脂質(zhì)過氧化及抗氧化劑抗氧化活性的檢測方法

.z脂質(zhì)過氧化及抗氧化劑抗氧化活性的檢測方法摘要：越來越多的研究說明，很多疾病和衰老現(xiàn)象都與脂質(zhì)過氧化有關(guān)。本文對近年來脂質(zhì)過氧化與抗氧化劑抗氧化活性的檢測方法作簡單綜述，包括氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜、化學(xué)發(fā)光法等，并對不同方法進(jìn)展了綜合比擬與評價。各種檢測技術(shù)的對象各有不同，而且各有優(yōu)缺點(diǎn)。因此，要針對不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皸l件來選擇不同的檢測方法。關(guān)鍵詞：脂質(zhì)過氧化；抗氧化劑；抗氧化活性；檢測Lipidspero*idationandtheDetectionMethodsofAntio*idantactivitiesofAntio*idantsAbstractLipidpero*idationhasreceivedconsiderableattentionbecauseofitspossiblecontributiontothepotentialdamageofbiologicalsystems.Thestudyonthemechanismandtheprotectionoflipidpero*idationareconcernedtoourlivingandhealth.Lipidspero*idationandthemethodsofdeterminationofpero*idationandantio*idantactivitiesinbiologicalsystemswerereviewed,includingGaschromatography,LiquidChromatography,MS,Chemiluminescenceandsoon.Differentmethodsareparedprehensivelyandevaluated.Avarietyofdetectiontechnologieshavedifferenttargetclientele,butalsohavetheirownadvantagesanddisadvantages.Therefore,itisnecessaryfordifferente*perimentalpurposesandconditionstochooseadifferentdetectionmethod.Keyword:lipidpero*idation,antio*idant,antio*idantactivity,detection在生物體，很多脂類含有高不飽和脂肪酸，特別在生物膜的磷脂中，高不飽和脂肪酸含量極高。由于不飽和脂肪酸雙鍵電子云密度大，化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，很容易受到過氧化作用的損傷，產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)過氧化物。這些化合物能破壞人體細(xì)胞正常的生理功能，促使人體衰老和誘發(fā)癌癥。目前，國外關(guān)于氧化應(yīng)激、自由基損傷和生物抗氧化的研究主要集中在食品、化裝品、生理學(xué)、流行病學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，從分子水平上研究其作用機(jī)理、基元反響和構(gòu)造/活性關(guān)系的工作尚不多見，許多根底理論問題尚待解決。因此，脂質(zhì)過氧化的檢測方法在反響機(jī)理的研究中就顯得尤為重要。各種抗氧化物質(zhì)抗氧化作用的強(qiáng)弱取決于其抗氧化的能力〔或稱抗氧化活性，Antio*idantActivity〕。抗氧化能力的測定方法有許多種，有直接的，也有間接的，還有簡便的總抗氧化能力〔TAC〕試劑盒等。這些方法都有一定的優(yōu)缺點(diǎn)或局限性〔或?qū)Ｓ眯浴?，測定原理也各不一樣。因此，為獲得準(zhǔn)確的評價結(jié)論，還需綜合評估各種方法，以獲得滿意的結(jié)果[1]。1脂質(zhì)過氧化反響的機(jī)理脂質(zhì)過氧化作用(LipidPero*idation)是自由基生物學(xué)的一個分支，是指脂類〔RH〕的多不飽和脂肪酸〔PUFA〕與自由基反響，形成中間體自由基，再與分子氧形成脂質(zhì)過氧化自由基，引起酸敗變形[2]。生物膜的脂質(zhì)中含有較多的多烯不飽和脂肪酸，易發(fā)生脂質(zhì)過氧化而損傷膜的功能與構(gòu)造。正常生命過程產(chǎn)生的自由基是維持生命所必須，但假設(shè)濃度過高則對機(jī)體有害。體自由基的產(chǎn)生與去除處于動態(tài)平衡中，一旦平衡破壞就危害機(jī)體。環(huán)境中有多種因素促使自由基的產(chǎn)生，引起脂質(zhì)過氧化，例如電離輻射、紫外線、臭氧、廢氣、殺蟲劑、除草劑、光敏劑及金屬離子等等[3]。自由基是指一類可以獨(dú)立存在的含有未配對電子的物質(zhì)，包括分子、原子、原子團(tuán)或離子。假設(shè)這類物質(zhì)含有不配對電子的含氧基團(tuán)稱為氧自由基〔O*yenFreeRadicais,OFR〕，主要包括超氧陰離子自由基〔O2-〕、過氧化氫〔H2O2〕、羥自由基〔HO?〕、單線態(tài)氧〔1O2〕等。這些不成對的電子使OFR具有不穩(wěn)定性和高反響活性[4、5]。脂質(zhì)過氧化過程是一個產(chǎn)生自由基和自由基參于的鏈?zhǔn)椒错?，可分為三個階段：1.1誘導(dǎo)階段〔Inductionstep〕RH→→R?+H?1.2傳播階段(Propagationstep)R?+O2→→ROO?ROO?+RH→→ROOH+R?生成的ROOH很容易發(fā)生各式各樣的分解反響，例如：ROOH→→RO?+HO?RO?和HO?都是非常活潑的自由基，與RH起反響均能生成R?：RO?+RH→→ROH+R?HO?+RH→→H2O+R?1.3終止階段(Terminationstep)各種自由基在量的增加后相互結(jié)合，鏈?zhǔn)椒错懡K止：R?+R?→→RRROO?+R?→→ROORROO?+ROO?→→ROOR+O2式中的RH為參加反響的油脂中的不飽和底物，H是鄰近雙鍵兩旁的亞甲基上的氫原子。反響過程中產(chǎn)生的R?、ROO?、RO?及HO?等自由基均可以由自旋共振儀測定。2脂質(zhì)過氧化的檢測2.1脂質(zhì)過氧化底物的檢測氧耗不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的過程伴隨有氧氣的消耗，因此氧耗也成為檢測脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)之一，氧耗的測定可采用Wills測壓法及氧電極法，后者較為常用。而且此法只需一個氧電極即可，利用氧電極可以很方便的測量溶液中的氧濃度，因此，可以用它檢測一個反響體系中的氧消耗以研究自由基產(chǎn)生的動力學(xué)過程。氧氣吸收的量用電子電位差計記錄，它還可以連續(xù)檢測脂質(zhì)過氧化的進(jìn)程，但體系必須是封閉的。最近，又開展起來一種自旋探針測氧法，它是利用自旋探針ESR波譜的超精細(xì)構(gòu)造隨氧濃度改變來測量一個反響體系中氧濃度的方法。氧氣是一個順磁性的三重態(tài)分子，它可以和自旋探針的未成對電子產(chǎn)生自旋相互作用，使自旋探針的ESR波譜產(chǎn)生自旋-自旋增寬，使本來存在的一些超精細(xì)構(gòu)造無法分辨。利用超精細(xì)構(gòu)造隨氧氣濃度的改變就可以測量該體系中濃度和氧的消耗。但利用這一方法測量生物體系氧消耗的時間不能太長，也不能有氧化復(fù)原反響。增重法脂質(zhì)過氧化過程中必定要吸收一定的氧，底物吸氧后形成過氧化物增重。通過對氧化混合物作NMR分析，由乙烯基質(zhì)子峰面積可以得出不飽和脂肪酸氧化隨時間變化的情況。此法只適用于常溫下的反響，且底物體系中無易揮發(fā)的物質(zhì)。2.2脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的檢測脂自由基在脂質(zhì)過氧化進(jìn)程中會產(chǎn)生許多自由基如R?、ROO?、RO?、HO?等，這些自由基含有一個未成對電子，這就決定了具有順磁性和很高的反響活性。所有檢測自由基的方法都是根據(jù)自由基這兩個特性開展起來的，這些方法可分為物理方法和化學(xué)方法兩大類。所有檢測自由基的方法原則上都可以檢測氧自由基。但氧自由基具有它自己的特性，所以還有一些檢測氧自由基的特殊方法。電子自旋共振(electronspinresonance,ESR)，又稱電子順磁共振〔electronparamagneticreonance,EPR〕，是檢測自由基最直接和最有效的方法。根據(jù)共振條件hv=gβH，一個ESR波譜儀就是一套用來測量自由基時要滿足這個共振條件的設(shè)備。一般ESR波譜儀都是固定頻率，通過改變磁場來滿足共振條件，因此，稱為掃場式。由于高頻微波熱效應(yīng)很大，特別對含水樣品，水對微波吸收很厲害，所以，一般高頻ESR波譜儀不能測量活體中的自由基。最近開展起來的低頻L波段ESR波譜儀解決了這一問題，一是熱效應(yīng)低，二是樣品腔大，可以容納大體積樣品，甚至活體動物。近年來開展起來的自旋捕集技術(shù)具有更廣的應(yīng)用空間。所謂自旋捕集技術(shù)就是為了檢測和識別短壽命自由基，將一種不飽和的抗磁性物質(zhì)〔稱自旋捕集劑，一般為氨酮和亞硝基化合物〕參加要研究的反響體系，生成壽命較長的自旋加合物，可以用ESR檢測：自旋捕集劑+R?→→自旋加合物最常用的自旋捕集劑是tNB(nitrosotert-butane)、DMPO(5,5-dimethyl-pyrroline-1-o*ide)和PBN(phenyl-tert-butynitrone)，它們和自由基反響都可以生成氮氧自由基，所得ESR波譜的一級分裂都是氮原子引起的三重分裂，這一點(diǎn)和自旋標(biāo)記所得到的ESR波譜很類似。但是，自旋加合物的ESR波譜常常被分裂為二、三級更復(fù)雜的圖譜，由二、三級分裂峰制得的數(shù)目和強(qiáng)度可以推導(dǎo)出捕捉到自由基的構(gòu)造和性質(zhì)。共軛二烯氫過氧化物〔CDHP〕不飽和脂肪酸的側(cè)鏈氧化過程中伴隨有CDHP的生成，該共軛二烯構(gòu)造在紫外區(qū)234nm附近具有很強(qiáng)的特征吸收，因此可以利用這一特征對脂質(zhì)過氧化進(jìn)展檢測。該法操作簡單，用一個簡單的紫外分光光度計即可。該法適用于檢測純度較高的脂質(zhì)過氧化反響，因?yàn)榉错戵w系中的其他底物也可能在這個波長圍有吸收。另一個誤差來源于脂肪酸本身在紫外區(qū)〔210nm〕的吸收和CDHP〔234nm〕的吸收只差20nm，并且CDHP本身也是一個不穩(wěn)定的化合物。因此，CDHP含量的多少不能準(zhǔn)確反映脂質(zhì)過氧化的程度，它只能局部地反映氧化初始階段脂質(zhì)過氧化的程度。2.3脂質(zhì)過氧化降解產(chǎn)物的檢測脂質(zhì)過氧化物很不穩(wěn)定，可自發(fā)降解成小分子的復(fù)雜產(chǎn)物，如醛、酮、烷烴、烯烴、酸及聚合物等。對這些降解產(chǎn)物的檢測被認(rèn)為是最能有效的反映脂質(zhì)過氧化的水平。其中丙二醛〔MDA〕是脂質(zhì)過氧化的最典型的終產(chǎn)物?；瘜W(xué)發(fā)光法(CL)發(fā)光是處于高能激發(fā)態(tài)的分子或原子向基態(tài)躍遷時，發(fā)射光子的現(xiàn)象?；瘜W(xué)發(fā)光法是由化學(xué)反響引發(fā)的，發(fā)射光可以是紫光、可見或近紅外光。能產(chǎn)生發(fā)光反響的化合物〔有機(jī)物或無機(jī)物〕很多，典型的反響可以表示為：〔※表示激發(fā)態(tài)〕A+B→→C※+DC※→→C+光化學(xué)發(fā)光法中，常用一些發(fā)光增強(qiáng)劑來提高檢測的靈敏度，常用試劑有魯米諾(luminal)、洛粉堿(luphine)、光澤精(lucigenin)和過氧物(pero*yo*adate)等?；瘜W(xué)發(fā)光的測定最大優(yōu)點(diǎn)是不需要對反響體系加熱，因?yàn)榧词乖谑覝貤l件下反響的速度也是非?？斓摹PLC別離與化學(xué)發(fā)光法聯(lián)用，可以使檢測限到達(dá)皮摩爾級。采用HPLC柱后，檢測技術(shù)還克制了HPLC受抗氧化劑干擾的缺點(diǎn)，從而可以通過測定保存時間來鑒定脂質(zhì)氫過氧化物的性質(zhì)。0.01nm的脂質(zhì)過氧化物很容易檢出，反相液相色譜能使氫過氧化物得到很好的別離?；瘜W(xué)發(fā)光法有靈敏度高、平安性好、適用圍廣、發(fā)射率易控制等優(yōu)點(diǎn)，故已在分析化學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，但它也存在著有些反響觀察時間長、重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)。烴和脂質(zhì)被氧化時會發(fā)光，這與氧化過程中不同步驟產(chǎn)生的自由基有關(guān)。化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度越大通常說明氧化程度也就是脂質(zhì)酸敗的程度越大。該法已用于測定豆油、方便面、奶粉和菜籽油等的氧化程度，亦可用于水產(chǎn)品脂質(zhì)過氧化的檢測[6]。熒光法脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的羰基化合物如丙二醛〔MDA〕可以和蛋白質(zhì)、氨基酸反響生成含有N-C=C-C=N構(gòu)造并發(fā)熒光的烯夫堿〔Schiffbase〕。此堿具有典型的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜光譜〔420-470nm〕。因此，用熒光分光光度計測定其熒光的相對強(qiáng)度，可間接反映脂質(zhì)過氧化的水平。此法靈敏度高，且可以反映丙二醛與體蛋白質(zhì)的相互作用，具有重要的生物學(xué)意義。這一檢測方法的機(jī)理很復(fù)雜，但靈敏度高，通常需要與標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)進(jìn)展比擬，以相對熒光強(qiáng)度作為脂質(zhì)過氧化程度的表示。硫代巴比妥酸法〔TBA〕TBA試驗(yàn)自1944年由Kohn和Liversedge提出即應(yīng)用于食品和生物材料中脂類氧化的檢測和定量，其應(yīng)用程度居所有測試方法之首[7]。硫代巴比妥酸法是基于不飽和脂肪酸通過自由基反響，形成氧化自由基而氧化生成環(huán)氧化合物，環(huán)氧化合物分解生成丙二醛〔MDA〕，MDA與硫代巴比妥酸〔TBA〕作用生成TBA染料配合物。所以，TBA染料配合物形成的多少是衡量自由基氧化反響進(jìn)展程度的標(biāo)志。TBA試驗(yàn)是用2-硫代巴比妥酸與脂類氧化產(chǎn)物丙二醛相互作用生成一種粉紅色化合物，此化合物在532nm下有最大吸收值。通常測試結(jié)果表示為532nm下的吸光值與丙二醛吸光系數(shù)之積，即通常所說的TBA值。由于TBA法檢測到的MDA并不完全由脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的，并且嚴(yán)格來說TBA對MDA也并不具有絕對專一性，更準(zhǔn)確表示TBA試驗(yàn)結(jié)果的術(shù)語應(yīng)該不是丙二醛濃度，而是TBARS〔可與TBA反響的物質(zhì)的縮略語〕。作為測定脂類氧化的一個綜合指標(biāo)，TBA試驗(yàn)有著非常實(shí)用的價值。在考慮到干擾因素的前提下，TBA實(shí)驗(yàn)本身所具有的簡潔、迅速、要求儀器少、一次可處理大批樣的特點(diǎn)，應(yīng)該在測定食品特別是肉類食品和生物體系的脂肪氧化是有著廣泛用途[8]。氣相色譜法在脂質(zhì)氧化過程中，有戊烷、己烷等物質(zhì)生成，戊烷可進(jìn)一步被動物代，己烷則可經(jīng)氣體交換后排放于呼氣之中，應(yīng)用氣相色譜分析技術(shù)檢測己烷是衡量脂質(zhì)過氧化水平的常用指標(biāo)之一。該法廣泛用于完整的動物、灌流肝臟、肝細(xì)胞等脂質(zhì)過氧化測定[9]。3抗氧化劑抗氧化活性的檢測抗氧化劑是指能防止或延緩食品成分氧化變質(zhì)的食品添加劑。按溶解性分為油溶性與水溶性兩類：油溶性的有丁基羥基茴香醚〔BHA〕、二丁基羥基甲苯〔BHT〕、叔丁基對苯二酚〔TBHQ〕、沒食子酸丙酯〔PG〕等，水溶性的有異抗壞血酸及其鹽等。按來源可分為天然的與人工合成的兩類：天然的有生育酚、茶多酚等，人工合成的有丁基羥基茴香醚等?？寡趸瘎┑淖饔迷硎亲钄嘌趸错戞湥陨頁屜妊趸?，抑制氧化酶類的活性，絡(luò)合銅、鐵等金屬離子，以消除其催化活性等等。它的作用原理在于防止或延緩食品氧化反響的進(jìn)展，但不能在食品發(fā)生氧化反響后而使之復(fù)原[10]。3.1高效液相色譜法〔HPLC〕下面以幾種常見的抗氧化劑說明HPLC法的應(yīng)用，如沒食子酸丙酯〔PG〕、叔丁基羥基苯甲醚〔BHA〕和2，6-二叔丁基對甲酚〔BHT〕為例。它們的測定方法大多采用光度法，氣相色譜法等，樣品前處理繁瑣、費(fèi)時，而用高效液相色譜測定十分方便。采用HP1090高效液相色譜儀、漩渦振蕩器、LD4-2型離心機(jī)和1000uL吸液器等儀器。ODS-Hypersil(C18)高速色譜柱〔60*4.6mmI.D.,3um〕；檢測波長UV280nm；流動相：10min，由20%乙腈水溶液線性梯度變?yōu)?00%乙氰，乙腈和水均各加5%醋酸；流速0.8mL/min；進(jìn)樣量5uL，靈敏度0.064AUFS[11]。由檢測結(jié)果可以看出，用微量化學(xué)法〔MICCM〕技術(shù)處理樣品，不僅減少了分析試樣量，而且還減少了溶劑和試劑的用量，最大的優(yōu)點(diǎn)是提高了分析速度。為便于屢次提取，先用少量正己烷將樣品均勻分散，再用乙腈提取，提取液過C18微柱凈化，以取出同時提取的脂溶性物質(zhì)、色素和其它雜質(zhì)，不僅保護(hù)了反相色譜柱，而且使三種抗氧化劑到達(dá)有效的別離，分辨率大大提高[12]。3.2紫外可見分光光度法利用脂質(zhì)體體外氧化試驗(yàn)，對γ-谷維醇及其水解物的抗氧化性進(jìn)展研究為例。γ-谷維醇有一些特殊的生理功能，如降血脂、抗氧化、抗衰老、去自由基等。試驗(yàn)步驟為：每次從三角瓶中取出100uL培養(yǎng)液于試管中〔2個平行〕，參加10mL無水乙醇，混勻后，以甲基為空白，用1cm的石英皿，在234nm波長下用紫外分光光度計測定吸光度。通過對樣品在234nm的紫外吸收的測定，來觀察其氧化的過程和程度，并可以考察抗氧化劑對氧化程度的影響。開場氧化時，氫過氧化物產(chǎn)生的量逐漸增多，吸光度值也隨著增大，最后到達(dá)最大值。隨著氧化地進(jìn)展，氫過氧化物的分解也加快，吸光度值又逐漸變小，抗氧化劑的作用是阻止自由基的傳遞，減緩氧化進(jìn)程，吸光度峰值推遲出現(xiàn)。抗氧化劑的活性越強(qiáng)，峰值出現(xiàn)越晚。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出γ-谷維醇具有一定的抗氧化能力，且抗氧化能力與濃度相關(guān)，最有效的抗氧化濃度為100umol/L，低于50umol/L已無抗氧化作用[13]。紫外光譜儀價格廉價，操作簡便快速，是有機(jī)化合物分析中的重要工具。由于采用UV9100時最大吸收的位置不固定，而選擇*一波長下的吸光度做回歸得出的回歸系數(shù)不同，所以必須確定選擇哪一波長下的吸光度做回歸分析。此試驗(yàn)選擇234nm處的吸光值做回歸分析較為適宜[14]。3.3其他方法水溶液體系利用Fenton反響體系產(chǎn)生羥自由基，采用ESR自旋捕集技術(shù)進(jìn)展檢測，可以定量測定天然抗氧化劑在水溶液中對羥自由基的去除作用。這一方法簡單易行，特異性好，也可以用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)展檢測。光照體系利用光照過氧化氫可以產(chǎn)生羥自由基，光照核黃素/EDTA可以產(chǎn)生超氧陰離子自由基。采用ESR自旋捕集，可以定量測定天然抗氧化劑在光照體系對羥基和超氧陰離子自由基的去除作用。酶體系利用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶反響可以產(chǎn)生超氧陰離子自由基，采用ESR自旋捕集或化學(xué)發(fā)光法可以定量測定天然抗氧化劑在酶體系對超氧陰離子自由基的去除作用。4完畢語檢測脂質(zhì)過氧化和抗氧化劑抗氧化活性的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，手段不同，反映的側(cè)面也不同。ESR無疑是研究脂質(zhì)過氧化自由基機(jī)理的最好方法，但儀器太昂貴；高效液相色譜、熒光法和氣相色譜法定量明確，特異性好，但也都存在儀器昂貴、操作繁瑣的問題；TBA-MDA法，設(shè)備要求低，但由于生物體系存在著多種干擾物質(zhì)，以及常規(guī)比色法的非專一性，使得靈敏度差?？梢哉f沒有哪種方法可以單獨(dú)準(zhǔn)確的評價脂質(zhì)過氧化行為以及*種抗氧化劑的抗氧化性能。因此，實(shí)驗(yàn)中只能根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)條件和目的來選擇不同的檢測方法或者選擇幾種