第四章-目的基因的制備課件

第四章目的基因的制備第三節(jié)目的基因的分離第四章目的基因的制備第三節(jié)目的基因的分離構(gòu)建基因文庫↓依據(jù)待分離目的基因的特性篩選分離出含有目的基因的特定克隆子特性：基因的序列、功能、在染色體上的位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA等。構(gòu)建基因文庫特性：基因的序列、功能、在染色體上的位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)作為抗原用免疫動物制備抗體特異抗體篩選cDNA表達(dá)文庫（一）根據(jù)特異蛋白分離目的基因路線1核酸探針路線2抗體篩選分離特異蛋白測定特異氨基酸序列推測編碼蛋白的核苷酸序列人工合成寡核苷酸片段探針一、目的基因的功能克隆作為抗原用免疫動物制備抗體特異抗體篩選cDNA表達(dá)文庫（一）從氨基酸順序來指導(dǎo)合成寡核苷酸探針注意：1、設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針必須能特異地識別目的基因，這種能在整個真核cDNA文庫中與單一順序特異結(jié)合的寡核苷酸探針的最短長度為15-16個核苷酸，但通常使用17-20個核苷酸的長度，即至少需要了解蛋白質(zhì)肽鏈上6個連續(xù)的氨基酸順序。從氨基酸順序來指導(dǎo)合成寡核苷酸探針注意：2、由于遺傳密碼的簡并性(degeneracy)，大多數(shù)氨基酸有2種或2種以上的遺傳密碼，有的可多至6種，因此，一種氨基酸存在多種可能的DNA順序。為了獲得全部可能的順序，通常要合成一組混合的寡核苷酸探針，其中只有一種探針能與目的基因完全互補(bǔ)。容易出現(xiàn)“假陽性”。2、由于遺傳密碼的簡并性(degeneracy)，大多數(shù)氨基合成寡核苷酸合成少數(shù)幾種、甚至一種較長的寡核苷酸，一般為35-75個核苷酸探針。選擇密碼子簡并性盡可能少的蛋白質(zhì)順序，或者根據(jù)不同生物密碼子使用頻率的知識加以推測，由此，得到的探針稱為“猜測體”(guessmer)。合成寡核苷酸合成少數(shù)幾種、甚至一種較長的寡核苷酸，一般為35多肽順序測定已知脲酸鹽氧化酶（urateoxidase）的32個氨基酸順序，根據(jù)這一氨基酸順序，在它的兩端設(shè)計(jì)了兩組簡并寡核苷酸引物。實(shí)驗(yàn)先提取mRNA和反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，然后用這兩組引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出的片段插入載體和轉(zhuǎn)化E.Coli。實(shí)驗(yàn)再根據(jù)32肽的中間順序設(shè)計(jì)一個猜測體探針，從轉(zhuǎn)化菌落中篩選出一個陽性克隆，進(jìn)而以該克隆的cDNA插入片段作為探針，在非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下從cDNA文庫中篩選出全長2.2kb的編碼脲酸鹽氧化酶的cDNA。多肽順序測定已知脲酸鹽氧化酶（urateoxidase）的已知脲酸鹽氧化酶的32個氨基酸順序簡并寡核苷酸引物。提取mRNA單鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄合成簡并寡核苷酸引物。轉(zhuǎn)化E.ColiPCR，擴(kuò)增目的基因DNA插入載體猜測體探針陽性克隆cDNA插入片段作為探針嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下從cDNA文庫中篩選出全長2.2kb的編碼脲酸鹽氧化酶的cDNA已知脲酸鹽氧化酶的32個氨基酸順序簡并寡核苷酸引物。提取mR利用抗體篩選目的cDNA1、構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫2、以融合蛋白的形式表達(dá)目的基因3、考慮cDNA片段在表達(dá)載體中的方向和閱讀框架問題，保證cDNA的正確表達(dá)利用抗體篩選目的cDNA1、構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫根據(jù)特異蛋白分離目的基因的局限性特異蛋白的鑒定與分離純化；某些基因產(chǎn)物的表達(dá)量非常微少，相關(guān)蛋白難以分離純化或量不足；并非所有基因都有蛋白產(chǎn)物，如tRNA基因；僅少數(shù)基因能表達(dá)形成相應(yīng)蛋白質(zhì)，且不同時期、不同條件下蛋白質(zhì)的種類不完全相同；由于遺傳密碼簡并性，難推導(dǎo)出十分特異的探針。根據(jù)特異蛋白分離目的基因的局限性特異蛋白的鑒定與分離純化；

它主要是利用被克隆的DNA片段與寄主細(xì)胞的染色體DNA在功能上有同源互補(bǔ)性來進(jìn)行目的基因直接分離的。（二）功能互補(bǔ)法克隆基因它主要是利用被克隆的DNA片段與寄主細(xì)胞的染色體一種最簡單的方式是，將大腸桿菌DNA的克隆片段“庫”中的重組DNA分子分別導(dǎo)入一種大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株(auxotrophicstrain)的受體細(xì)胞↓然后將受體細(xì)胞涂布在一種缺少該菌株所需要的營養(yǎng)底物的基本培養(yǎng)基上↓結(jié)果只有那些獲得了營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因的受體細(xì)胞才會長成轉(zhuǎn)化子菌落。一種最簡單的方式是，將大腸桿菌DNA的克隆片段“庫”中的重組酵母吲哚甘油磷酸脫氫酶基因的克隆EcoRⅠ部分酶解面包酵母基因組得到許多DNA片段↓DNA片段與λ噬菌體載體重組↓轉(zhuǎn)入吲哚甘油磷酸脫氫酶型組氨酸缺陷型大腸桿菌菌株↓在不含組氨酸營養(yǎng)源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)↓只有引入了吲哚甘油磷酸脫氫酶基因的細(xì)菌才能生長酵母吲哚甘油磷酸脫氫酶基因的克隆EcoRⅠ部分酶解面包酵母二、序列克隆法（一）根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因根據(jù)已知基因序列或同源基因序列制備探針↓篩選基因文庫↓對陽性克隆測序↓與已知基因序列或同源基因序列比較↓經(jīng)轉(zhuǎn)化鑒定是否為待分離的基因二、序列克隆法（一）根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基應(yīng)用核酸探針篩選λ噬菌體文庫堿處理破壞外殼蛋白，保留DNA應(yīng)用核酸探針篩選λ噬菌體文庫堿處理破壞外殼蛋白，保留DNAAdams等（Adamsetal.,1991）首次提出表達(dá)序列標(biāo)簽（ExpressedSequenceTag,EST）基因序列中，一段能特異的標(biāo)記或表征基因的序列，它有足夠的信息顯示該基因與其它基因的差異，長度200-600bp。EST來源于一定環(huán)境下一個組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫,因此EST也能說明該組織中各基因的表達(dá)水平。（二）表達(dá)序列標(biāo)簽法（ESTs）分離目的基因利用EST尋找新基因的方法即表達(dá)序列標(biāo)簽法（ESTs）Adams等（Adamsetal.,1991）首次提出（不同組織cDNA文庫，隨機(jī)挑選克隆并部分測序(EST)EST序列對GenBank、EMBL數(shù)據(jù)庫檢索目標(biāo)基因或多肽序列，分析已報(bào)道信息文庫篩選或基因定位分離目的基因結(jié)合生物信息學(xué)的手段，為人們提供一種快速有效的發(fā)現(xiàn)新基因的方法不同組織cDNA文庫，隨機(jī)挑選克隆并部分測序(EST)ESTEST策略的局限性難尋找出一些表達(dá)量極低或不表達(dá)的新基因類型不能檢測出許多重要基因的內(nèi)含子序列和調(diào)控序列不能確定克隆基因的功能只能檢測已表達(dá)的基因，不能獲得全部基因信息EST策略的局限性難尋找出一些表達(dá)量極低或不表達(dá)的新基因類型1、差別雜交法三.篩選目的基因的差別雜交及減法雜交技術(shù)也稱為差別篩選法，特別適用于分離在特定組織中或發(fā)育的特定階段表達(dá)的基因以及受生長因子調(diào)節(jié)的基因，亦可有效地用來分離經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因。1、差別雜交法三.篩選目的基因的差別雜交及減法雜交技術(shù)也稱為原理：利用一對組織對基因表達(dá)的差異，篩選出在其中一種組織中受某種因素調(diào)控表達(dá)的一種或一組基因。應(yīng)用前提：兩種不同細(xì)胞群體1目的基因表達(dá)2目的基因不表達(dá)原理：利用一對組織對基因表達(dá)的差異，篩選出在其中一種組織中受分別制備以上兩種細(xì)胞群體的總mRNA提取物以這兩種總mRNA為探針，分別篩選由細(xì)胞群體1構(gòu)建的cDNA文庫以細(xì)胞群體1的mRNA為探針以細(xì)胞群體2的mRNA為探針包含目的基因的菌落呈陽性反應(yīng)不包含目的基因的菌落呈陽性反應(yīng)差別雜交法的操作步驟對照原平板，挑選含目的基因的菌落分別制備以上兩種細(xì)胞群體的總mRNA提取物以這兩種總mRNA差別雜交法局限性：靈敏度低，不適于分離低豐度mRNA的目的基因12差別雜交重復(fù)性差3篩選大量雜交濾膜，鑒定大量噬菌斑，費(fèi)時耗力差別雜交法局限性：靈敏度低，不適于分離低豐度mRNA的目的基2、減法雜交技術(shù)本質(zhì)：盡量消除兩種樣品共同存在的基因序列，從而有效富集目的基因序列。又稱差減雜交克隆、扣除雜交、減數(shù)雜交或消減雜交等。2、減法雜交技術(shù)本質(zhì)：盡量消除兩種樣品共同存在的基因序列，從減法雜交分析兩樣品中差異表達(dá)的基因克隆兩樣品中特異性存在基因用途對象基因組DNAcDNAmRNA減法雜交基因組DNA減法雜交分類減法雜交分析兩樣品中克隆兩樣品中用途對象基因組DNAcDNA兩組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物將形成cDNA/mRNA雜交分子特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA仍單鏈差異表達(dá)序列基本原理+過量雜交提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA提取mRNA組織1目的基因表達(dá)組織2目的基因不表達(dá)（1）mRNA減法雜交兩組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物將形成cDNA/mRNA雜交分子特異四、利用差示分析法分離目的基因克隆1、mRNA差別顯示技術(shù)（差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR）(mRNAdifferetialdisplaybyPCR,DD-PCR)CAP-5’AAAAAAAmRNANMTTTTTTTPCR擴(kuò)增引物3’端引物：T11MN或T12MN

共12種5’端引物：10個核苷酸的隨機(jī)引物(AP)

共20種共240對M-A/C/GN-A/T/C/G四、利用差示分析法分離目的基因克隆1、mRNA差別顯示技術(shù)（優(yōu)點(diǎn)：可檢測表達(dá)的所有基因；同時檢測基因的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)、展現(xiàn)所有差異、比較多種細(xì)胞類型；缺點(diǎn)：檢測全部mRNA的PCR工作量很大；

PAGE分離的cDNA大于500bp時會漏檢，凝膠分析最多為50-100條；差別條帶成簇時造成假陽性；

Northern印跡繁雜費(fèi)時；本底較高。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：五、功能結(jié)合法篩選目的基因原理：根據(jù)目的基因表達(dá)產(chǎn)物的其他結(jié)合功能，如受體與配體結(jié)合、酶與底物結(jié)合等完成目的基因的分離篩選。五、功能結(jié)合法篩選目的基因原理：根據(jù)目的基因表達(dá)產(chǎn)物的其他結(jié)真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子：BDAD圖六、根據(jù)生物大分子間的相互作用分離目的cDNA克隆酵母雙雜合系統(tǒng)p254將一cDNA文庫或基因片段與編碼AD的基因融合，將其轉(zhuǎn)化入可表達(dá)BD融合蛋白的酵母體內(nèi)。真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子：BDAD六、根據(jù)生物大分路線1注意問題寡核苷酸探針可特異地識別目的基因，其長度應(yīng)為17-20個核苷酸，即至少需要了解蛋白質(zhì)肽鏈上6個連續(xù)的氨基酸順序。由于遺傳密碼的簡并性，一種氨基酸順序存在多種可能的DNA順序。為了獲得全部可能的順序，通常要合成一組混合的寡核苷酸探針，其中只有一種能與目的基因完全互補(bǔ)。易出現(xiàn)“假陽性”（錯誤的探針與無關(guān)cDNA發(fā)生雜交）?？珊铣奢^長的“猜測體”探針。路線1注意問題寡核苷酸探針可特異地識別目的基因，其長度應(yīng)為路線2

注意問題構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫（使用表達(dá)型載體）。以融合的形式表達(dá)目的基因（穩(wěn)定、高效）。保證cDNA的正確表達(dá)。路線2注意問題構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫（使用表達(dá)型載體）。根據(jù)氨基酸序列合成寡核苷酸探針根據(jù)氨基酸序列合成寡核苷酸探針用抗體篩選目的cDNA用抗體篩選目的c重組體克隆的差別雜交篩選法重組體克隆的差別雜交篩選法用差示雜交篩選血清誘導(dǎo)表達(dá)基因生長因子調(diào)節(jié)基因用差示雜交篩選血清誘導(dǎo)表達(dá)基因生長因子調(diào)節(jié)基因減數(shù)雜交分離T細(xì)胞受體基因減數(shù)雜交分離T細(xì)胞受體基因減法雜交分離缺失突變體基因（3）基因組DNA減法雜交生物素標(biāo)記用來分離缺失突變基因減法雜交分離缺失突變體基因（3）基因組DNA減法雜交生物素差別顯示分析基本流程回收cDNA,制備探針篩選文庫，以分離該差異片段對應(yīng)的全長cDNA或完整基因差別顯示分析基本流程回收cDNA,制備探針篩選文庫，以分離該紅細(xì)胞生長分化因子（又稱促紅細(xì)胞生成素EPO）受體cDNA的克隆篩選紅細(xì)胞生長分化因子（又稱促紅細(xì)胞生成素EPO）酵母雙雜交體系原理誘餌蛋白靶蛋白帶有一個或多個報(bào)告基因的宿主菌株酵母雙雜交體系原理誘餌蛋白靶蛋白帶有一個或多個報(bào)告基因的宿主第四章-目的基因的制備課件第四章-目的基因的制備課件第四章目的基因的制備第三節(jié)目的基因的分離第四章目的基因的制備第三節(jié)目的基因的分離構(gòu)建基因文庫↓依據(jù)待分離目的基因的特性篩選分離出含有目的基因的特定克隆子特性：基因的序列、功能、在染色體上的位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA等。構(gòu)建基因文庫特性：基因的序列、功能、在染色體上的位置和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)作為抗原用免疫動物制備抗體特異抗體篩選cDNA表達(dá)文庫（一）根據(jù)特異蛋白分離目的基因路線1核酸探針路線2抗體篩選分離特異蛋白測定特異氨基酸序列推測編碼蛋白的核苷酸序列人工合成寡核苷酸片段探針一、目的基因的功能克隆作為抗原用免疫動物制備抗體特異抗體篩選cDNA表達(dá)文庫（一）從氨基酸順序來指導(dǎo)合成寡核苷酸探針注意：1、設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針必須能特異地識別目的基因，這種能在整個真核cDNA文庫中與單一順序特異結(jié)合的寡核苷酸探針的最短長度為15-16個核苷酸，但通常使用17-20個核苷酸的長度，即至少需要了解蛋白質(zhì)肽鏈上6個連續(xù)的氨基酸順序。從氨基酸順序來指導(dǎo)合成寡核苷酸探針注意：2、由于遺傳密碼的簡并性(degeneracy)，大多數(shù)氨基酸有2種或2種以上的遺傳密碼，有的可多至6種，因此，一種氨基酸存在多種可能的DNA順序。為了獲得全部可能的順序，通常要合成一組混合的寡核苷酸探針，其中只有一種探針能與目的基因完全互補(bǔ)。容易出現(xiàn)“假陽性”。2、由于遺傳密碼的簡并性(degeneracy)，大多數(shù)氨基合成寡核苷酸合成少數(shù)幾種、甚至一種較長的寡核苷酸，一般為35-75個核苷酸探針。選擇密碼子簡并性盡可能少的蛋白質(zhì)順序，或者根據(jù)不同生物密碼子使用頻率的知識加以推測，由此，得到的探針稱為“猜測體”(guessmer)。合成寡核苷酸合成少數(shù)幾種、甚至一種較長的寡核苷酸，一般為35多肽順序測定已知脲酸鹽氧化酶（urateoxidase）的32個氨基酸順序，根據(jù)這一氨基酸順序，在它的兩端設(shè)計(jì)了兩組簡并寡核苷酸引物。實(shí)驗(yàn)先提取mRNA和反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，然后用這兩組引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出的片段插入載體和轉(zhuǎn)化E.Coli。實(shí)驗(yàn)再根據(jù)32肽的中間順序設(shè)計(jì)一個猜測體探針，從轉(zhuǎn)化菌落中篩選出一個陽性克隆，進(jìn)而以該克隆的cDNA插入片段作為探針，在非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下從cDNA文庫中篩選出全長2.2kb的編碼脲酸鹽氧化酶的cDNA。多肽順序測定已知脲酸鹽氧化酶（urateoxidase）的已知脲酸鹽氧化酶的32個氨基酸順序簡并寡核苷酸引物。提取mRNA單鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄合成簡并寡核苷酸引物。轉(zhuǎn)化E.ColiPCR，擴(kuò)增目的基因DNA插入載體猜測體探針陽性克隆cDNA插入片段作為探針嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下從cDNA文庫中篩選出全長2.2kb的編碼脲酸鹽氧化酶的cDNA已知脲酸鹽氧化酶的32個氨基酸順序簡并寡核苷酸引物。提取mR利用抗體篩選目的cDNA1、構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫2、以融合蛋白的形式表達(dá)目的基因3、考慮cDNA片段在表達(dá)載體中的方向和閱讀框架問題，保證cDNA的正確表達(dá)利用抗體篩選目的cDNA1、構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫根據(jù)特異蛋白分離目的基因的局限性特異蛋白的鑒定與分離純化；某些基因產(chǎn)物的表達(dá)量非常微少，相關(guān)蛋白難以分離純化或量不足；并非所有基因都有蛋白產(chǎn)物，如tRNA基因；僅少數(shù)基因能表達(dá)形成相應(yīng)蛋白質(zhì)，且不同時期、不同條件下蛋白質(zhì)的種類不完全相同；由于遺傳密碼簡并性，難推導(dǎo)出十分特異的探針。根據(jù)特異蛋白分離目的基因的局限性特異蛋白的鑒定與分離純化；

它主要是利用被克隆的DNA片段與寄主細(xì)胞的染色體DNA在功能上有同源互補(bǔ)性來進(jìn)行目的基因直接分離的。（二）功能互補(bǔ)法克隆基因它主要是利用被克隆的DNA片段與寄主細(xì)胞的染色體一種最簡單的方式是，將大腸桿菌DNA的克隆片段“庫”中的重組DNA分子分別導(dǎo)入一種大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型菌株(auxotrophicstrain)的受體細(xì)胞↓然后將受體細(xì)胞涂布在一種缺少該菌株所需要的營養(yǎng)底物的基本培養(yǎng)基上↓結(jié)果只有那些獲得了營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因的受體細(xì)胞才會長成轉(zhuǎn)化子菌落。一種最簡單的方式是，將大腸桿菌DNA的克隆片段“庫”中的重組酵母吲哚甘油磷酸脫氫酶基因的克隆EcoRⅠ部分酶解面包酵母基因組得到許多DNA片段↓DNA片段與λ噬菌體載體重組↓轉(zhuǎn)入吲哚甘油磷酸脫氫酶型組氨酸缺陷型大腸桿菌菌株↓在不含組氨酸營養(yǎng)源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)↓只有引入了吲哚甘油磷酸脫氫酶基因的細(xì)菌才能生長酵母吲哚甘油磷酸脫氫酶基因的克隆EcoRⅠ部分酶解面包酵母二、序列克隆法（一）根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因根據(jù)已知基因序列或同源基因序列制備探針↓篩選基因文庫↓對陽性克隆測序↓與已知基因序列或同源基因序列比較↓經(jīng)轉(zhuǎn)化鑒定是否為待分離的基因二、序列克隆法（一）根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基應(yīng)用核酸探針篩選λ噬菌體文庫堿處理破壞外殼蛋白，保留DNA應(yīng)用核酸探針篩選λ噬菌體文庫堿處理破壞外殼蛋白，保留DNAAdams等（Adamsetal.,1991）首次提出表達(dá)序列標(biāo)簽（ExpressedSequenceTag,EST）基因序列中，一段能特異的標(biāo)記或表征基因的序列，它有足夠的信息顯示該基因與其它基因的差異，長度200-600bp。EST來源于一定環(huán)境下一個組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫,因此EST也能說明該組織中各基因的表達(dá)水平。（二）表達(dá)序列標(biāo)簽法（ESTs）分離目的基因利用EST尋找新基因的方法即表達(dá)序列標(biāo)簽法（ESTs）Adams等（Adamsetal.,1991）首次提出（不同組織cDNA文庫，隨機(jī)挑選克隆并部分測序(EST)EST序列對GenBank、EMBL數(shù)據(jù)庫檢索目標(biāo)基因或多肽序列，分析已報(bào)道信息文庫篩選或基因定位分離目的基因結(jié)合生物信息學(xué)的手段，為人們提供一種快速有效的發(fā)現(xiàn)新基因的方法不同組織cDNA文庫，隨機(jī)挑選克隆并部分測序(EST)ESTEST策略的局限性難尋找出一些表達(dá)量極低或不表達(dá)的新基因類型不能檢測出許多重要基因的內(nèi)含子序列和調(diào)控序列不能確定克隆基因的功能只能檢測已表達(dá)的基因，不能獲得全部基因信息EST策略的局限性難尋找出一些表達(dá)量極低或不表達(dá)的新基因類型1、差別雜交法三.篩選目的基因的差別雜交及減法雜交技術(shù)也稱為差別篩選法，特別適用于分離在特定組織中或發(fā)育的特定階段表達(dá)的基因以及受生長因子調(diào)節(jié)的基因，亦可有效地用來分離經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因。1、差別雜交法三.篩選目的基因的差別雜交及減法雜交技術(shù)也稱為原理：利用一對組織對基因表達(dá)的差異，篩選出在其中一種組織中受某種因素調(diào)控表達(dá)的一種或一組基因。應(yīng)用前提：兩種不同細(xì)胞群體1目的基因表達(dá)2目的基因不表達(dá)原理：利用一對組織對基因表達(dá)的差異，篩選出在其中一種組織中受分別制備以上兩種細(xì)胞群體的總mRNA提取物以這兩種總mRNA為探針，分別篩選由細(xì)胞群體1構(gòu)建的cDNA文庫以細(xì)胞群體1的mRNA為探針以細(xì)胞群體2的mRNA為探針包含目的基因的菌落呈陽性反應(yīng)不包含目的基因的菌落呈陽性反應(yīng)差別雜交法的操作步驟對照原平板，挑選含目的基因的菌落分別制備以上兩種細(xì)胞群體的總mRNA提取物以這兩種總mRNA差別雜交法局限性：靈敏度低，不適于分離低豐度mRNA的目的基因12差別雜交重復(fù)性差3篩選大量雜交濾膜，鑒定大量噬菌斑，費(fèi)時耗力差別雜交法局限性：靈敏度低，不適于分離低豐度mRNA的目的基2、減法雜交技術(shù)本質(zhì)：盡量消除兩種樣品共同存在的基因序列，從而有效富集目的基因序列。又稱差減雜交克隆、扣除雜交、減數(shù)雜交或消減雜交等。2、減法雜交技術(shù)本質(zhì)：盡量消除兩種樣品共同存在的基因序列，從減法雜交分析兩樣品中差異表達(dá)的基因克隆兩樣品中特異性存在基因用途對象基因組DNAcDNAmRNA減法雜交基因組DNA減法雜交分類減法雜交分析兩樣品中克隆兩樣品中用途對象基因組DNAcDNA兩組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物將形成cDNA/mRNA雜交分子特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA仍單鏈差異表達(dá)序列基本原理+過量雜交提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA提取mRNA組織1目的基因表達(dá)組織2目的基因不表達(dá)（1）mRNA減法雜交兩組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物將形成cDNA/mRNA雜交分子特異四、利用差示分析法分離目的基因克隆1、mRNA差別顯示技術(shù)（差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR）(mRNAdifferetialdisplaybyPCR,DD-PCR)CAP-5’AAAAAAAmRNANMTTTTTTTPCR擴(kuò)增引物3’端引物：T11MN或T12MN

共12種5’端引物：10個核苷酸的隨機(jī)引物(AP)

共20種共240對M-A/C/GN-A/T/C/G四、利用差示分析法分離目的基因克隆1、mRNA差別顯示技術(shù)（優(yōu)點(diǎn)：可檢測表達(dá)的所有基因；同時檢測基因的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)、展現(xiàn)所有差異、比較多種細(xì)胞類型；缺點(diǎn)：檢測全部mRNA的PCR工作量很大；

PAGE分離的cDNA大于500bp時會漏檢，凝膠分析最多為50-100條；差別條帶成簇時造成假陽性；

Northern印跡繁雜費(fèi)時；本底較高。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：五、功能結(jié)合法篩選目的基