間和人力，通常一個基因剔除純合子小鼠的獲得需要一年或更長的時間。而利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機插入突變的ES細胞庫，節(jié)省大量篩選染色體組文庫以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費用，更有效和更迅速地進行小鼠染色體組的功能分析。此方法的缺點：1）只能剔除在ES細胞中表達的基因．單種的細胞類型中表達的基因數(shù)目約為I04，現(xiàn)在的基因捕獲載體從理論上來講應(yīng)能剔除所有在ES細胞表達的基因，因此，在ES細胞中進行基因捕獲還是大有可為的。2）用基因捕獲法進行基因剔除的另一個缺點是無法對基因進行精細的遺傳修飾。28轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)4)基因捕獲法基因捕獲法是最近發(fā)展起來的利用隨機插入突變進行28基因捕獲法的基本原理示意圖.插入了靶目標(biāo)的基因轉(zhuǎn)錄翻譯出無活性的目標(biāo)蛋白隨機插入內(nèi)含子中,需要敲除的靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯出活性蛋白29轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)基因捕獲法的基本原理示意圖.29轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)29基因敲除技術(shù)的應(yīng)用1、建立生物模型，研究基因調(diào)控和基因功能；2、疾病的分子機理研究和疾病的基因治療；3、提供廉價的異種移植器官；4、改造生物、培育新的生物品種。30轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)基因敲除技術(shù)的應(yīng)用30轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)30基因敲除技術(shù)的缺陷隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不足和缺陷都已經(jīng)解決，但基因敲除技術(shù)始終存在著一個難以克服的缺點，即敲掉一個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：1）許多基因在功能上是冗余的，敲掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其他成員可以提供同樣的功能；2）對于某些必需基因，敲除后會造成細胞的致死性，也就無法對這些必需基因進行相應(yīng)的研究了。31轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)基因敲除技術(shù)的缺陷隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不31謝謝！32轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)謝謝！32轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)3233轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)33轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)33轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)34一、轉(zhuǎn)基因動物的概念

所謂轉(zhuǎn)基因動物就是把外源性目的基因?qū)雱游锏氖芫鸦蚱淠遗呒毎?，后改用注入受精卵的任何一個前核，并在細胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或囊胚細胞篩選出來，采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動物（fostermother）的子宮內(nèi),使之發(fā)育成具表達目的基因的胚胎動物,并能傳給下一代。這樣，生育的動物為轉(zhuǎn)基因動物。這類動物由于外源性目的基因的穩(wěn)定存在而賦于子代動物個體。35轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)一、轉(zhuǎn)基因動物的概念所謂轉(zhuǎn)基因動物就是把外源性目的351.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展簡介轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)是重組DNA技術(shù)和胚胎技術(shù)發(fā)展的必然結(jié)果。重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，使人類首次可以分離并擴增足夠數(shù)量的遺傳物質(zhì)DNA。早在20世紀(jì)60年代末和70年代初，就有人向蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA，研究mRNA能不能在動物卵細胞和早期胚胎中翻譯。1974年，Jaenisch和Mintz首次報道通過向移植之前的小鼠囊胚注射SV40的DNA，在發(fā)育成的幼鼠體內(nèi)檢測到了SV40DNA序列的存在。1976年，Jaenisch又報道了通過用反轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠的胚胎，使病毒DNA整合到小鼠的基因組中。1980年，Gordon等人首先報道了用顯微注射純化DNA的方法，獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。但是，在這些早期的實驗中，使用的基因結(jié)構(gòu)未曾認(rèn)真地設(shè)計和構(gòu)建，大多是使用容易得到的材料進行試驗，實驗結(jié)果僅僅表明使用DNA顯微注射的方法可以將外源基因?qū)胄∈蠓N系之中。并沒有檢測被導(dǎo)入的基因的生理作用。36轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展簡介轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)是重組DNA技術(shù)和36轉(zhuǎn)基因超級鼠1982年，英國的《自然》雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實驗小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大鼠生長激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?培育出具快速生長效應(yīng)的“轉(zhuǎn)基因超級鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快2～3倍，體積大一倍。37轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)4轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)371.2轉(zhuǎn)基因的方法38轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.2轉(zhuǎn)基因的方法5轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)381)顯微注射法:將DNA注射到胚胎的細胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。39轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1)顯微注射法:將DNA注射到胚胎的細胞核內(nèi)，再把注射過D392)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：最早用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，利用逆轉(zhuǎn)錄載體將遺傳信息以RNA分子的形式，在逆轉(zhuǎn)錄整合酶和逆轉(zhuǎn)錄基因組末端的特異性核酸序列的作用下，反轉(zhuǎn)錄并整合到宿主基因組中去，最終得到轉(zhuǎn)基因小鼠。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體未成為一種主導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)因為自身的缺陷：1）反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量太小，可以插入的目標(biāo)基因最大允許長度是8kb；2）逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳穩(wěn)定性很差，諸如缺失、堿基對替換、插入、重組等，會隨著復(fù)制周期數(shù)的增加而增加；3）滴度低。病毒滴度大多數(shù)情況下是通過子代病毒顆粒在靶細胞上的表達水平測定的。40轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)2)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：最早用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，利用逆轉(zhuǎn)403)胚胎干細胞法：將轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞注射入受體囊胚腔，可參與嵌合體的形成，將來出生的動物的生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因，通過雜交繁育得到純合目的基因的個體，即為轉(zhuǎn)基因動物。其優(yōu)點是：在將胚胎干細胞植入胚胎前，可以在體外選擇一個特殊的基因型，用外源DNA轉(zhuǎn)染以后，胚胎干細胞可以被克隆，繼而可以篩選含有整合外源DNA的細胞用于細胞融合，由此可以得到很多遺傳上相同的轉(zhuǎn)基因動物。缺點是：許多嵌合體轉(zhuǎn)基因動物生殖細胞內(nèi)不含有轉(zhuǎn)基因。目前，胚胎干細胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟。41轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)3)胚胎干細胞法：將轉(zhuǎn)染的胚胎干細胞注射入受體囊胚腔，可參與41顯微注射胚胎的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染ES細胞DNA載體任何克隆的DNA，除去載體序列的完好的線性形式重組的或野生型的逆轉(zhuǎn)錄病毒克隆的DNA或逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA導(dǎo)入顯微注射到原核除去透明帶后的感染電轉(zhuǎn)移或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎發(fā)育階段1-細胞期1-細胞期或稍晚全能性ES細胞胚胎移植輸卵管子宮囊胚腔，然后子宮首代的基因型通常非嵌合體鑲嵌的嵌合體新生鼠篩查斑點印跡，Southern印跡或PCRSouthern印跡或PCR皮色和Southern印跡或PCRDNA整合拷貝數(shù)1～2001隨選擇的方法和導(dǎo)入的DNA而變首代動物可能含轉(zhuǎn)基因的百分比10％-30％5％-40％可達100％新導(dǎo)入DNA的表達經(jīng)常差增強子誘捕，基因誘捕整合隨機，非同源，多拷貝，單位點用逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)（LTRs）顯然為隨機隨機或定點，取決于DNA導(dǎo)入方法首代動物的生殖系遺傳經(jīng)常經(jīng)常偶爾成問題優(yōu)點方法簡便，許多不同構(gòu)件均成功表達用逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs為單位點同源重組；體外轉(zhuǎn)化選擇；用逆轉(zhuǎn)錄病毒有多種插入缺點顯微注射導(dǎo)致胚胎物理損傷；多拷貝整合；缺乏同源重組插入表達水平低；難達到高滴度組織培養(yǎng)系統(tǒng)困難42轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)顯微注射胚胎的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染ES細胞DNA載體任何克隆的DN42

1.3轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景

1、研究基因的結(jié)構(gòu)與功能，了解動物生命現(xiàn)象的內(nèi)在本質(zhì)。2、建立多種疾病的動物模型，研究發(fā)病機理及治療方法。3、改善動物生產(chǎn)性能，提高動物育種效率。4、作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器?？梢酝ㄟ^家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價的人體藥用蛋白。43轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.3轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景10轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)4344轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)11轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)44二、基因敲除動物的概念基因敲除（geneknockout）：是80年代初出現(xiàn)的一項新的基因工程技術(shù)。采用同源重組的方法,用體外合成的無效基因或突變基因取代相應(yīng)正?；?再應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動物,即為基因敲除動物。45轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)二、基因敲除動物的概念基因敲除（geneknockout452.1基因敲除的方法46轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)2.1基因敲除的方法13轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)461)利用基因同源重組進行基因敲除基因載體的構(gòu)建ES細胞的獲得外源DNA導(dǎo)入選擇篩選已擊中的細胞ES細胞的囊胚注射表型研究得到純合體47轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1)利用基因同源重組進行基因敲除基因載體的構(gòu)建14轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?71.1打靶載體的構(gòu)建基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標(biāo)記基因等非同源序列，其中同源序列是同源重組效率的關(guān)鍵因素?；虼虬休d體有基因插入型載體(Gene-insertionvector)和基因置換型載體(Gene—replacementvector)。把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，成為重組載體?；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴テ渖砉δ?，所以一般設(shè)計為替換型載體。48轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.1打靶載體的構(gòu)建基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序48現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細胞也有使用。常用的鼠的種系是１２９及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎干細胞系也逐漸被發(fā)展應(yīng)用。1.2ES細胞獲得49轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞491.3外源DNA導(dǎo)入外源DNA導(dǎo)入的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。目前應(yīng)用最廣的是顯微注射法。Capecchi報道，用顯微注射法導(dǎo)入可得到很高的轉(zhuǎn)染效率，占接受外源DNA細胞的10％~20％，但顯微注射每次只能注射一個細胞，而電穿孔法可同時使許多細胞得到轉(zhuǎn)染。Mansour等研究發(fā)現(xiàn)電穿孔可使1％的ES細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法利用某些病毒與組織細胞有特異的親合力，可用于時空特異性基因打靶。50轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.3外源DNA導(dǎo)入外源DNA導(dǎo)入的方式主要有顯微注射法、50轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)培訓(xùn)課件511.5ES細胞的囊胚注射52轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)1.5ES細胞的囊胚注射19轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)52將囊胚移植到假孕母鼠子宮內(nèi)53轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)將囊胚移植到假孕母鼠子宮內(nèi)20轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)53通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的。由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進行至少兩代遺傳。1.6嵌合體動物表型研究1.7得到純合體基因敲除動物54轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解目的基因變化前后542)條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設(shè)置一個可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。外顯子外顯子目標(biāo)外顯子PGKneoloxPloxP外顯子MatingwithCREmice：CRE外顯子外顯子loxP外顯子FloxP55轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)2)條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾5556轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)23轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)56誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cre/loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制Cre表達的啟動子的活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)的特點，通過對誘導(dǎo)劑給予時間的控制或利用Cre基因定位表達系統(tǒng)中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)的過程在時間上的可控性，從而在1oxP動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術(shù)。人們可以通過對誘導(dǎo)劑給予時間的預(yù)先設(shè)計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見的幾種誘導(dǎo)性類型如下：四環(huán)素誘導(dǎo)型(圖)；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。3)可誘導(dǎo)的條件性基因敲除法誘導(dǎo)性基因敲除優(yōu)點：①誘導(dǎo)基因突變的時間可人為控制；②可避免因基因突變而致死胎的問題③在2個loxP位點之間的重組率較高；④如用病毒或配體／DNA復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來介導(dǎo)Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉(zhuǎn)基因動物的過程。57轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cre/loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用57四環(huán)素誘導(dǎo)的基因敲除過程示例圖58轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)四環(huán)素誘導(dǎo)的基因敲除過程示例圖25轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)58四環(huán)素誘導(dǎo)的條件性基因敲除過程示例圖59轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)四環(huán)素誘導(dǎo)的條件性基因敲除過程示例圖26轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灱夹g(shù)59利用隨機插入突變進行基因敲除原理：此法利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細菌或其他基因載體，在目標(biāo)細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細胞