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文檔簡介

層析

CHROMATOGRAPHY1行業(yè)學習層析

CHROMATOGRAPHY1行業(yè)學習掌握:層析的概念、一般原理

凝膠層析的基本原理裝層析柱的過程及裝柱要求熟悉:層析技術(shù)的分類凝膠層析的特點凝膠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)了解:凝膠的選擇柱、樣品、洗脫液的選擇凝膠的保存2行業(yè)學習掌握:層析的概念、一般原理2行業(yè)學習一.概述

層析Chromatography(色譜),利用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)間的差異(溶解度、分子極性、分子大小、分子形狀、吸附能力、分子親合力等),使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域,借此將各組分分離。3行業(yè)學習一.概述層析Chromatogra色譜歷史古羅馬人分析混合染料(類似輻射紙色譜)1903(1906)年,MichaelTswett提出色譜法1931年,Kuhn采用柱色譜分離了類胡蘿卜素1941年,Martin和Synge提出分配色譜法1944年,Martin等又提出紙色譜法1952年,Martin和James發(fā)明了氣液色譜法1955年,第一臺商品氣相色譜問世,標志著現(xiàn)代色譜分析的建立1956年,Stahl系統(tǒng)研究了薄層色譜法(TLC)4行業(yè)學習色譜歷史古羅馬人分析混合染料(類似輻射紙色譜)1903(191958年,Stein和Moore研制出氨基酸分析儀,確定了核糖核酸的分子結(jié)構(gòu)1967年,Horvvath和Huber等研制了高效液相色譜(high-performanceliquidchromatography,HPLC)儀1975年,Small等提出離子色譜

20世紀80年代,超臨界色譜20世紀90年代,毛細管電泳(1809年Re?ss第一次電泳實驗)21世紀,聯(lián)用技術(shù)、大分子色譜分離、制備色譜可望取得更大的發(fā)展5行業(yè)學習1958年,Stein和Moore研制出氨基酸分析儀,確定了層析法進行時有兩個相,一個相稱為固定相(Stationaryphase),另一相稱為流動相(Mobilephase)。由于各組分所受固定相的阻力和流動相的推力影響不同,各組分移動速度也各異,從而使各組分得到分離。6行業(yè)學習層析法進行時有兩個相,一個相稱為固定7行業(yè)學習7行業(yè)學習二.層析技術(shù)的分類

1.按兩相所處的狀態(tài)分類以液體作為流動相的層析稱為液相層析,以氣體作為流動相的稱為氣相層析。其固定相也可有兩種狀態(tài),一種是以固體作為吸附劑的固定相,另一種是以涂布在固體載體表面的液體作為固定相。8行業(yè)學習二.層析技術(shù)的分類1.按兩相所處的狀態(tài)分類8行業(yè)學習層析氣相層析(gas-chromatography)液相層析(liquid-chromatography)氣-固層析(gas-solidchromatography)氣-液層析(gas-liquidchromatography)液-固層析(liquid-solidchromatography)液-液層析(liquid-liquidchromatography)9行業(yè)學習層析氣相層析(gas-chromatography)液相層析2.按層析過程的機制可分為.吸附層析(adsorptionchromatography)

----利用吸附劑對不同組分吸附能力的不同加以分離的方法。.分配層析(partitionchromatography)

----利用不同組分在流動相和固定相中的

分配系數(shù)不同而進行分離的方法。10行業(yè)學習2.按層析過程的機制可分為10行業(yè)學習.離子交換層析(ion-exchangechromatography)

----利用離子交換劑與各組分之間的離子親和力不同而進行層析分離的方法。.凝膠層析(gelchromatography)

----利用不同組分之間分子大小不同,在通過凝膠介質(zhì)時所受到的阻滯作用的差異而進行分離的方法。.親和層析(affinitychromatography)----利用生物大分子之間特有親和力的不同進分離純化的方法。11行業(yè)學習.離子交換層析11行業(yè)學習3.按操作技術(shù)形式分類.柱層析(columchromatography)

----將固定相裝在層析柱中,使樣品朝著一個方向移動,通過各組分隨流動相流動而得到分離的方法。12行業(yè)學習3.按操作技術(shù)形式分類12行業(yè)學習紙層析(paperchrmatography)

----用紙作為液體的載體,樣品點在紙上隨后展開達到分離鑒定的方法。.薄層層析(thinlayperchromatography)

----將適當?shù)奈絼┰诓AО寤蚱渌牧媳“迳箱伋杀?,樣品點在上面隨后用流動相展開達到分離鑒定的方法。13行業(yè)學習紙層析(paperchrmatography)13行業(yè)三.層析的一般原理

14行業(yè)學習三.層析的一般原理14行業(yè)學習1.分配系數(shù)(Partitionchromatography)混合物在層析過程中不管層析技術(shù)采用哪兩種狀態(tài)的相(流動相和固定相)都能達到分配平衡,用來敘述一種物質(zhì)在兩種特定相中的分配程度是用分配系數(shù)表示的。15行業(yè)學習1.分配系數(shù)15行業(yè)學習

分配系數(shù)----是一種物質(zhì)在兩種特定相中分配,在特定的溫度時這個系數(shù)的值是一個常數(shù),即:溶質(zhì)在固定相中的濃度CsK=————————————=——

溶質(zhì)在流動相中的濃度Cm16行業(yè)學習分配系數(shù)----是一種物質(zhì)在兩種特定相中分配,在特定的溫度有效分配系數(shù):定義為化合物在一個相的總量除以另一個相中的總量。實際上是分配系數(shù)乘以兩個相的體積比。在不同的層析機制中,分配系數(shù)K的含義不同,在吸附層析中,K為吸附平衡常數(shù);在分配層析中,K為分配系數(shù);在離子交換層析中K為交換常數(shù).17行業(yè)學習有效分配系數(shù):定義為化合物在一個相的總量除以另一個相中的總量

分配系數(shù)K值大,說明物質(zhì)在層析中被固定相吸附得比較牢固,隨流動相遷移的速度較慢,留在固定相中的時間較長,在洗脫液中后出峰。若分配系數(shù)K值小,則該物質(zhì)在洗脫液中較早出峰。18行業(yè)學習分配系數(shù)K值大,說明物質(zhì)在層析中被固

從一個混合物中分離和純化一種生物物質(zhì)的純度如何,取決于混合物中各組分K值的差異程度。混合物中各組分若K值相差較大,則能較易地把混合物中的生物物質(zhì)分離。反之,K值相差較小,不易把混合物中的生物物質(zhì)分離。19行業(yè)學習從一個混合物中分離和純化一種生物物質(zhì)2.討論層析中的移動情況通常采用平衡過程的研究方法,把層析柱劃分為若干連續(xù)部分,每個體系都達到平衡。理論板數(shù)(n):在層析柱上,溶劑連續(xù)不斷加入,化合物在流動相和固定相中不斷分配平衡,所發(fā)生的平衡次數(shù)稱為理論板數(shù)。20行業(yè)學習2.討論層析中的移動情況20行業(yè)學習

凝膠層析

GelChromatography

21行業(yè)學習凝膠層析

GelChromato一、定義

凝膠層析…是按照被分離物質(zhì)分子大小,經(jīng)過具有一定孔徑的多孔物質(zhì)進行分離的一種方法。其又稱為凝膠過濾或分子篩過濾或排阻層析。22行業(yè)學習一、定義

凝膠層析…是按照被分離物主要機理是分子篩效應(yīng),當被分離物質(zhì)流經(jīng)凝膠柱時,因各組份的分子大小不同,在凝膠受到的阻滯作用有差異,從而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。23行業(yè)學習主要機理是分子篩效應(yīng),當被分離物質(zhì)流二.基本原理

流動相(洗脫液)固定相(凝膠)

原理:被分離物質(zhì)中各組分的分子量不同。24行業(yè)學習二.基本原理流動相(洗脫液)24行業(yè)學習進入具有一定孔徑的凝膠柱后,較大的分子不能進入凝膠孔隙中,被排阻在外,而較小的分子則能進入凝膠孔隙,加入洗脫劑后,大分子就隨洗脫劑從凝膠間隙洗脫下來,受到的阻力小,其流速較快,小分子物質(zhì)從上一層凝膠孔隙中出來又擴散到下一層凝膠孔隙中,這樣多次反復,大分子物質(zhì)先從柱中流出,小分子物質(zhì)后流出。25行業(yè)學習進入具有一定孔徑的凝膠柱后,較大的分26行業(yè)學習26行業(yè)學習27行業(yè)學習27行業(yè)學習

小分子由于擴散作用進入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留,大分子被排阻在凝膠顆粒外面,在顆粒之間迅速通過。28行業(yè)學習小分子由于擴散作用進入凝膠顆粒內(nèi)部而凝膠層析過程的數(shù)理關(guān)系

柱床體積(VT)……即凝膠體積以及顆粒內(nèi)外間隙體積的總和。VT=1/4D2hD是內(nèi)壁的直徑h是凝膠層析柱床的高度。29行業(yè)學習凝膠層析過程的數(shù)理關(guān)系柱床體積(VT)……即凝膠體積洗脫體積(Ve)…即欲分離物質(zhì)通過層析柱洗脫下來所需洗脫液的總體積。外水體積(V0)…即存在于柱床內(nèi)凝膠外面空隙之間的水相體積,相應(yīng)于一般層析法中流動相的體積。30行業(yè)學習洗脫體積(Ve)…即欲分離物質(zhì)通過層析30行業(yè)學習內(nèi)水體積(Vi)…即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積,它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量求得。凝膠干體積(Vg)31行業(yè)學習內(nèi)水體積(Vi)…即凝膠顆粒內(nèi)部所含31行業(yè)學習VT=V0+Vi+Vg

32行業(yè)學習VT=V0+Vi+Vg32行業(yè)學習洗脫體積與Vo及Vi之間的關(guān)系

Ve=Vo+KdViKd=(Ve-Vo)/Vi33行業(yè)學習洗脫體積與Vo及Vi之間的關(guān)系Ve=Vo+KdVi33行業(yè)Kd為樣品組分的分配系數(shù),也可以說Kd是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配系數(shù)。它只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆粒孔隙的大小分布有關(guān),而與柱的長短粗細無關(guān),也就是說它對每一物質(zhì)為常數(shù)與柱的物理條件無關(guān)。34行業(yè)學習Kd為樣品組分的分配系數(shù),也可以說34行業(yè)學習Kd可通過實驗求得。

Ve為實際測得洗脫體積。

Vo可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液(最好有顏色以便于觀察如Hb、印度黑墨水)通過實際測量求出.Vi可由g·Wr求得(g為干凝膠重,單位為克,Wr為凝膠的吸水量以ml/g表示)。35行業(yè)學習Kd可通過實驗求得。35行業(yè)學習

Ve-VoKd=————Vi(1)Kd=0時,Ve=Vo,意味著該分子完全被排阻于凝膠顆粒之外,全部分布于流動相里,在固定相分布為0,而最先流出。(2)當Kd=1時,Ve=Vo+Vi,意味著該分子完全不被排阻,可以自由地擴散進入凝膠顆粒內(nèi)部,它能均等地分布在流動相和固定相里,在兩相分配的比值為1,而最后流出.(3)當0<Kd<1,Ve=Vo+ViKd為處于兩種極端行為之間的分子。

36行業(yè)學習

(4)Kd>1現(xiàn)象說明凝膠對組分有吸附作用,此時Ve>Vo+Vi,例如一些芳香族化合物的洗脫體積遠遠超出理論計算的最大值,這些化合物的Kd>1如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。37行業(yè)學習(4)Kd>1現(xiàn)象說明凝膠對組分有吸附作用,此時Ve>V因此分子的正常Kd值0~1之間,這種由小到大的Kd值順序決定了物質(zhì)流出的順序。38行業(yè)學習因此分子的正常Kd值0~1之間,這種由小到大的Kd值順序決定Ve與MW的關(guān)系

對同一類型的化合物,洗脫特性與組分的分子量有關(guān),流過凝膠柱時,按分子量(MW)大小順序流出,MW大的走在前面,Ve與MW的關(guān)系可用下式表示:

Ve=K1-K2lgMWK1K2為常數(shù),MW為分子量39行業(yè)學習Ve與MW的關(guān)系對同一類型的化合物三.凝膠層析的特點

40行業(yè)學習三.凝膠層析的特點40行業(yè)學習(一)優(yōu)點

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其結(jié)

構(gòu)穩(wěn)定,所以凝膠本身不與樣品發(fā)生化

學反應(yīng)。2.凝膠層析的操作條件較溫和,不易引起生物物質(zhì)的變性,即使用來分離一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)也很少被破壞。3.樣品得率高,重復性好.如果按比例擴大柱的體積和高度,可進行大量樣品的分離純化。41行業(yè)學習(一)優(yōu)點

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其結(jié)4(二)缺點1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限,所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3.凝膠結(jié)構(gòu)對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用,如芳香族化合物與脂蛋白等。

42行業(yè)學習(二)缺點1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。42行業(yè)學習四.凝膠的結(jié)構(gòu)與性能

1.葡聚糖凝膠(商品名為Sephadex)

結(jié)構(gòu):葡聚糖用交聯(lián)劑1-氯代-2,3-環(huán)丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。OH43行業(yè)學習四.凝膠的結(jié)構(gòu)與性能

1.葡聚糖凝膠(商品名為Sephad特點:

Sephadex的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)度,交聯(lián)度的大小可在合成Sephadex時控制加入交聯(lián)劑的百分比決定.交聯(lián)劑的百分比高,交聯(lián)度大,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)愈緊密,孔隙愈小,吸水后膨脹也愈小,機械強度高,分離物質(zhì)的分子量也小。反之,交聯(lián)劑的百分比低,分離物質(zhì)的分子量大。G類Sephadex的型號表示每克干凝膠吸水量x10,如G-50表示每克干凝膠吸水量為5ml。Sephadex的化學性質(zhì)穩(wěn)定,不溶于水、鹽、弱酸和堿,耐熱耐堿不耐酸。44行業(yè)學習特點:44行業(yè)學習2.瓊脂糖凝膠(商品名為Sepharose)

它是一種大孔凝膠,其工作范圍的下限幾乎是Sephadex的上限,可分離MW40萬以上的物質(zhì),因此可用來分離核酸及病毒。瓊脂糖凝膠不帶電荷,不受微生物作用而降解,但對熱不穩(wěn)定,易受pH影響(只在pH4.5-9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定.45行業(yè)學習2.瓊脂糖凝膠(商品名為Sepharose)45行業(yè)學習3.聚丙烯酰胺凝膠使用范圍及效果同葡聚糖凝膠相似,但化學性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定,可在pH2-11范圍內(nèi)使用.聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-P(Bio-GelP),由美國Bio-Rod廠生產(chǎn),型號很多,從P-2至P-300共10種,P后面的數(shù)字再乘1000就相當于該凝膠的排阻限度。

46行業(yè)學習3.聚丙烯酰胺凝膠46行業(yè)學習4.凝膠的選擇選擇何種凝膠以及它的型號,這需要根據(jù)實驗條件,溶質(zhì)的分子量的大小和分離工作的目的而定,每種型號凝膠都有一定分離溶質(zhì)分子量的范圍,選擇的型號凝膠要能滿足實驗要求。47行業(yè)學習4.凝膠的選擇47行業(yè)學習六.其它條件選擇

1.柱的選擇層析的長度(L)與直徑(D)之比(L/D)對層析分辨率有影響,一般對用于組別分離的層析柱其L/D為15~18:1,層析柱的體積一般大于樣品體積的4~10倍,這類常用于脫鹽.對于分級分離可采用L/D40:1,甚至100:1,層析柱體積一般大于樣品體積的25倍。柱短而粗,則易使樣品稀釋,柱長而窄,則柱的管壁效應(yīng)較大,會造成拖尾現(xiàn)象。48行業(yè)學習六.其它條件選擇

1.柱的選擇48行業(yè)學習2.樣品的選擇:

量適當,粘度小。3.洗脫液的選擇:每種樣品分離所用的緩沖洗脫液應(yīng)根據(jù)使樣品穩(wěn)定的原則使用。49行業(yè)學習2.樣品的選擇:49行業(yè)學習七.應(yīng)用

1.分離純化2.脫鹽3.高分子溶液的濃縮4.測分子量50行業(yè)學習七.應(yīng)用

1.分離純化50行業(yè)學習凝膠層析法分離蛋白質(zhì)

51行業(yè)學習凝膠層析法分離蛋白質(zhì)51行業(yè)學習[原理]血紅蛋白(Hb,分子量64480左右)與二硝基苯—魚精蛋白(DNP—魚精蛋白,分子量2000—12000)混合物,由于分子大小不同,通過SephadexG—50層析受阻滯程度有差異,從而達到分離。52行業(yè)學習[原理]血紅蛋白(Hb,分子量64480左右)與二硝基[器材]層析柱(1.5×25ml)等[試劑]1.樣品液:DNP-魚精蛋白、Hb2.SephadexG-5053行業(yè)學習[器材]53行業(yè)學習[操作]1.裝柱:在層析柱的底部出口套上乳膠塑料管,向?qū)游鲋鶅?nèi)加蒸餾水趕走在層析柱的死體積和接口處的氣泡,在蒸餾水高度約占體積的1/3時,關(guān)閉下端出口,自頂部緩緩加入已處理好的SephadexG-50懸液,待底部凝膠沉積1~2cm時,再打開出口,凝膠加至凝膠沉積離層析柱口約3cm即可。

54行業(yè)學習[操作]1.裝柱:在層析柱的底部出口套上乳膠塑料管,向?qū)游鲅b柱注意點:不得有氣泡和分層;凝膠表面應(yīng)平整;柱床體積穩(wěn)定;不能讓凝膠表面露出水面。55行業(yè)學習裝柱注意點:55行業(yè)學習2.加樣:取樣品液5滴即為上柱樣品。將出口打開,使表面的蒸餾水流出,直至恰好與表面相平(不可使床面干掉),關(guān)緊出口,用滴管將上述樣品緩緩地加到床表面,注意盡量不要使平整的床表面攪動,然后打開出口,讓樣品進入床內(nèi),直至床面恰好露出,用上法不斷加蒸餾水洗滌,立即用試管收集,待紅色流盡,換試管收集。56行業(yè)學習2.加樣:取樣品液5滴即為上柱樣品。將出口打開,使表面的蒸3.觀察實驗現(xiàn)象,并計算Hb的洗脫體積(Ve)和DNP-魚精蛋白的Ve。4.再生用蒸餾水洗滌凝膠層析柱10分鐘,此柱即可再生。57行業(yè)學習3.觀察實驗現(xiàn)象,并計算Hb的洗脫體積(Ve)和DNP-魚把菊根粉或白堊粉(CaCO3)裝在玻璃管中,將植物葉子的石油醚提取液倒入管中,然后加入石油醚淋洗。隨著淋洗進行,樣品中各種色素向下移動的速度不同,逐漸形成一圈圈的連續(xù)色帶。茨維特在當時的實驗中觀察到6個色帶,它們分別是胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素A和B。提取液色帶ChromatographiccolumnStationaryphaseMobilephaseoreluent

58行業(yè)學習把菊根粉或白堊粉(CaCO3)裝在玻璃管中,將植物葉子的石油Themobile(top)andstationary(bottom)phasesincolumnchromatography.

59行業(yè)學習Themobile(top)andstationarPaperchromatographyisananalyticalmethod.Notetheverysmallsamplevolumespottedontotheplate.60行業(yè)學習Paperchromatographyisanana姜黃素浸膏薄層色譜實驗一、展開劑:按二氯甲烷:甲醇=9:1配制展開劑倒入層析缸中約10-20ml

二、點樣:用易揮發(fā)溶劑乙醇溶解樣品,在硅膠板上約距底0.5~1cm間用鉛筆輕化一橫線用毛細管蘸樣進行點樣。三、展開:將點好樣的硅膠板放入層析缸進行層析。61行業(yè)學習姜黃素浸膏薄層色譜實驗61行業(yè)學習間良好的展開劑Rf在0.15~0.75之62行業(yè)學習間良好的展開劑Rf在0.15~0.75之62行業(yè)學習硅膠H---不含粘合劑的硅膠;硅膠G—含煅燒石膏粘合劑硅膠HF254---含熒光物質(zhì);GF254---含煅燒石膏又含熒光物質(zhì);注意事項:1.點樣要集中,不要擴散太開,要有一定的濃度;2.放入展開瓶中時,點樣不能再液面下,必修在液面上;3.展開過程要保持靜置;4.展開結(jié)束要在溶劑前沿及時畫線,溶劑前沿最高到距邊緣0.5cm;63行業(yè)學習硅膠H---不含粘合劑的硅膠;硅膠G—含煅燒石膏粘合劑63行萬壽菊浸膏柱層析實驗洗脫劑按:二氯甲烷:甲醇=

9.5:0.5配制制樣:把姜黃素浸膏用少量乙醇后加入少量硅膠附著原料干燥后備用。裝柱:可采用干法或濕法裝柱,1.干法是直接把硅膠粉裝入層析柱中敲動震蕩均勻即可,缺點是難于裝的均勻。2.濕法是在硅膠粉中倒入一定量的石油醚攪拌均勻后關(guān)閉層析柱下口閥門,倒入硅膠粉與石油醚的混合物然其自然均勻下落然后打開閥門排除石油醚剛好到沉降的硅膠面。優(yōu)點是硅膠裝柱均勻,缺點是密度小,繁瑣。洗脫劑按:二氯甲烷:甲醇=

9.5:0.5配制制樣:把姜黃素浸膏用少量乙醇后加入少量硅膠附著原料干燥后備用。裝柱:可采用干法或濕法裝柱,干法是直接把硅膠粉裝入層析柱中敲動震蕩均勻即可,缺點是難于裝的均勻。濕法是在硅膠粉中倒入一定量的石油醚攪拌均勻后關(guān)閉層析柱下口閥門,倒入硅膠粉與石油醚的混合物然其自然均勻下落然后打開閥門排除石油醚剛好到沉降的硅膠面。優(yōu)點是硅膠裝柱均勻,缺點是密度小,64行業(yè)學習萬壽菊浸膏柱層析實驗洗脫劑按:二氯甲烷:甲醇=9.5:0上樣:采用干法上樣,把治好的樣品裝入層析柱中敲動振蕩均勻,上面再裝入一層脫脂棉花。洗脫:倒入洗脫劑進行層析,直到洗脫出需要段的產(chǎn)品。收集、蒸餾:將收集到以分離開的收集段進行蒸餾即可得到純品;65行業(yè)學習上樣:采用干法上樣,把治好的樣品裝入層析柱中敲動振蕩均勻,層析

CHROMATOGRAPHY66行業(yè)學習層析

CHROMATOGRAPHY1行業(yè)學習掌握:層析的概念、一般原理

凝膠層析的基本原理裝層析柱的過程及裝柱要求熟悉:層析技術(shù)的分類凝膠層析的特點凝膠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)了解:凝膠的選擇柱、樣品、洗脫液的選擇凝膠的保存67行業(yè)學習掌握:層析的概念、一般原理2行業(yè)學習一.概述

層析Chromatography(色譜),利用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)間的差異(溶解度、分子極性、分子大小、分子形狀、吸附能力、分子親合力等),使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域,借此將各組分分離。68行業(yè)學習一.概述層析Chromatogra色譜歷史古羅馬人分析混合染料(類似輻射紙色譜)1903(1906)年,MichaelTswett提出色譜法1931年,Kuhn采用柱色譜分離了類胡蘿卜素1941年,Martin和Synge提出分配色譜法1944年,Martin等又提出紙色譜法1952年,Martin和James發(fā)明了氣液色譜法1955年,第一臺商品氣相色譜問世,標志著現(xiàn)代色譜分析的建立1956年,Stahl系統(tǒng)研究了薄層色譜法(TLC)69行業(yè)學習色譜歷史古羅馬人分析混合染料(類似輻射紙色譜)1903(191958年,Stein和Moore研制出氨基酸分析儀,確定了核糖核酸的分子結(jié)構(gòu)1967年,Horvvath和Huber等研制了高效液相色譜(high-performanceliquidchromatography,HPLC)儀1975年,Small等提出離子色譜

20世紀80年代,超臨界色譜20世紀90年代,毛細管電泳(1809年Re?ss第一次電泳實驗)21世紀,聯(lián)用技術(shù)、大分子色譜分離、制備色譜可望取得更大的發(fā)展70行業(yè)學習1958年,Stein和Moore研制出氨基酸分析儀,確定了層析法進行時有兩個相,一個相稱為固定相(Stationaryphase),另一相稱為流動相(Mobilephase)。由于各組分所受固定相的阻力和流動相的推力影響不同,各組分移動速度也各異,從而使各組分得到分離。71行業(yè)學習層析法進行時有兩個相,一個相稱為固定72行業(yè)學習7行業(yè)學習二.層析技術(shù)的分類

1.按兩相所處的狀態(tài)分類以液體作為流動相的層析稱為液相層析,以氣體作為流動相的稱為氣相層析。其固定相也可有兩種狀態(tài),一種是以固體作為吸附劑的固定相,另一種是以涂布在固體載體表面的液體作為固定相。73行業(yè)學習二.層析技術(shù)的分類1.按兩相所處的狀態(tài)分類8行業(yè)學習層析氣相層析(gas-chromatography)液相層析(liquid-chromatography)氣-固層析(gas-solidchromatography)氣-液層析(gas-liquidchromatography)液-固層析(liquid-solidchromatography)液-液層析(liquid-liquidchromatography)74行業(yè)學習層析氣相層析(gas-chromatography)液相層析2.按層析過程的機制可分為.吸附層析(adsorptionchromatography)

----利用吸附劑對不同組分吸附能力的不同加以分離的方法。.分配層析(partitionchromatography)

----利用不同組分在流動相和固定相中的

分配系數(shù)不同而進行分離的方法。75行業(yè)學習2.按層析過程的機制可分為10行業(yè)學習.離子交換層析(ion-exchangechromatography)

----利用離子交換劑與各組分之間的離子親和力不同而進行層析分離的方法。.凝膠層析(gelchromatography)

----利用不同組分之間分子大小不同,在通過凝膠介質(zhì)時所受到的阻滯作用的差異而進行分離的方法。.親和層析(affinitychromatography)----利用生物大分子之間特有親和力的不同進分離純化的方法。76行業(yè)學習.離子交換層析11行業(yè)學習3.按操作技術(shù)形式分類.柱層析(columchromatography)

----將固定相裝在層析柱中,使樣品朝著一個方向移動,通過各組分隨流動相流動而得到分離的方法。77行業(yè)學習3.按操作技術(shù)形式分類12行業(yè)學習紙層析(paperchrmatography)

----用紙作為液體的載體,樣品點在紙上隨后展開達到分離鑒定的方法。.薄層層析(thinlayperchromatography)

----將適當?shù)奈絼┰诓AО寤蚱渌牧媳“迳箱伋杀樱瑯悠伏c在上面隨后用流動相展開達到分離鑒定的方法。78行業(yè)學習紙層析(paperchrmatography)13行業(yè)三.層析的一般原理

79行業(yè)學習三.層析的一般原理14行業(yè)學習1.分配系數(shù)(Partitionchromatography)混合物在層析過程中不管層析技術(shù)采用哪兩種狀態(tài)的相(流動相和固定相)都能達到分配平衡,用來敘述一種物質(zhì)在兩種特定相中的分配程度是用分配系數(shù)表示的。80行業(yè)學習1.分配系數(shù)15行業(yè)學習

分配系數(shù)----是一種物質(zhì)在兩種特定相中分配,在特定的溫度時這個系數(shù)的值是一個常數(shù),即:溶質(zhì)在固定相中的濃度CsK=————————————=——

溶質(zhì)在流動相中的濃度Cm81行業(yè)學習分配系數(shù)----是一種物質(zhì)在兩種特定相中分配,在特定的溫度有效分配系數(shù):定義為化合物在一個相的總量除以另一個相中的總量。實際上是分配系數(shù)乘以兩個相的體積比。在不同的層析機制中,分配系數(shù)K的含義不同,在吸附層析中,K為吸附平衡常數(shù);在分配層析中,K為分配系數(shù);在離子交換層析中K為交換常數(shù).82行業(yè)學習有效分配系數(shù):定義為化合物在一個相的總量除以另一個相中的總量

分配系數(shù)K值大,說明物質(zhì)在層析中被固定相吸附得比較牢固,隨流動相遷移的速度較慢,留在固定相中的時間較長,在洗脫液中后出峰。若分配系數(shù)K值小,則該物質(zhì)在洗脫液中較早出峰。83行業(yè)學習分配系數(shù)K值大,說明物質(zhì)在層析中被固

從一個混合物中分離和純化一種生物物質(zhì)的純度如何,取決于混合物中各組分K值的差異程度。混合物中各組分若K值相差較大,則能較易地把混合物中的生物物質(zhì)分離。反之,K值相差較小,不易把混合物中的生物物質(zhì)分離。84行業(yè)學習從一個混合物中分離和純化一種生物物質(zhì)2.討論層析中的移動情況通常采用平衡過程的研究方法,把層析柱劃分為若干連續(xù)部分,每個體系都達到平衡。理論板數(shù)(n):在層析柱上,溶劑連續(xù)不斷加入,化合物在流動相和固定相中不斷分配平衡,所發(fā)生的平衡次數(shù)稱為理論板數(shù)。85行業(yè)學習2.討論層析中的移動情況20行業(yè)學習

凝膠層析

GelChromatography

86行業(yè)學習凝膠層析

GelChromato一、定義

凝膠層析…是按照被分離物質(zhì)分子大小,經(jīng)過具有一定孔徑的多孔物質(zhì)進行分離的一種方法。其又稱為凝膠過濾或分子篩過濾或排阻層析。87行業(yè)學習一、定義

凝膠層析…是按照被分離物主要機理是分子篩效應(yīng),當被分離物質(zhì)流經(jīng)凝膠柱時,因各組份的分子大小不同,在凝膠受到的阻滯作用有差異,從而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。88行業(yè)學習主要機理是分子篩效應(yīng),當被分離物質(zhì)流二.基本原理

流動相(洗脫液)固定相(凝膠)

原理:被分離物質(zhì)中各組分的分子量不同。89行業(yè)學習二.基本原理流動相(洗脫液)24行業(yè)學習進入具有一定孔徑的凝膠柱后,較大的分子不能進入凝膠孔隙中,被排阻在外,而較小的分子則能進入凝膠孔隙,加入洗脫劑后,大分子就隨洗脫劑從凝膠間隙洗脫下來,受到的阻力小,其流速較快,小分子物質(zhì)從上一層凝膠孔隙中出來又擴散到下一層凝膠孔隙中,這樣多次反復,大分子物質(zhì)先從柱中流出,小分子物質(zhì)后流出。90行業(yè)學習進入具有一定孔徑的凝膠柱后,較大的分91行業(yè)學習26行業(yè)學習92行業(yè)學習27行業(yè)學習

小分子由于擴散作用進入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留,大分子被排阻在凝膠顆粒外面,在顆粒之間迅速通過。93行業(yè)學習小分子由于擴散作用進入凝膠顆粒內(nèi)部而凝膠層析過程的數(shù)理關(guān)系

柱床體積(VT)……即凝膠體積以及顆粒內(nèi)外間隙體積的總和。VT=1/4D2hD是內(nèi)壁的直徑h是凝膠層析柱床的高度。94行業(yè)學習凝膠層析過程的數(shù)理關(guān)系柱床體積(VT)……即凝膠體積洗脫體積(Ve)…即欲分離物質(zhì)通過層析柱洗脫下來所需洗脫液的總體積。外水體積(V0)…即存在于柱床內(nèi)凝膠外面空隙之間的水相體積,相應(yīng)于一般層析法中流動相的體積。95行業(yè)學習洗脫體積(Ve)…即欲分離物質(zhì)通過層析30行業(yè)學習內(nèi)水體積(Vi)…即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積,它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量求得。凝膠干體積(Vg)96行業(yè)學習內(nèi)水體積(Vi)…即凝膠顆粒內(nèi)部所含31行業(yè)學習VT=V0+Vi+Vg

97行業(yè)學習VT=V0+Vi+Vg32行業(yè)學習洗脫體積與Vo及Vi之間的關(guān)系

Ve=Vo+KdViKd=(Ve-Vo)/Vi98行業(yè)學習洗脫體積與Vo及Vi之間的關(guān)系Ve=Vo+KdVi33行業(yè)Kd為樣品組分的分配系數(shù),也可以說Kd是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配系數(shù)。它只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆??紫兜拇笮》植加嘘P(guān),而與柱的長短粗細無關(guān),也就是說它對每一物質(zhì)為常數(shù)與柱的物理條件無關(guān)。99行業(yè)學習Kd為樣品組分的分配系數(shù),也可以說34行業(yè)學習Kd可通過實驗求得。

Ve為實際測得洗脫體積。

Vo可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液(最好有顏色以便于觀察如Hb、印度黑墨水)通過實際測量求出.Vi可由g·Wr求得(g為干凝膠重,單位為克,Wr為凝膠的吸水量以ml/g表示)。100行業(yè)學習Kd可通過實驗求得。35行業(yè)學習

Ve-VoKd=————Vi(1)Kd=0時,Ve=Vo,意味著該分子完全被排阻于凝膠顆粒之外,全部分布于流動相里,在固定相分布為0,而最先流出。(2)當Kd=1時,Ve=Vo+Vi,意味著該分子完全不被排阻,可以自由地擴散進入凝膠顆粒內(nèi)部,它能均等地分布在流動相和固定相里,在兩相分配的比值為1,而最后流出.(3)當0<Kd<1,Ve=Vo+ViKd為處于兩種極端行為之間的分子。

101行業(yè)學習

(4)Kd>1現(xiàn)象說明凝膠對組分有吸附作用,此時Ve>Vo+Vi,例如一些芳香族化合物的洗脫體積遠遠超出理論計算的最大值,這些化合物的Kd>1如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。102行業(yè)學習(4)Kd>1現(xiàn)象說明凝膠對組分有吸附作用,此時Ve>V因此分子的正常Kd值0~1之間,這種由小到大的Kd值順序決定了物質(zhì)流出的順序。103行業(yè)學習因此分子的正常Kd值0~1之間,這種由小到大的Kd值順序決定Ve與MW的關(guān)系

對同一類型的化合物,洗脫特性與組分的分子量有關(guān),流過凝膠柱時,按分子量(MW)大小順序流出,MW大的走在前面,Ve與MW的關(guān)系可用下式表示:

Ve=K1-K2lgMWK1K2為常數(shù),MW為分子量104行業(yè)學習Ve與MW的關(guān)系對同一類型的化合物三.凝膠層析的特點

105行業(yè)學習三.凝膠層析的特點40行業(yè)學習(一)優(yōu)點

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其結(jié)

構(gòu)穩(wěn)定,所以凝膠本身不與樣品發(fā)生化

學反應(yīng)。2.凝膠層析的操作條件較溫和,不易引起生物物質(zhì)的變性,即使用來分離一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)也很少被破壞。3.樣品得率高,重復性好.如果按比例擴大柱的體積和高度,可進行大量樣品的分離純化。106行業(yè)學習(一)優(yōu)點

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其結(jié)4(二)缺點1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限,所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3.凝膠結(jié)構(gòu)對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用,如芳香族化合物與脂蛋白等。

107行業(yè)學習(二)缺點1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。42行業(yè)學習四.凝膠的結(jié)構(gòu)與性能

1.葡聚糖凝膠(商品名為Sephadex)

結(jié)構(gòu):葡聚糖用交聯(lián)劑1-氯代-2,3-環(huán)丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。OH108行業(yè)學習四.凝膠的結(jié)構(gòu)與性能

1.葡聚糖凝膠(商品名為Sephad特點:

Sephadex的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)度,交聯(lián)度的大小可在合成Sephadex時控制加入交聯(lián)劑的百分比決定.交聯(lián)劑的百分比高,交聯(lián)度大,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)愈緊密,孔隙愈小,吸水后膨脹也愈小,機械強度高,分離物質(zhì)的分子量也小。反之,交聯(lián)劑的百分比低,分離物質(zhì)的分子量大。G類Sephadex的型號表示每克干凝膠吸水量x10,如G-50表示每克干凝膠吸水量為5ml。Sephadex的化學性質(zhì)穩(wěn)定,不溶于水、鹽、弱酸和堿,耐熱耐堿不耐酸。109行業(yè)學習特點:44行業(yè)學習2.瓊脂糖凝膠(商品名為Sepharose)

它是一種大孔凝膠,其工作范圍的下限幾乎是Sephadex的上限,可分離MW40萬以上的物質(zhì),因此可用來分離核酸及病毒。瓊脂糖凝膠不帶電荷,不受微生物作用而降解,但對熱不穩(wěn)定,易受pH影響(只在pH4.5-9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定.110行業(yè)學習2.瓊脂糖凝膠(商品名為Sepharose)45行業(yè)學習3.聚丙烯酰胺凝膠使用范圍及效果同葡聚糖凝膠相似,但化學性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定,可在pH2-11范圍內(nèi)使用.聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-P(Bio-GelP),由美國Bio-Rod廠生產(chǎn),型號很多,從P-2至P-300共10種,P后面的數(shù)字再乘1000就相當于該凝膠的排阻限度。

111行業(yè)學習3.聚丙烯酰胺凝膠46行業(yè)學習4.凝膠的選擇選擇何種凝膠以及它的型號,這需要根據(jù)實驗條件,溶質(zhì)的分子量的大小和分離工作的目的而定,每種型號凝膠都有一定分離溶質(zhì)分子量的范圍,選擇的型號凝膠要能滿足實驗要求。112行業(yè)學習4.凝膠的選擇47行業(yè)學習六.其它條件選擇

1.柱的選擇層析的長度(L)與直徑(D)之比(L/D)對層析分辨率有影響,一般對用于組別分離的層析柱其L/D為15~18:1,層析柱的體積一般大于樣品體積的4~10倍,這類常用于脫鹽.對于分級分離可采用L/D40:1,甚至100:1,層析柱體積一般大于樣品體積的25倍。柱短而粗,則易使樣品稀釋,柱長而窄,則柱的管壁效應(yīng)較大,會造成拖尾現(xiàn)象。113行業(yè)學習六.其它條件選擇

1.柱的選擇48行業(yè)學習2.樣品的選擇:

量適當,粘度小。3.洗脫液的選擇:每種樣品分離所用的緩沖洗脫液應(yīng)根據(jù)使樣品穩(wěn)定的原則使用。114行業(yè)學習2.樣品的選擇:49行業(yè)學習七.應(yīng)用

1.分離純化2.脫鹽3.高分子溶液的濃縮4.測分子量115行業(yè)學習七.應(yīng)用

1.分離純化50行業(yè)學習凝膠層析法分離蛋白質(zhì)

116行業(yè)學習凝膠層析法分離蛋白質(zhì)51行業(yè)學習[原理]血紅蛋白(Hb,分子量64480左右)與二硝基苯—魚精蛋白(DNP—魚精蛋白,分子量2000—12000)混合物,由于分子大小不同,通過SephadexG—50層析受阻滯程度有差異,從而達到分離。117行業(yè)學習[原理]血紅蛋白(Hb,分子量64480左右)與二硝基[器材]層析柱(1.5×25ml)等[試劑]1.樣品液:DNP-魚精蛋白、Hb2.SephadexG-50118行業(yè)學習[器材]53行業(yè)學習[操作]1.裝柱:在層析柱的底部出口套上乳膠塑料管,向?qū)游鲋鶅?nèi)加蒸餾水趕走在層析柱的死體積和接口處的氣泡,在蒸餾水高度約占體積的1/3時,關(guān)閉下端出口,自頂部緩緩加入已處理好的SephadexG-50懸液,待底部凝膠

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