綜合性試驗(yàn)蛋白質(zhì)的分離提取SDS課件

蛋白電泳及印跡技術(shù)（一）

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)

蛋白電泳及印跡技術(shù)（一）

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離一、目的與要求

1.學(xué)習(xí)電泳原理和技術(shù)；

2.學(xué)習(xí)和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì)技術(shù)；一、目的與要求1.電泳的基本原理帶電荷的質(zhì)點(diǎn)，在一定條件的電場作用下，可向一極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。生物分子所帶電荷的多少取決于分子性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH及其組成?；旌衔镏懈鹘M分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及分子量和形狀的不同，在相同電場力的作用下，各組分泳動(dòng)的方向和速度也各異，可達(dá)到分離鑒定各組分的目的。二、實(shí)驗(yàn)原理1.電泳的基本原理帶電荷的質(zhì)點(diǎn)，在一定條件的電場作用下，可向2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理陰離子去污劑SDS（十二烷基硫酸鈉）可與蛋白質(zhì)相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性，失去原有的空間構(gòu)象，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使各種蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異被消除或大大降低，僅保留了分子大小的差異。蛋白質(zhì)分子在電場中的遷移速度僅僅取決于各自分子的大小。當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)相比較，可以得出各蛋白質(zhì)分子的分子量大小。綜合性試驗(yàn)蛋白質(zhì)的分離提取SDS課件3.聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要丙烯酰胺純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度高，可達(dá)10-6g；(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。3.聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：4.凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)分離蛋白質(zhì)或核酸的分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

蛋白質(zhì)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5

核酸(RNA) 104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 4.凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)5.聚丙烯凝膠電泳的種類聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。5.聚丙烯凝膠電泳的種類圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

圖1圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)圖2夾心垂直板電泳槽及凝膠模示意圖

返回圖2圖2夾心垂直板電泳槽及凝膠模示意圖

返回圖2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP（過硫酸銨）催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的不連續(xù)體系（1）樣品濃縮效應(yīng)

(a)凝膠孔徑不連續(xù)性：(b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；在pH6.7的凝膠緩沖體系中前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-)尾隨離子(trailingion)或慢離子：甘氨酸根

mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)；（c)電位梯度的不連續(xù)性：(2)分子篩效應(yīng)(3)電荷效應(yīng)（1）樣品濃縮效應(yīng)A.樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠孔徑的不連續(xù)性緩沖液成分及pH的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性

緩沖液濃縮膠樣品分離膠

緩沖液樣品濃縮膠分離膠A.樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：B.電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后pH增大(pH8.9)，Gly－解離度增大，不存在快、慢離子之分，蛋白質(zhì)樣品在均一電場強(qiáng)度和pH條件下泳動(dòng)。由于各種蛋白質(zhì)pI不同，所載有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)的有效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。

緩沖液濃縮膠分離膠B.電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后pH增大(pH8.9)，C.分子篩效應(yīng)分離膠的孔徑小，各分子由于大小和形狀不同，所受阻力不同，表現(xiàn)出不同的泳動(dòng)速度，即分子篩作用。分子量小，形狀為球形的泳動(dòng)速度最快。

緩沖液濃縮膠分離膠C.分子篩效應(yīng)分離膠的孔徑小，各分子由于大小和形狀不同，所受三操作步驟㈠貯液及凝膠溶液的配制貯液及凝膠溶液的配制方法如下表。貯液及凝膠溶液的配制貯液20mL凝膠溶液混合比5%凝膠10%凝膠IⅡ

ⅢⅣ

Acr30g凝膠貯液Bis0.8g

加蒸餾水到100ml凝膠緩沖液SDS0.2g

加0.2mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液至

100mlTEMED（四甲基乙二胺）蒸餾水100g/L過硫酸銨過硫酸銨1g

加蒸餾水至10ml3.33ml10ml20μl4.57ml0.1ml6.67ml10ml20μl1.23ml0.1ml三操作步驟貯液及凝膠溶液的配制貯（二）樣品制備將蛋白質(zhì)定量后溶解在含10g/LSDS、10g/L巰基乙醇的0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液中，100℃加熱2～5min。蛋白質(zhì)的最后濃度一般為0.05～1g/L。也可以將上述溶液在37℃保溫2h而不是100℃加熱。一般說來，兩種處理的效果都一樣。但如蛋白質(zhì)樣品中混有少量蛋白水解酶，37℃處理就會(huì)引起樣品水解，使測定失敗，而100℃加熱3min一般都能使蛋白酶失活，得到滿意的結(jié)果。也有少數(shù)例外的情況，需要采用特殊的樣品處理方法。（二）樣品制備（三）電泳

1.制備凝膠板（1）洗凈玻璃板，將長、短玻璃板分別插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。（2）將混合后的分離膠溶液，用細(xì)長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。（3）用1mL注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約3–4mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。約30-60min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。（4）倒去分離膠面的蒸餾水，將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細(xì)長頭的滴管加到長、短玻璃板的窄縫內(nèi)(即分離膠上方)，距短玻璃上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。（5）靜置10min左右，上膠即可聚合，再放置10-20min，制膠完成。安裝模具后入電泳裝置，加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5cm，輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。（三）電泳2.加樣用電泳緩沖液沖洗加樣孔，用微量注射器按順序向凝膠板中加樣，每孔加一種樣品，各加20μl（含蛋白質(zhì)10μg），同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker。多余的加樣孔用等量的1X上樣緩沖液補(bǔ)足。3.電泳加樣完畢，正確連接電泳槽及電泳儀,打開直流穩(wěn)壓電源（負(fù)極接上槽，正級接下槽，事先接好），將電流調(diào)至每管8mA。保持電流強(qiáng)度不變，待溴酚藍(lán)染料遷移至距下口約1cm處，停止電泳。約需1.5～2.0h。2.加樣4.染色與脫色電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記；加入染色液染色1-2h，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對遷移率。4.染色與脫色剝膠剝膠四.結(jié)果與計(jì)算

量出加樣端距電泳前沿即溴酚藍(lán)區(qū)帶中心的距離(cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm)，按下列公式計(jì)算相對遷移率mR:相對遷移率mR=

蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)四.結(jié)果與計(jì)算蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)單選題：1.SDS電泳分離蛋白質(zhì)中SDS是降低了下列哪個(gè)效應(yīng)：（A）電荷效應(yīng)（B）分子篩效應(yīng)（C）濃縮效應(yīng)答案A2.SDS電泳在濃縮膠階段，緩沖體系中各離子泳動(dòng)速度關(guān)系下列哪個(gè)是正確的？（A）cl－>protein

－

>Gly

－（B）Gly

－>cl－>protein－

(C)cl－>Gly

－

>protein

－

(D)protein

－

>Gly

－>cl－答案A3.SDS電泳不可用于下列哪項(xiàng)？（A）測定蛋白質(zhì)分子量（B）分離蛋白質(zhì)（C）蛋白質(zhì)絕對定量（D）蛋白質(zhì)鑒定答案C是非題：濃縮膠和分離膠中的緩沖液Tris-HCL的pH值是相同的。錯(cuò)SDS電泳中，在相同荷電和相同形狀條件下，分子量小的蛋白質(zhì)分子泳動(dòng)速度快。對SDS電泳中，分離膠比濃縮膠的濃度低。錯(cuò)單選題：蛋白電泳及印跡技術(shù)（一）

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)

蛋白電泳及印跡技術(shù)（一）

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離一、目的與要求

1.學(xué)習(xí)電泳原理和技術(shù)；

2.學(xué)習(xí)和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì)技術(shù)；一、目的與要求1.電泳的基本原理帶電荷的質(zhì)點(diǎn)，在一定條件的電場作用下，可向一極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。生物分子所帶電荷的多少取決于分子性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH及其組成?；旌衔镏懈鹘M分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及分子量和形狀的不同，在相同電場力的作用下，各組分泳動(dòng)的方向和速度也各異，可達(dá)到分離鑒定各組分的目的。二、實(shí)驗(yàn)原理1.電泳的基本原理帶電荷的質(zhì)點(diǎn)，在一定條件的電場作用下，可向2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理陰離子去污劑SDS（十二烷基硫酸鈉）可與蛋白質(zhì)相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性，失去原有的空間構(gòu)象，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使各種蛋白質(zhì)分子間原有的電荷差異被消除或大大降低，僅保留了分子大小的差異。蛋白質(zhì)分子在電場中的遷移速度僅僅取決于各自分子的大小。當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)相比較，可以得出各蛋白質(zhì)分子的分子量大小。綜合性試驗(yàn)蛋白質(zhì)的分離提取SDS課件3.聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要丙烯酰胺純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度高，可達(dá)10-6g；(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。3.聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：4.凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)分離蛋白質(zhì)或核酸的分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

蛋白質(zhì)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5

核酸(RNA) 104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 4.凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)5.聚丙烯凝膠電泳的種類聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。5.聚丙烯凝膠電泳的種類圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

圖1圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)圖2夾心垂直板電泳槽及凝膠模示意圖

返回圖2圖2夾心垂直板電泳槽及凝膠模示意圖

返回圖2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP（過硫酸銨）催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的不連續(xù)體系（1）樣品濃縮效應(yīng)

(a)凝膠孔徑不連續(xù)性：(b)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；在pH6.7的凝膠緩沖體系中前導(dǎo)離子或快離子：HC1解離出的氯根(C1-)尾隨離子(trailingion)或慢離子：甘氨酸根

mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白質(zhì)，G代表甘氨酸根)有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度)當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)；（c)電位梯度的不連續(xù)性：(2)分子篩效應(yīng)(3)電荷效應(yīng)（1）樣品濃縮效應(yīng)A.樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：凝膠孔徑的不連續(xù)性緩沖液成分及pH的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性

緩沖液濃縮膠樣品分離膠

緩沖液樣品濃縮膠分離膠A.樣品的濃縮效應(yīng)四個(gè)不連續(xù)性造成樣品濃縮效應(yīng)原理包括：B.電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后pH增大(pH8.9)，Gly－解離度增大，不存在快、慢離子之分，蛋白質(zhì)樣品在均一電場強(qiáng)度和pH條件下泳動(dòng)。由于各種蛋白質(zhì)pI不同，所載有效電荷不同，因此質(zhì)點(diǎn)的有效遷移率不同，形成不同區(qū)帶。

緩沖液濃縮膠分離膠B.電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)入分離膠后pH增大(pH8.9)，C.分子篩效應(yīng)分離膠的孔徑小，各分子由于大小和形狀不同，所受阻力不同，表現(xiàn)出不同的泳動(dòng)速度，即分子篩作用。分子量小，形狀為球形的泳動(dòng)速度最快。

緩沖液濃縮膠分離膠C.分子篩效應(yīng)分離膠的孔徑小，各分子由于大小和形狀不同，所受三操作步驟㈠貯液及凝膠溶液的配制貯液及凝膠溶液的配制方法如下表。貯液及凝膠溶液的配制貯液20mL凝膠溶液混合比5%凝膠10%凝膠IⅡ

ⅢⅣ

Acr30g凝膠貯液Bis0.8g

加蒸餾水到100ml凝膠緩沖液SDS0.2g

加0.2mol/L、pH7.2磷酸鹽緩沖液至

100mlTEMED（四甲基乙二胺）蒸餾水100g/L過硫酸銨過硫酸銨1g

加蒸餾水至10ml3.33ml10ml20μl4.57ml0.1ml6.67ml10ml20μl1.23ml0.1ml三操作步驟貯液及凝膠溶液的配制貯（二）樣品制備將蛋白質(zhì)定量后溶解在含10g/LSDS、10g/L巰基乙醇的0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液中，100℃加熱2～5min。蛋白質(zhì)的最后濃度一般為0.05～1g/L。也可以將上述溶液在37℃保溫2h而不是100℃加熱。一般說來，兩種處理的效果都一樣。但如蛋白質(zhì)樣品中混有少量蛋白水解酶，37℃處理就會(huì)引起樣品水解，使測定失敗，而100℃加熱3min一般都能使蛋白酶失活，得到滿意的結(jié)果。也有少數(shù)例外的情況，需要采用特殊的樣品處理方法。（二）樣品制備（三）電泳

1.制備凝膠板（1）洗凈玻璃板，將長、短玻璃板分別插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。（2）將混合后的分離膠溶液，用細(xì)長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。（3）用1mL注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約3–4mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。約30-60min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。（4）倒去分離膠面的蒸餾水，將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細(xì)長頭的滴管加到長、短玻璃板的窄縫內(nèi)(即分離膠上方)，距短玻璃上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。（5）靜置10min左右，上膠即可聚合，再放置10-20min，制膠完成。安裝模具后入電泳裝置，加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5c