Abp1對(duì)Treg發(fā)育及功能的影響機(jī)制,免疫學(xué)論文

Abp1對(duì)Treg發(fā)育及功能的影響機(jī)制,免疫學(xué)論文摘要：目的討論肌動(dòng)蛋白連接蛋白1(actin-bindingprotein1,Abp1)對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞〔Treg〕發(fā)育及功能的影響。方式方法通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)野生型小鼠〔WT組〕和Abp1基因敲除小鼠〔KO組〕的胸腺、脾臟、淺表淋逢迎及腸系膜淋逢迎中T淋巴細(xì)胞及Treg細(xì)胞的比例、數(shù)量以及相關(guān)功能性分子的表示出，并利用體外抑制試驗(yàn)檢測(cè)Abp1缺失對(duì)Treg抑制功能的影響。結(jié)果與WT小鼠相比，Abp1KO小鼠的胸腺、脾臟、淺表淋逢迎及腸系膜淋逢迎中的Treg的比例和細(xì)胞數(shù)目均沒(méi)有明顯的變化，同時(shí)缺失Abp1的Treg細(xì)胞的主要功能性分子ICOS、CTLA4、PD-1和NRP-1的表示出亦沒(méi)有顯著的差異，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺失Abp1的Treg細(xì)胞對(duì)初始T細(xì)胞向活化T細(xì)胞分化的抑制作用較WT相比無(wú)明顯變化。結(jié)論Abp1對(duì)Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能沒(méi)有顯著影響。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：肌動(dòng)蛋白連接蛋白1;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;抑制功能;Abstract：Thisstudywasdesignedtoinvestigatetheeffectofprogranulinactin-bindingprotein1(Abp1)onthedifferentiationandfunctionofregulatoryTcell,andthemoleculemechanism.Wedetectedtheproportion,numberandfunctionalmoleculeexpressionofTlymphocytesandTregcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesofwild-typemice(WTgroup)andAbp1knockoutmice(KOgroup)bycytometryflow,andtheeffectofAbp1deletionontheinhibitoryfunctionofTreginvitrowasmeasuredaswell.ComparedwithWTmice,Abp1KOmicehadnosignificantdifferencesontheproportionandnumberofTregsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes,meanwhile,theexpressionofthemainfunctionalmoleculesICOS,CTLA4,PD-1andNRP-1inTregcellslackingAbp1werenotsignificantlydifferent.Furthermore,Abp1-absentTregcellsshowednosignificantchangesininhibitingTcellsactivationascomparingwithWTTregcells.Inconclusion,Abp1hasnosignificanteffectonthedevelopmentandfunctionofTregcells.Keyword：Actin-bindingprotein1;RegulatoryTcell;Suppressivefunction;肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白1(actin-bindingprotein1,Abp1〕也稱為HIP-55或SH3P7，是一種由436個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為48600的肌動(dòng)蛋白效應(yīng)蛋白。Abp1主要包含4個(gè)構(gòu)造域，包括N端肌動(dòng)蛋白解聚因子同源區(qū)〔ADF-H〕、帶電荷的-螺旋形構(gòu)造域〔chargedhelix〕、富含脯氨酸的構(gòu)造域〔PRD〕和C末端Src同源性3(SH3〕構(gòu)造域[1],Abp1可通過(guò)ADF-H和chargedhelix可直接結(jié)合F-actin，在各種組織中廣泛表示出[2,3,4]。早期的研究發(fā)現(xiàn)Abp1介入酵母細(xì)胞的增殖和生存[5]，在成纖維細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)Abp1可通過(guò)其SH3區(qū)域與GTP酶dynamin直接結(jié)合進(jìn)而介入細(xì)胞的內(nèi)吞[6]。在大腦皮層發(fā)育經(jīng)過(guò)中Abp1可通過(guò)調(diào)控N-鈣黏附素的表示出進(jìn)而影響神經(jīng)元細(xì)胞的遷移、多極形態(tài)和細(xì)胞極性[7]，并且在神經(jīng)元突觸的構(gòu)成和形態(tài)控制經(jīng)過(guò)中也同樣發(fā)揮重要作用[8]。在癌細(xì)胞中加強(qiáng)Abp1的表示出能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、集落構(gòu)成、遷移和侵襲，而抑制Abp1的表示出則可逆轉(zhuǎn)這些作用[9,10]。但另有文獻(xiàn)報(bào)道，Abp1與FHL2(fourandahalfLIMdomainprotein2〕的互相作用可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲[11]。同時(shí)，Abp1在淋巴細(xì)胞中也發(fā)揮重要作用。B細(xì)胞激活后BCR信號(hào)可誘導(dǎo)Abp1的磷酸化并促進(jìn)Abp1和與其結(jié)合的dynamin2向胞膜聚集，使其定位于細(xì)胞膜上的BCR與F-actin、dynamin2與細(xì)胞骨架的互相作用進(jìn)一步促進(jìn)了B細(xì)胞的抗原處理和遞呈[12]。缺失Abp1后不僅引起B(yǎng)CR介導(dǎo)的B細(xì)胞抗原遞呈功能受損，而且因Abp1缺失所致的肌動(dòng)蛋白重塑異常致使與B細(xì)胞早期活化密切相關(guān)的BCR小體聚集及B細(xì)胞收縮亦遭到顯著影響，導(dǎo)致缺失Abp1小鼠的邊緣區(qū)B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞的數(shù)量以及本身免疫抗體的水平顯著增加[13]。在T細(xì)胞中Abp1是TCR信號(hào)傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)分子，通過(guò)將肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞骨架和內(nèi)吞作用[13]聯(lián)絡(luò)起來(lái)共同調(diào)節(jié)T細(xì)胞的激活[14,15]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞〔regulatoryTcell,Treg〕是一群具有免疫抑制功能的CD4+T細(xì)胞亞群，而Abp1對(duì)Treg功能的影響機(jī)制當(dāng)前尚不清楚。Treg是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)維持本身抗原耐受性和預(yù)防本身免疫性疾病的T細(xì)胞亞群。根據(jù)來(lái)源不同，Treg細(xì)胞可分為由胸腺分化的自然性Treg(naturalTreg,nTreg〕和主要存在于腫瘤組織和外周血中的誘導(dǎo)性Treg(inducedTreg,iTreg〕，早期稱為抑制性T細(xì)胞[16]。Treg能夠抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，并且在預(yù)防本身免疫中起關(guān)鍵作用[17]。然而當(dāng)前尚未建立起Abp1敲除小鼠模型來(lái)研究其對(duì)Treg發(fā)育及功能的影響。本研究旨在討論Abp1對(duì)Treg的發(fā)育及功能的影響機(jī)制。因而，使用Abp1敲除小鼠來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析在Abp1缺失的情況下對(duì)Treg的發(fā)育和功能所產(chǎn)生的影響。1、材料與方式方法1.1、實(shí)驗(yàn)小鼠本實(shí)驗(yàn)所用Abp1KO小鼠為Balb/c背景，飼養(yǎng)在IVC環(huán)境中。所有的小鼠實(shí)驗(yàn)均遵循重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)和重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的規(guī)定。1.2、試劑和儀器HBSS、1640培養(yǎng)基均購(gòu)于Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；流式抗體以及染色劑分別購(gòu)于BD、Biolegend、eBioscience公司，分別為FITC-AnnexinV、PE-ICOS(TE.17G9〕、Percp/CY5.5-CD44(IM7〕、Percp-7AAD(BBllifescience〕、APC-CD25(PC61〕、APC/CY7-TCR〔H57-597〕、PE/CY7-CD62L(MEL-14〕、PB-CD4(RM45〕、BV510-CD8a(53-6.7〕、FITC-FOXP3(FJ-16s〕、PE-CTLA4(UC10-4B9〕、PE/CY7-PD-1(RMP1-30〕、PE-CD103(2E7〕、APC-neuropilin(3E12〕、PE-CY7-KI67、PE-CD4(GK1.5〕、APC-IL-4(11B11〕、BV421-IL-17(TC11-18H10.1〕、PE/CY7-IFN〔XMG1.2〕；普通流式固定打孔劑購(gòu)于美國(guó)BD公司；Foxp3固定打孔劑購(gòu)于eBioscience公司；PMA、離子霉素均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；高爾基體阻斷劑購(gòu)于BDBioscience公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液Ficoll購(gòu)于GEHealthcare公司。生物安全柜〔Forma〕、高壓滅菌鍋〔TomyES-315〕、超純水系統(tǒng)〔Millipore〕、流式細(xì)胞儀〔BD〕、臺(tái)式冷凍離心機(jī)〔ThermoScientific〕、室溫臺(tái)式離心機(jī)〔HettichMikro〕、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀〔Countstar〕。1.3、單個(gè)核細(xì)胞的制備用CO2麻醉小鼠后將其斷頸處死，分別取出小鼠脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎，在無(wú)菌條件下研磨，脾臟細(xì)胞懸液用3ml的Ficoll進(jìn)行密度梯度離心，汲取單個(gè)核細(xì)胞層計(jì)數(shù)。1.4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞外表分子提取脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎單個(gè)核細(xì)胞分別取1106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將抗體用不同濃度混于含有2%FBS的PBS緩沖液中。用50?l/孔配制的抗體稀釋液垂懸單個(gè)核細(xì)胞，冰上避光孵育30min后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用200?lPBS緩沖液將細(xì)胞重懸后轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)。使用FlowJoTMV10軟件分析數(shù)據(jù)。1.5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)分子提取脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎單個(gè)核細(xì)胞，分別取2106個(gè)細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用200?l細(xì)胞固定劑固定30min，打孔劑洗滌1次后用打孔劑打孔5min。將抗體用不同稀釋比例混于打孔劑。用50?l/孔配制的抗體稀釋液垂懸單個(gè)核細(xì)胞，冰上避光孵育30min后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用200?lPBS緩沖液將細(xì)胞重懸轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)。使用FlowJoTMV10軟件分析數(shù)據(jù)。1.6、體外檢測(cè)Treg細(xì)胞抑制功能提取WT及Abp1KO小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，在無(wú)菌條件下使用鼠CD4/CD25陽(yáng)性T細(xì)胞分選試劑盒〔Miltenyibiotec,5190702555〕分選出Treg細(xì)胞，使用小鼠初始CD4+T細(xì)胞分選試劑盒〔Miltenyibiotec,5191209633〕分選出初始T細(xì)胞。將使用Celltracer(Technologies,1702579〕標(biāo)記后的初始T細(xì)胞后與不同濃度的Treg細(xì)胞共培養(yǎng)于96孔板中，用1640+10%FBS培養(yǎng)基補(bǔ)足200?l，每孔參加1?lCD3/CD28-Beads(Gibco,11456D〕刺激，在37℃的5%CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)72h。72h后收集細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)初始T細(xì)胞的增殖情況。使用FlowJoTMV10軟件分析數(shù)據(jù)。1.7、T細(xì)胞刺激后檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子配制刺激劑：1640培養(yǎng)基中參加胎牛血清〔100?l/ml〕、離子霉素〔1?mol/L〕、GolgiSTOP(1∶1000〕、PMA(50ng/ml〕。提取脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎單個(gè)核細(xì)胞，分別取2106個(gè)細(xì)胞于24孔板中，每孔參加1ml配制好的刺激劑垂懸后置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h。5h后收集細(xì)胞，將PB-CD4、BV510-CD8a、APC/CY7-TCR、Percp/CY5.5-CD444種抗體以不同稀釋比例混于2%FBS的PBS緩沖液中，然后取50?l/孔的抗體稀釋液重懸細(xì)胞進(jìn)行染色。冰上避光孵育30min后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次。然后，用200?l細(xì)胞固定劑固定30min，打孔劑洗滌1次后用打孔劑打孔5min。將APC-IL-4、PE/CY7-IFN-、BV421-IL-173種抗體用不同稀釋比例混于打孔劑中，并取50?l/孔配制的抗體稀釋液垂懸單個(gè)核細(xì)胞，冰上避光孵育30min后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用200?lPBS緩沖液將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)。使用FlowJoTMV10軟件分析數(shù)據(jù)。1.8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用GraphPadPrism5統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間差異不同采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P0.05以為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果2.1、Abp1敲除后對(duì)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響為了研究Abp1敲除后對(duì)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響，我們使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)來(lái)自胸腺、脾臟、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)Abp1KO鼠與野生型小鼠〔WT〕相比，CD4+和CD8+T細(xì)胞在脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎中細(xì)胞比例和數(shù)量差異均不明顯〔圖1〕，這與文獻(xiàn)報(bào)道的Abp1缺失后對(duì)胸腺和脾臟中T細(xì)胞的影響結(jié)果一致[15]。由此我們能夠揣測(cè)，Abp1敲除后對(duì)T淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+的細(xì)胞比例和數(shù)量沒(méi)有顯著影響。2.2、Abp1敲除后對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞活化的影響為了研究Abp1敲除后對(duì)CD4+T細(xì)胞中細(xì)胞活化的影響，我們使用多種抗體對(duì)來(lái)自脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行染色來(lái)區(qū)分CD4+T細(xì)胞的不同細(xì)胞亞群，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)Abp1KO鼠與WT鼠相比，初始CD4+T細(xì)胞〔CD44-CD62L+〕與活化的CD4+T細(xì)胞〔CD44+CD62L-〕的比例和數(shù)量在脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎中均沒(méi)有明顯的差異〔圖2〕。由此我們以為，Abp1敲除后對(duì)T淋巴細(xì)胞中CD4+細(xì)胞的活化影響不大。2.3、Abp1敲除后對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞活化的影響為了進(jìn)一步研究Abp1敲除后對(duì)CD8+T細(xì)胞中細(xì)胞活化的影響，我們使用多種抗體對(duì)來(lái)自脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行染色來(lái)區(qū)分CD8+T細(xì)胞的不同細(xì)胞亞群，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)Abp1KO鼠與WT鼠相比，幼稚的CD8+T細(xì)胞〔CD44-CD62L+〕與活化的CD8+T細(xì)胞〔CD44+CD62L-〕在脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎中均無(wú)明顯的差異〔圖3〕。因而能夠揣測(cè)，Abp1敲除后對(duì)T淋巴細(xì)胞中CD8+細(xì)胞的活化影響同樣較小。2.4、Abp1敲除后對(duì)Treg的影響為了研究Abp1敲除后對(duì)Treg的影響，我們使用多種抗體對(duì)來(lái)自脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行染色，并用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢查Treg的變化。分別使用CD4+CD25+和CD4+FOXP3+抗體來(lái)標(biāo)記Treg。我們發(fā)如今脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎中，無(wú)論是使用CD4+CD25+或使用CD4+FOXP3+標(biāo)記的Abp1KO小鼠的Treg比例及細(xì)胞數(shù)與WT鼠相比變化均不大〔圖4、圖5〕。由此能夠揣測(cè)出Abp1的缺失對(duì)小鼠T細(xì)胞外周穩(wěn)態(tài)影響不大。圖1小鼠缺失Abp1對(duì)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量的的影響Fig1TheeffectofAbp1deletiononthenumberofCD4+TcellsandCD8+Tcellsinmicea)FlowcytometryanalysisofCD4+andCD8+Tcellsinthymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesfromwildtypeandAbp1KOmice;b)thepercentageofCD4+cellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);c)thenumberofCD4+cellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);d)theproportionofCD8+cellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);e)thenumberofCD8+cellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4).1Abp1CD4+TCD8+T2.5、Abp1缺失對(duì)Treg功能的影響為了進(jìn)一步確認(rèn)Abp1缺失對(duì)小鼠Treg功能分子的影響，我們使用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)了Treg細(xì)胞中誘導(dǎo)共刺激分子〔induciblecostimulatory,ICOS〕、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原〔cytotoxicTlymphocyteassociatedantigen4,CTLA4〕、程序性死亡分子1(programmeddeath-1,PD-1〕和神經(jīng)纖維毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1〕的表示出。華而不實(shí)，ICOS能夠穩(wěn)定表示出在CD4+CD25+Treg細(xì)胞外表促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，CTLA4是表示出于活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞的外表分子，能夠下調(diào)或終止T細(xì)胞活化，PD-1表示出于活化的T細(xì)胞并抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，NRP-1具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),ICOS、CTLA4、PD-1、NRP-1這4種功能分子在Abp1KO小鼠的脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎中的表示出均沒(méi)有差異〔圖6a～6d〕。為了進(jìn)一步了解Abp1的缺失對(duì)Treg的抑制功能能否產(chǎn)生影響，我們將分選出的WT小鼠的初始T細(xì)胞同Abp1缺陷小鼠的Treg或野生型小鼠的Treg共培養(yǎng),并參加CD3/CD28刺激初始T細(xì)胞增殖,共培養(yǎng)3d后檢測(cè)初始T細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示W(wǎng)T小鼠組和KO小鼠組的初始T細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯差異〔圖6e〕。這些結(jié)果表示清楚Abp1對(duì)Treg的功能沒(méi)有明顯的影響。圖2小鼠缺失Abp1對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的活化的影響Fig2TheeffectofAbp1deletionontheactivationofCD4+Tlymphocyteinmicea)FlowcytometryanalysisofnaiveCD4+TcellsandactivatedCD4+Tcellsinthymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesfromwildtypeandAbp1KOmice;b)theproportionofnaiveCD4+Tcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);c)thenumberofnaiveCD4+Tcellsinthymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);d)theproportionofactivatedCD4+Tcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);e)thenumberofactivatedCD4+Tcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4).2.6、缺失Abp1的Treg對(duì)活化的CD4+T以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子能力的影響為了進(jìn)一步了解缺失Abp1的Treg的對(duì)活化的CD4+T以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的能力的影響。我們使用PMA和離子霉素對(duì)Abp1KO小鼠和WT小鼠的脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行刺激，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)刺激后的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。我們分別檢測(cè)了CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的-干擾素〔IFN-〕、白介素4(IL-4〕和白介素17(IL-7〕以及CD8+T細(xì)胞中的IFN-。IFN-介入介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，促進(jìn)IgG的生產(chǎn)；IL-4促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的分化，主要介導(dǎo)體液免疫；IL-17介入固有免疫和炎癥的發(fā)生。結(jié)果顯示，KO小鼠的脾臟、胸腺、淺表淋逢迎和腸系膜淋逢迎CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-、IL-4和IL-17以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-與WT鼠相比均沒(méi)有差異?！矆D7〕由此可知，缺失Abp1的Treg對(duì)活化的CD4+T以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力沒(méi)有顯著影響。圖3小鼠缺失Abp1對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞的活化的影響Fig3TheeffectofAbp1deletionontheactivationofCD8+TlymphocyteinAbp1KOmicea)FlowcytometryanalysisofnaiveCD8+TandactivatedCD8+Tcellsinthymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesfromWTandAbp1KOmice;b)theproportionofnaiveCD8+Tcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);c)thenumberofnaiveCD8+Tcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);d)theproportionofactivatedCD8+Tcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);e)thenumberofactivatedCD8+Tcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4).3、討論Abp1是一種能夠直接結(jié)合F-actin的肌動(dòng)蛋白效應(yīng)蛋白，廣泛分布于各類細(xì)胞中。由于與肌動(dòng)蛋白密切相關(guān)，Abp1不僅介入調(diào)控細(xì)胞的內(nèi)吞作用[6]，同時(shí)介入調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的伸展和遷移。有研究發(fā)現(xiàn)Abp1的缺失不僅影響小鼠白細(xì)胞的黏附，同時(shí)抑制白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)散，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在b2整合素的刺激下Abp1主要聚集在極化的中性粒細(xì)胞前緣，同時(shí)增加了與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的遷移[18]。同時(shí)，Abp1對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遷移均有調(diào)控作用[7,11]。固然有報(bào)道Abp1的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量下降和較高的死亡率[15]，但是我們的Abp1小鼠模型在飼養(yǎng)經(jīng)過(guò)中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。圖4Abp1的缺失對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的影響Fig4TheeffectofAbp1deletiononCD4+CD25+Tregcellsa)CD25expressioninthymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesCD4+TcellsfromWTandAbp1KOmice;b)theproportionofCD4+CD25+Tregsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);c)thenumberofCD4+CD25+Tregcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4).圖5Abp1的缺失對(duì)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞的影響Fig5TheeffectofAbp1deletiononCD4+Foxp3+Tregcellsa)Foxp3expressioninthymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesCD4+TcellsofWTandAbp1KOmice;b)theproportionofCD4+Foxp3+Tregsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);c)thenumberofCD4+Foxp3+Tregcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4).圖6Abp1缺失對(duì)Treg功能的影響Fig6TheeffectofAbp1deletiononthefunctionofTrega)wildtypeandAbp1KOmice(n=4);b)themeanfluorescenceintensityofCTLA4inCD4+Foxp3+Tregcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);c)themeanfluorescenceintensityofPD-1inCD4+Foxp3+Tregcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);d)themeanfluorescenceintensityofNRP-1inCD4+Foxp3+Tregcellsinthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodes(n=4);e)naiveTandTregcellsinspleenfromWTandAbp1KOmiceweresortedseparately,andtheproliferationofnaiveTcellswasdetectedbyflowcytometryafterco-cultivationinacertainproportionunderCD3+CD28stimulationfor3days.在T細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Abp1可通過(guò)抑制TCR信號(hào)對(duì)NFAT的激活以及下調(diào)TCR的表示出對(duì)TCR信號(hào)進(jìn)行負(fù)向調(diào)控[14]。同時(shí)，T細(xì)胞的增殖亦遭到Abp1的影響[15]。在活化的T細(xì)胞中，Abp1聚集于T細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞接觸的免疫突觸中[14]，亦有研究報(bào)道Abp1與F-actin在空間上的分離可抑制T細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和活性，進(jìn)而降低了T細(xì)胞浸潤(rùn)以實(shí)現(xiàn)異源嵌合分子的免疫抑制活性[19]。這些研究講明Abp1對(duì)于T細(xì)胞的遷移有顯著的影響。Treg細(xì)胞是一群主要在胸腺發(fā)育具有免疫抑制作用的T細(xì)胞亞群，其在胸腺發(fā)育成熟后遷移到外周各淋巴器官發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，因而，我們猜想Abp1有可能調(diào)控Treg從胸腺至外周的遷移。然而通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)胸腺、脾臟、皮下淋逢迎以及腸系膜淋逢迎的Treg進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，Abp1缺失小鼠的Treg細(xì)胞在胸腺及外周淋巴器官內(nèi)的Treg比例和數(shù)量與野生型小鼠相比沒(méi)有明顯差異，講明Abp1的缺失對(duì)于Treg的外周遷移并沒(méi)有明顯的影響，提示Abp1固然是結(jié)合F-actin的效應(yīng)分子，與肌動(dòng)蛋白重組有密切關(guān)系，然而肌動(dòng)蛋白重組對(duì)于Treg的遷移可能主要通過(guò)其他分子進(jìn)行調(diào)控，Abp1通過(guò)肌動(dòng)蛋白重組對(duì)Treg外周遷移的影響可能被其他肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)相關(guān)分子的調(diào)節(jié)所代償。已有報(bào)道，在生長(zhǎng)因子的刺激下，Abp1主要聚集在F-actin富集的遷移細(xì)胞的前緣，并且主要定位于Arp2/3復(fù)合物處[3]，而Abp1又能夠與WIP通過(guò)其SH3區(qū)域直接結(jié)合[1]，在淋巴細(xì)胞中，WIP和另一重要肌動(dòng)蛋白調(diào)控分子WASP亦可通過(guò)Arp2/3調(diào)控肌動(dòng)蛋白重組，并且已報(bào)道WASP對(duì)于Treg的遷移和歸巢具有顯著影響[20]，因而我們猜想，Abp1對(duì)于Treg的影響有可能遭到WIP和WASP的補(bǔ)償。圖7缺失Abp1的小鼠Treg對(duì)活化的CD4+T以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的影響Fig7TheeffectofTregfromAbp1KOmiceontheabilityofactiveCD4+TandCD8+Tcellstoproducecytokinesa)IFN-,IL-4andIL-17productioninthymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesCD4+TcellsfromWTandAbp1KOmice.IFN-inthymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesCD8+Tcells;b)theproportionofIFN-inthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesCD4+Tcells(n=4);c)theproportionofIL-4inthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesCD4+Tcells(n=4);d)theproportionofIL-17inthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesCD4+Tcells(n=4);e)theproportionofIFN-inthethymus,spleen,peripherallymphnodesandmesentericlymphnodesCD8+Tcells(n=4).7Abp1TregCD4+TCD8+T另外，IL-2是調(diào)控Treg的分化和功能重要的細(xì)胞因子，IL-2能夠促進(jìn)Treg的發(fā)育、生存以及對(duì)T細(xì)胞的抑制功能[21]。有研究報(bào)道Abp1缺失的小鼠T細(xì)胞分泌的IL-2含量明顯減少[15]，因而我們使用體外抑制試驗(yàn)檢測(cè)缺失Abp1的Treg的抑制功能能否遭到影響，結(jié)果同樣顯示Treg的功能在缺失Abp1的情況下沒(méi)有顯著的變化，這與我們檢測(cè)到胸腺及各外周淋巴器官中幼稚CD4與活化CD4的比例變化以及Treg外表功能分子的表示出未有明顯改變相一致。講明Abp1導(dǎo)致的IL2改變并不能影響Treg的抑制功能?？傊?，固然Abp1是調(diào)控肌動(dòng)蛋白重要的效應(yīng)分子，并且可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的遷移以及淋巴細(xì)胞的信號(hào)，然而Abp1對(duì)于Treg的遷移及功能的影響是有限的。以下為參考文獻(xiàn)[1]CortesioCL,PerrinBJ,BenninDA,eta1.Actin-bindingprotein-1interactswithWASp-interactingproteintoregulategrowthfactor-induceddorsalruffleformation[J].MolBiolCell,2018,21(1):186-197.[2]LarboletteO,WollscheidB,SchweikertJ,eta1.SH3P7isacytoskeletonadapterproteinandiscoupledtosignaltransductionfromlymphocyteantigenreceptors[J].MolCellBiol,1999,19(2):1539-1546.[3]KesselsMM,EngqvistGoldsteinAE,DrubinDG.Associationofmouseactin-bindingprotein1(mAbp1/SH3P7),anSrckinasetarget,withdynamicregionsofthecorticalactincytoskeletoninresponsetoRac1activation[J].MolBiolCell,2000,11(1):393-412.[4]EnsenatD,YaoZ,WangXS,eta1.Anovelsrchomology3domain-containingadaptorprotein,HIP-55,thatinteractswithhematopoieticprogenitorkinase1[J].JBiolChem,1999,274(48):33945-3350.[5]LilaT,DrubinDG.EvidenceforphysicalandfunctionalinteractionsamongtwoSaccharomycescerevisiaeSH3domainproteins,anadenylylcyclase-associatedproteinandtheactincytoskeleton[J].MolBiolCell,1997,8(2):367-385.[6]KesselsMM,EngqvistGoldsteinAE,DrubinDG,eta1.MammalianAbp1,asignal-responsiveF-actin-bindingprotein,linkstheactincytoskeletontoendocytosisviatheGTPasedynamin[J].JCellBiol,2001,153(2):351-366.[7]InoueS,HayashiK,FujitaK,eta1.Drebrin-like(Dbnl)controlsneuronalmigrationviaregulatingN-Cadherinexpressioninthedevelopingcerebralcortex[J].JNeurosci,2022,39(4):678-691.[8]HaeckelA,AhujaR,GundelfingerED,eta1.TheactinbindingproteinAbp1controlsdendriticspinemorphologyandisimportantforspineheadandsynapseformation[J].JNeurosci,2008,28(40):10031-10044.[9]LiZ,ParkHR,ShiZ,eta1.Pro-oncogenicfunctionofHIP-55/Drebrin-like(DBNL)throughSer269/Thr291-phospho-sensormotifs[J].Oncotarget,2020,5(10):3197-3209.[10]YangC,LiZ,ShiZ,eta1.RegulationofcellsurvivalbytheHIP-55signalingnetwork[J].MolBiosyst,2020,10(6):1393-1399.[11]BoatengLR,BenninD,DeOliveiraS,eta1.Mammalianactin-bindingprotein-1/Hip-55interactswithFHL2andnegativelyregulatescellinvasion[J].JBi