雜交瘤技術和單克隆抗體技術培訓課件

雜交瘤技術和單克隆抗體技術3、免疫系統(tǒng)含有109以上淋巴細胞遍布全身，保證了它們在任何部位都能迅速反應。淋巴細胞由骨髓中的原始干細胞不斷產(chǎn)生，經(jīng)血液及淋巴系統(tǒng)循環(huán)，暫時停頓并積聚于稱作淋巴器官的特異化的結構中，在哺乳動物中就是淋巴結和肝臟。在免疫反應過程中，免疫原積聚于一個淋巴器官中，這個淋巴器官就變成了免疫反應的焦點。B細胞：分泌抗體，并在細胞表面攜帶同一抗體的修飾型，功能相當于受體。毒性T細胞：攜帶結合抗原的細胞表面受體。輔助T細胞：在控制B細胞和細胞毒性T細胞反應方面起關鍵的調節(jié)作用。2雜交瘤技術和單克隆抗體技術體液介導的適應性免疫反應：體液反應引發(fā)產(chǎn)生可結合外來抗原的循環(huán)抗體，由B淋巴細胞產(chǎn)生，由輔助T淋巴細胞介導是抗體技術的基礎。細胞介導的適應性免疫反應：毒性T淋巴細胞結合于外來或感染的細胞，隨后將這些細胞裂解，輔助T細胞參與該反應。二、免疫系統(tǒng)能特異性地對無數(shù)種分子反應。免疫系統(tǒng)持續(xù)地受無數(shù)抗原刺激。免疫系統(tǒng)的一個主要形式是它能合成大量的抗體及細胞表面受體。各個帶有不同抗原結合位點的抗體和T細胞受體與外來分子的結合提供了免疫反應特異性的基礎。3雜交瘤技術和單克隆抗體技術三、個別淋巴細胞識別個別抗原一個細胞識別一個抗原，因為單一淋巴細胞上的所有抗原受體是相同的。在成熟淋巴細胞表面的所有受體都是糖蛋白，體細胞基因重組、突變及基因轉錄后加工等使受體產(chǎn)生107個以上的結合位點。抗原特異性通過確保只有一個類型的受體在一個細胞內被合成的過程來維持。雖然B細胞表面抗體和T細胞表面受體都具有類似的結構，但它們是由不同的基因家族編碼的，其表達具有細胞型的特異性。B細胞上的表面抗體能結合可溶性抗原，而T細胞受體僅僅識別在其它細胞表面展示的抗原4雜交瘤技術和單克隆抗體技術四、免疫系統(tǒng)能將外來微生物和分子與自身成分區(qū)別開來。五、系統(tǒng)記憶每一次與外來抗原的遭遇免疫反應遇到同一抗原時一次比一次強，具有特異性。免疫記憶可以延續(xù)動物終生。六、免疫反應的許多性質是通過克隆選擇確定的一種抗原活化一種淋巴細胞。當淋巴細胞表面受體結合抗原時，B淋巴細胞就被活化，分泌抗體被刺激而增殖（急劇分裂克?。?。七、一個有效免疫系統(tǒng)的成熟是由廣泛的細胞間信息交換來調節(jié)的。5雜交瘤技術和單克隆抗體技術第二節(jié)、抗體分子抗體是具有共同結構和功能形式的一大類糖蛋白?？贵w分成五類：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD（見表2-1）。一、IgG類抗體有兩個相同的抗原結合位點含有抗原結合位點的兩個區(qū)域被稱作Fab片段，涉及到免疫調節(jié)的蛋白區(qū)稱作Fc片段，在Fab和Fc片段之間的部分稱作鉸鏈區(qū)。重鏈分子量為5.5kDlt；輕鏈分子量為2.5kDlt。二、不同類型抗體的區(qū)別IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重鏈形式不同而有所區(qū)別。它們的重鏈分別稱作γ、μ、α、ε和δ。重鏈的不同使這些蛋白具有不同形式的免疫功能，并且在完成反應成熟的不同階段發(fā)揮作用。這些差異主要是由于Fc片段上的蛋白序列不同所致。輕鏈只有兩種：κ、λ。6雜交瘤技術和單克隆抗體技術三、抗體輕鏈的分子結構比較輕鏈的氨基酸結構發(fā)現(xiàn)，輕鏈有一個恒定區(qū)和一個可變區(qū)。輕鏈由220個氨基酸組成，分為兩個區(qū)，每個區(qū)由大約110個氨基酸組成。-NH2末端那半部分是異源性的，稱為可變區(qū)（V）；羧基末端那部分稱為恒定區(qū)（C）。恒定區(qū)有兩種類型：一種是決定κ輕鏈的，另一種是決定λ輕鏈的。κ輕鏈基因位于第6染色體上，而λ輕鏈的基因則位于第16染色體上。四、抗體重鏈的分子結構重鏈的序列也存在可變區(qū)和恒定區(qū)（圖2-1）。IgG重鏈含有一個可變區(qū)和三個恒定區(qū)，每區(qū)含110個氨基酸，其它重鏈含有附加的恒定區(qū)。IgG重鏈序列也顯示γ鏈有四種亞類，即：IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。鼠重鏈多肽編碼區(qū)在第12染色體上。7雜交瘤技術和單克隆抗體技術8雜交瘤技術和單克隆抗體技術9雜交瘤技術和單克隆抗體技術五、重鏈和輕鏈的可變區(qū)形成抗原結合位點一個重鏈的可變區(qū)和一個輕鏈的可變區(qū)結合形成一個抗原結合位點?？勺儏^(qū)的異質性提供了動物有效進行免疫反應所需的無數(shù)結合位點的基礎。序列異質性并不是由整個可變區(qū)的每一部分決定的，而是集中在與抗原接觸的位點上。多數(shù)可變性決定于每一個鏈的三個短區(qū)，它們形成輕鏈的三個超變區(qū)和重鏈的三個超變區(qū)。這些超變區(qū)形成抗原抗體結合的接觸殘基的主體，同時這些超變區(qū)位于擴展進入抗原反應區(qū)的短環(huán)上。由于它們是實際的抗原結合位點，故被認為是互補決定區(qū)。六、功能性κ、λ輕鏈和重鏈基因的一個明顯特征是在所有細胞中這些基因轉錄后的選擇性剪接是不同的（見圖2）。200個V區(qū)，4個功能性J區(qū)。七、形成λ輕鏈pre-mRNA外顯子也要重排（圖3）。V-J-C-J-C。八、形成功能性重鏈基因需要pre-mRNA外顯子的重排（圖4）。50—100種可變區(qū)，12個D區(qū)，4個J區(qū)。10雜交瘤技術和單克隆抗體技術12雜交瘤技術和單克隆抗體技術13雜交瘤技術和單克隆抗體技術14雜交瘤技術和單克隆抗體技術15雜交瘤技術和單克隆抗體技術九、這些重組及其它機制產(chǎn)生了無數(shù)的抗原結合位點。十、等位基因排斥確保在任一B細胞中只有重新排列的一個輕鏈和一個重鏈被表達。產(chǎn)生不同重鏈和輕鏈的基因重組不總是產(chǎn)生一個功能基因，在B細胞分化過程中，輕鏈重排開始于κ區(qū)內。然后，若二倍體基因中的一個首先重排，產(chǎn)生一個功能性等位基因，另一個拷貝則進行重組。若二個重組都產(chǎn)生非功能性等位基因，那么重組就要λ位點開始，以同樣的機制產(chǎn)生功能性重鏈。一旦重組產(chǎn)生一個功能性抗體，一個未知的機制就制止進一步重組。將抗原性結合位點固定，直到細胞死亡。這個機制叫等位基因排斥。它可以解釋為什么B淋巴細胞分泌的只有一種抗原結合位點的抗體和抗體只有一種類型的輕鏈。十一、其它：重組被用于生產(chǎn)各種類和亞類的抗體。

16雜交瘤技術和單克隆抗體技術淋巴細胞雜交瘤與單克隆抗體技術1960年，法國的Barski等首先發(fā)現(xiàn)，兩種不同類型的細胞在混合培養(yǎng)的過程中會自發(fā)融合形成融合細胞。與此同時，日本的Okada也發(fā)現(xiàn)紫外線滅活的仙臺病毒(Sandaivirus)可以誘發(fā)艾氏腹水瘤細胞相互融合，在此基礎上用滅活的仙臺病毒誘導產(chǎn)生了第一個種間的雜交細胞。

1976年Kohler和Milstein創(chuàng)建了一個方法，他們將分泌一種特異性抗體的B細胞和體外持續(xù)生長的漿細胞瘤融合，產(chǎn)生的雜交細胞克隆表達了抗體生成的正常B細胞和漿細胞瘤細胞的免疫球蛋白基因，同時也具有在體外無限增殖的能力。為此創(chuàng)造了雜交瘤(hybridoma)這個名詞，以描述一個正?？贵w生成細胞和一個漿細胞瘤細胞的融合產(chǎn)物。由于他們的重要科學貢獻，Kohler和Milstein在1984年榮獲了諾貝爾醫(yī)學生理獎。

17雜交瘤技術和單克隆抗體技術18雜交瘤技術和單克隆抗體技術一、免疫原性許多外源分子、病毒或細胞單純注射在實驗動物體內能引起強的抗體反應，而一些物質卻不能，對于這些情況，?？赏ㄟ^修飾抗原或改變宿主而使免疫系統(tǒng)反應增加。好的免疫原分子必須具備以下條件：1、抗原結合于原始B細胞表面抗體分子對于抗體反應是絕對必要的。這個結合決定了產(chǎn)生抗體的特異性。因為表面抗體分子上的抗原決定位點與分泌抗體的結合位點是一致的。2、它必須能促進B細胞與輔助T細胞間的信息交換。這要求在兩個細胞間有物理連接。即有一個位點被II級蛋白及T細胞受體所識別。3、通常它必須可被降解。19雜交瘤技術和單克隆抗體技術二、抗原來源開始一個免疫程序之前，對制備抗原的考慮主要于抗原所需的劑量和純度。這應基于預計產(chǎn)生抗體的用途。如果僅僅需要識別相應抗原的高特異性抗體，那么抗原必須要相當純，或抗原制備物用于制備單克隆抗體。1、純抗原2、從聚丙烯酰胺凝膠中純化抗原。3、半抗原：半抗原若被偶聯(lián)于大的蛋白分子上就能被用于誘發(fā)抗體。半抗原起抗原決定簇作用，與B細胞表面抗體結合，載體提供II級T細胞受體結合位點?？傊?，半抗原應被偶聯(lián)于可溶性載體上，如BSA。4、合成多肽也要連接到載體上。20雜交瘤技術和單克隆抗體技術三、動物免疫1、動物選擇Balb/c小鼠，6~8周齡；兔子生后約12周。動物數(shù)：小鼠4~6只；兔子2~4只。2、佐劑免疫反應的非特異性刺激物叫做佐劑，誘導對可溶性抗原的抗體反應必須使用佐劑。但對顆粒性抗原或全細胞抗原則不是必須的。佐劑包含兩種因素：一是佐劑是儲備性物質以防止抗原迅速代謝；二是佐劑必須是可以非特異性地刺激免疫反應的物質。實驗時一般是將水溶液注入到佐劑中。3、抗原劑量對于兔，若有大量可溶的純抗原可用，一般認為每次免疫于佐劑中有0.5~1.0mg劑量是可取的；對于小鼠來講，劑量則降10倍，為50~100μg。21雜交瘤技術和單克隆抗體技術4、抗原的形式5、注射途徑：需考慮三個問題。1）要注射多大劑量；2）與免疫原同注的是什么緩沖液，還有其它什么成分；3）免疫原釋放入淋巴系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)的速度如何？對于兔，大體積注射常采用皮下多點注射。對于鼠，大體積注射常采用腹腔注射，若需緩慢釋放則采用肌注或皮下注射，若需立即釋放宜采用靜脈注射。對于鼠來說，第二次和第三次免疫應間隔至少3周。對于兔來說，每3~6周注射一次。超免疫化動物血清主要含IgG抗體。其實質部分為特異性抗體。抗原特異的IgG水平可達1mg/ml，這幾乎等于血清中總IgG水平的10%。22雜交瘤技術和單克隆抗體技術DNA合成氨基酸、核苷酸庫dGTP、dTTP次黃嘌呤H

肌苷酸

胸腺嘧啶核苷T脫氧核苷酸次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)胸腺嘧啶核苷激酶（TK）氨基蝶呤A23雜交瘤技術和單克隆抗體技術雜種細胞的篩選：細胞融合帶有一定的隨機性，除不同親本細胞間的融合外，還伴有各親本細胞的自身融合。因此，在緊隨細胞融合之后，必須設法把含有兩親本細胞染色體的雜種細胞分離或篩選出來。最簡便的辦法無疑是應用選擇培養(yǎng)基，使親本細胞死亡，而僅讓雜種細胞存活下來。為此，已先后利用親本細胞的藥物抗性、營養(yǎng)缺陷型和溫度敏感性等遺傳標記，建立了多種選擇系統(tǒng)，并已成功地用于雜種細胞的篩選。

24雜交瘤技術和單克隆抗體技術由抗藥性細胞組成的雜種的篩選：Szybslski等（1962）在研究抗藥性時發(fā)現(xiàn)，抗嘌呤類似物8-氮鳥嘌呤或6-巰基鳥嘌呤突變型細胞缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT），而抗嘧啶類似物5-溴脫氧尿嘧啶突變型細胞缺乏胸腺嘧啶核苷激酶〔TK），它們均可為HAT培養(yǎng)基所殺死。在此基礎上，Littlefield（1964）進一步應用HAT培養(yǎng)基來篩選HGPRT－細胞與TK－細胞的余種細胞，獲得成功。從此，根據(jù)抗藥性這一遺傳標記設計選擇系統(tǒng)即日益增多，而發(fā)展成為迄今使用最為普遍的一種篩選方法。其代表性的選擇系統(tǒng)有下列幾種。25雜交瘤技術和單克隆抗體技術HAT選擇培養(yǎng)基：HAT培養(yǎng)基是指在細胞培養(yǎng)基中加有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）或氮絲氨酸（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的培養(yǎng)基。細胞為合成DNA所需要的嘌呤和嘧啶，可由兩條途徑獲得。一條為主要途徑，即從磷酸核糖焦磷酸（PRPP）和谷氨酰胺合成肌苷酸（IMP），進而轉變?yōu)槊撗貘B苷三磷酸（dGTP），及從脫氧尿苷酸（dUMP）合成脫氧胸苷酸（dTMP