質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳

DNA的瓊脂糖凝膠電泳

1一、目的要求

二、原理

1、類型：

（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳

適合分離1kb以下的片段，最高分辨率可達(dá)1bp，也用于分離寡核苷酸，在引物的純化中也常用此中凝膠進(jìn)行純化，也稱PAGE純化。

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（2）瓊脂糖凝膠電泳

可分離的DNA片段大小因膠濃度的不同而異，膠濃度為0.5～0.6%的凝膠可以分離的DNA片段范圍為20bp～50kb。電泳結(jié)果用熒光染料染色后可直接在紫外下觀察，并且可觀察的DNA條帶濃度為納克級，而且整個過程一般1小時即可完成。由于該方法操作的簡便和快速，在基因工程中較常用。3瓊脂糖：從瓊脂中分離得到，由1，3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4連接的3，6脫水吡喃型阿a-L-半乳糖組成，形成相對分子量為104～105的長鏈。

瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機(jī)線團(tuán)狀分布，當(dāng)溫度降低時鏈間糖分子上的羥基通過氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑。4不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍瓊脂糖/％標(biāo)準(zhǔn)高強(qiáng)度低熔點(diǎn)低粘度低熔點(diǎn)0.30.5700bp～25kb0.8500bp～15kb800bp～10kb800bp～10kb1.0250bp～12kb400bp～8kb400bp～8kb1.2150bp～6kb300bp～7kb300bp~7kb1.580bp~4kb200bp~4kb200bp~4kb2.0100bp~3kb100bp~3kb3.0500bp~1kb500bp~1kb4.0100bp~500bp6.010bp～100bp52、DNA電泳影響因素

主要分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。

（1）DNA分子大小

DNA分子越大在膠中摩擦阻力就越大，泳動也越慢，

遷移速率與線狀DNA分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比。

（2）DNA分子構(gòu)型

相同分子量質(zhì)粒DNA，構(gòu)型不同電泳時受的阻力不同，泳動速率不同。常規(guī)電泳中質(zhì)粒DNA分子的3種構(gòu)型泳動速率：超螺旋最快、線狀次之，開環(huán)最慢。

6（3）膠濃度

（4）電場強(qiáng)度：根據(jù)需要選擇合適電壓。

為了盡快得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所用電場強(qiáng)度約為5V/cm，

但分辨率不高。

精確測定DNA分子大小時，電壓1V/cm。

（5）溴化乙錠簡稱EB，電泳中的染色劑。7具有扁平結(jié)構(gòu)，能嵌入到DNA堿基對間，對線狀分子與開環(huán)分子影響較小而對超螺旋態(tài)的分子影響較大。8（6）電泳緩沖液

常用DNA電泳緩沖液（1000ml)

TAE（50×）

242gTris

57.1ml冰乙酸

100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)

9TBE（5×）

54gTris

27.5硼酸

20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)

TPE（10×）

108gTris

15.5ml磷酸(85%，1.679g/ml)

40ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)

103、DNA電泳上樣緩沖液

主要作用如下：

（1）

螯合Mg2＋，防止電泳過程中DNA被降解（2）

增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。大片段電泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可減少DNA條帶的彎曲和托尾現(xiàn)象。

（3）指示劑監(jiān)測電泳的行進(jìn)過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線狀雙鏈DNA相同。

114、DNA電泳上樣量的控制

分析性電泳中，一般樣品投入量達(dá)50～100ng/帶，即可觀察到清晰結(jié)果。

珍貴DNA樣品則上樣量達(dá)電泳的最低分辨率5～10ng/帶也可。

125、DNA電泳的標(biāo)準(zhǔn)分子量（DNAMarker）目前各廠商開發(fā)了各種類型的標(biāo)準(zhǔn)分子量。13146、DNA染料（1）溴化乙錠簡稱EB，電泳中的染色劑。15（2）熒光染料

GoldViewTM核酸染料

1617三、實(shí)驗(yàn)操作步驟瓊脂糖凝膠的制備（濃度依照質(zhì)粒大小確定）.

凝膠板的制備加樣（加樣體積在10~30ul）電泳結(jié)果觀察1819