缺氧對(duì)腸上皮細(xì)胞自噬的影響,病理學(xué)論文

缺氧對(duì)腸上皮細(xì)胞自噬的影響,病理學(xué)論文自噬〔autophagy〕是由Ashford和Porter[1]在1962年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在自個(gè)吃自個(gè)的現(xiàn)象后提出，系指由細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體等脫落的雙層膜包裹部分細(xì)胞質(zhì)和受損的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)，而后與溶酶體融合降解其所包裹內(nèi)容物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞器的更新[2].據(jù)研究[3-5],自噬在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用，且在各種應(yīng)激及疾病如缺血缺氧性損害、腫瘤、神經(jīng)退化等病理經(jīng)過(guò)中也扮演著至關(guān)重要的角色。嚴(yán)重?zé)齻騽?chuàng)傷后易發(fā)生失血性休克，導(dǎo)致全身組織缺血缺氧，為保證心腦血管等重要臟器血流供給，機(jī)體常出當(dāng)代償反響，即血液重分布，在血液重分布情況下腸道又是最常受累的器官，由腸道組織灌流缺乏、氧需求增加及高代謝所造成的缺氧，導(dǎo)致腸黏膜構(gòu)造與功能受損。缺血缺氧所致胃腸道上皮細(xì)胞的自噬情況當(dāng)前研究甚少，本研究利用體外缺氧模型模擬胃腸道缺血缺氧，動(dòng)態(tài)觀察Caco-2腸上皮細(xì)胞在缺氧條件下的自噬變化情況，旨在了解缺氧對(duì)腸上皮細(xì)胞自噬的影響，為研究自噬在缺氧后腸上皮損害中的作用奠定基礎(chǔ)。材料與方式方法1實(shí)驗(yàn)材料Caco-2腸上皮細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供，P62抗體、Beclin1抗體、-肌動(dòng)蛋白〔-actin〕抗體購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3〔LC3〕抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，辣根過(guò)氧化物酶〔HRP〕標(biāo)記二抗為美國(guó)SouthernBiotech公司產(chǎn)品，綠色熒光蛋白〔GFP〕-LC3B由第三軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)藥中試研究基地唐彬博士贈(zèng)送，改進(jìn)伊格爾培養(yǎng)基〔DMEM〕及復(fù)原血清培養(yǎng)基〔OPTI-MEM〕均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶購(gòu)自BBI公司，常氧培養(yǎng)箱和缺氧培養(yǎng)箱均購(gòu)自美國(guó)ThermoScientific公司，超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒為Advansta公司產(chǎn)品，聚偏二氟乙烯〔PVDF〕膜為Millipore公司產(chǎn)品，蛋白印跡相關(guān)試劑﹑蛋白測(cè)定試劑盒﹑電轉(zhuǎn)儀﹑電泳儀及ChemiDocXRS型凝膠圖像分析系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，UD-201型組織細(xì)胞超聲破碎儀購(gòu)自日本TOMY公司，冷凍離心機(jī)AllegraTMX-22R購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，TCSSPS型激光共聚焦顯微鏡為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品，H-600型透射電鏡為日本日立公司產(chǎn)品。2細(xì)胞培養(yǎng)與處理Caco-2細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清〔FBS〕、100g/mL鏈霉素、100U/mL青霉素、2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L非必需氨基酸、pH7.4的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至約90%融合時(shí)，用25g/L胰蛋白酶及0.53mmol/L乙二胺四乙酸液消化，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于6孔板，隔天更換培養(yǎng)液，直到細(xì)胞完全融合。將細(xì)胞接種于含蓋玻片〔鼠尾膠原包被〕的24孔板，到細(xì)胞貼壁后處理。細(xì)胞缺氧處理根據(jù)文獻(xiàn)方式方法[6]進(jìn)行，將細(xì)胞完全融合的6孔板放入缺氧培養(yǎng)箱中，充入由體積分?jǐn)?shù)為1%O2、5%CO2和94%N2組成的混合氣體〔重慶朝陽(yáng)氣體廠〕，放置于37C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)缺氧時(shí)間不同將細(xì)胞分為常氧組〔缺氧0h〕，缺氧〔0.5、1、2、6、12、24h〕組。將鼠尾膠原包被蓋玻片的24孔板分為常氧組〔正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h〕和缺氧6h組。3檢測(cè)指標(biāo)與方式方法3.1腸上皮細(xì)胞Beclin1、P62和LC3蛋白表示出的檢測(cè)采用蛋白質(zhì)免疫印跡法[7]檢測(cè)，以-actin作內(nèi)參，方式方法簡(jiǎn)述如下：用4℃磷酸鹽緩沖液〔PBS〕漂洗細(xì)胞后即參加細(xì)胞裂解液放置冰上低溫裂解細(xì)胞，收集樣本于1.5mL尖底離心并用細(xì)胞超聲破碎儀破碎，離心〔12000r/min、10min、4℃〕，取上清液煮沸5min,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺〔SDS〕凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1h,然后分別參加兔抗Beclin1抗體、兔抗P62抗體、兔抗LC3抗體及鼠抗-actin抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日以吐溫-20-三羥甲基氨基甲烷鹽緩沖液〔TBST〕洗膜4次后分別參加二抗HRP-羊抗兔IgG和HRP-羊抗鼠IgG,室溫孵育1h.再次用TBST洗膜4次后參加化學(xué)發(fā)光液，用凝膠圖像分析系統(tǒng)采集發(fā)光信號(hào)。QuantityOne軟件對(duì)蛋白表示出行相對(duì)定量分析，Beclin1及P62蛋白表示出量分別以Bec-lin1或P62與LC3Ⅰ蛋白的比值表示，LC3蛋白表示出量以LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值表示。3.2透射電鏡檢測(cè)自噬用細(xì)胞刮常規(guī)收集6孔板貼壁細(xì)胞，置于尖底離心管離心〔1000r/min、8min〕,吸去上清液，參加2.5%戊二醛固定液固定細(xì)胞團(tuán)，4℃固定2h后用PBS漂洗3次，15min/次。再于1%鋨酸固定液固定2h后用PBS漂洗3次，15min/次。乙醇梯度脫水后用環(huán)氧樹(shù)脂和丙酮等體積混合浸透過(guò)夜，聚合器中聚合，環(huán)氧樹(shù)脂618包埋，半薄切片定位、超薄切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，置于H-600型透射電鏡下觀察并拍照。3.3GFP-LC3B融合蛋白示蹤自噬體構(gòu)成擴(kuò)增GFP-LC3B融合蛋白表示出載體質(zhì)粒，抽提質(zhì)粒DNA并用紫外分光光度儀測(cè)定其濃度與純度后備用。將細(xì)胞接種于24孔板中的蓋玻片上，待其生長(zhǎng)24h后，嚴(yán)格根據(jù)Lipofectamine2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒〔美國(guó)Invitrogen公司〕講明書(shū)的方式方法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h后，將細(xì)胞分別置于常氧培養(yǎng)箱及缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6h后用PBS漂洗5min,1%多聚甲醛〔PFA〕固定30min,PBS漂洗3次〔5min/次〕后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以x珋s〔均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差〕表示，多組間均數(shù)比擬運(yùn)用單因素方差分析，P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P0.01有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1缺氧后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62和LC3蛋白表示出的變化如此圖1、2、3免疫印跡結(jié)果及表1定量分析結(jié)果所示，與正常對(duì)照〔0h〕相比擬，缺氧后腸上皮細(xì)胞Beclin1及LC3蛋白表示出均呈逐步增加趨勢(shì)，且均在缺氧后12h蛋白表示出到達(dá)峰值，至缺氧后24h蛋白表示出雖有所回落，但仍顯著高于正常對(duì)照。P62蛋白表示出在缺氧后進(jìn)行性降低，至缺氧后24h降至最低。2缺氧后自噬溶酶體的變化自噬體屬于亞細(xì)胞構(gòu)造，普通光鏡下看不到，直接觀察自噬體需在透射電子顯微鏡下。因而，透射電鏡觀察是當(dāng)前確認(rèn)能否發(fā)生自噬的最重要形態(tài)學(xué)指標(biāo)，被以為是檢測(cè)能否發(fā)生自噬的金標(biāo)準(zhǔn)。筆者也利用透射電鏡觀察了缺氧對(duì)腸上皮細(xì)胞自噬溶酶體變化的影響。由于上述自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62及LC3蛋白表示出均在缺氧后6h與正常對(duì)照有顯著差異，因而我們觀察了缺氧后6h腸上皮細(xì)胞自噬溶酶體的變化情況。圖4的結(jié)果表示清楚，與正常對(duì)照相比擬，缺氧后腸上皮細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體數(shù)目明顯增加〔圖中箭頭所示〕，表示清楚缺氧后腸上皮細(xì)胞自噬加強(qiáng)。3缺氧后GFP-LC3B融合蛋白示蹤的變化GFP-LC3B融合蛋白示蹤技術(shù)的原理是利用LC3B在自噬構(gòu)成經(jīng)過(guò)中發(fā)生聚集這一現(xiàn)象，無(wú)自噬時(shí)GFP-LC3B融合蛋白彌散地分布于胞漿內(nèi)；發(fā)生自噬時(shí)GFP-LC3B融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜聚集，在熒光顯微鏡下可觀察到多個(gè)亮堂的綠色熒光斑點(diǎn)。筆者采用GFP-LC3B融合蛋白示蹤方式方法觀察了缺氧后6h腸上皮細(xì)胞自噬的發(fā)生情況，圖5的結(jié)果表示清楚，正常對(duì)照的腸上皮細(xì)胞內(nèi)分布較均勻一致的綠色熒光，而熒光斑點(diǎn)構(gòu)成較少；缺氧后6h的腸上皮細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)構(gòu)成明顯增加，表示清楚缺氧后腸上皮細(xì)胞自噬明顯增加。討論嚴(yán)重?zé)齻缙谧钪饕牟±砩碜兓癁榇罅矿w液滲出，有效循環(huán)血量銳減，使機(jī)體處于休克狀態(tài)，導(dǎo)致全身組織缺血缺氧，故嚴(yán)重?zé)齻缙谌硇該p害的本質(zhì)是組織器官的缺血缺氧性損害。有資料表示清楚[8],腸系膜血管的血管緊張素受體密度比其他部位高，故對(duì)血管加壓素敏感性高，休克時(shí)腸系膜血流量顯著減少，而機(jī)體為了保證心腦等重要臟器的血流灌注，通過(guò)血流重分布方式犧牲腸道等相對(duì)不重要器官的血流以維持心腦等血流灌注，這就使得腸道等的血流灌注量更進(jìn)一步降低，導(dǎo)致腸道黏膜缺血缺氧。既往的研究表示清楚[9],嚴(yán)重?zé)齻缙谌毖毖鯐r(shí)腸黏膜組織構(gòu)造損害、腸道屏障功能受損及通透性增加，引起腸腔內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素移位。但是，迄今為止，嚴(yán)重?zé)齻缙谀c黏膜損害的機(jī)制仍不完全清楚。近年來(lái)，自噬在組織缺血缺氧性損害中的作用已遭到廣泛關(guān)注。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道[10-11],在缺氧時(shí)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表示出增加及P62表示出降低，表示清楚缺氧后細(xì)胞自噬作用加強(qiáng)。在小鼠模擬急進(jìn)高原實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[12],急進(jìn)高原組小鼠腸道機(jī)械屏障受損傷且腸道上皮細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin1表示出升高，但自噬作用的上調(diào)與腸道機(jī)械屏障損傷的關(guān)系當(dāng)前尚不明確。筆者近期的研究也發(fā)現(xiàn)[13],在小鼠嚴(yán)重?zé)齻缙?，重要臟器如心、肝、肺、腎組織的自噬標(biāo)志分子Beclin1及LC3蛋白表示出升高，自噬溶酶體增加，表示清楚嚴(yán)重?zé)齻梢鸾M織細(xì)胞自噬增加。腸道作為應(yīng)激反響的中心器官，缺血缺氧時(shí)腸黏膜上皮細(xì)胞自噬能否也增加呢?當(dāng)前的研究資料尚不能明確回答這一問(wèn)題。為此，本實(shí)驗(yàn)利用體外缺氧模型，研究了缺氧條件下人腸上皮細(xì)胞自噬的動(dòng)態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚，腸上皮細(xì)胞在缺氧0.5h后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的蛋白表示出水平均開(kāi)場(chǎng)增加，且隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)一步增加，到缺氧12h到達(dá)峰值，至24h雖有回落，但仍顯著高于正常水平。與此相反，另一種自噬相關(guān)蛋白P62的蛋白表示出則隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)逐步降低，到缺氧24h時(shí)降至最低。過(guò)去的研究表示清楚[14],自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3及P62均在自噬的發(fā)生與發(fā)展中起著非常重要的作用，被以為是細(xì)胞自噬構(gòu)成的標(biāo)志性分子。Beclin1蛋白與自噬經(jīng)過(guò)中構(gòu)成吞噬小泡的起始密切相關(guān)；LC3定位在自噬體雙層膜的整個(gè)延長(zhǎng)階段，且貫穿整個(gè)自噬經(jīng)過(guò)；P62在自噬經(jīng)過(guò)中作為一種調(diào)節(jié)因子介入自噬，但在自噬晚期被逐步降解。很顯然，本實(shí)驗(yàn)觀察到的缺氧后Beclin1與LC3蛋白表示出增加及P62蛋白表示出降低表示清楚了缺氧狀態(tài)下腸上皮細(xì)胞自噬加強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)的透射電鏡結(jié)果也表示清楚，缺氧后腸上皮細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體數(shù)目增加；進(jìn)一步的GFP-LC3B融合蛋白示蹤結(jié)果更是表示清楚，缺氧后腸上皮細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)構(gòu)成明顯增加，即自噬溶酶體增加，這些均與上述缺氧后腸上皮細(xì)胞Beclin1、LC3及P62這三種自噬相關(guān)蛋白表示出的變化趨勢(shì)相吻合。因而，綜合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，筆者以為缺氧能引起腸上皮細(xì)胞自噬明顯加強(qiáng)。當(dāng)前的研究以為，自噬在機(jī)體的各種生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，適度的自噬可加速細(xì)胞新陳代謝及細(xì)胞器更新，介入缺血缺氧等饑餓狀態(tài)下細(xì)胞適應(yīng)性反響的調(diào)節(jié)，但過(guò)度的自噬則引起自噬性細(xì)胞死亡，導(dǎo)致組織損害[4-14].因而，自噬究竟是起