單克隆抗體藥耐藥問題與應對策略研究,藥理學論文

單克隆抗體藥耐藥問題與應對策略研究,藥理學論文[摘要]單克隆抗體藥物的問世，使疾病治療的方式發(fā)生了革命性的變化。過去的20年，單克隆抗體藥物在癌癥、本身免疫等疾病的治療領域發(fā)揮了重要的作用。單克隆抗體藥物低毒和高特異性優(yōu)勢是其成功的關鍵。單克隆抗體藥物的這兩個優(yōu)勢使其快速替代傳統(tǒng)的化學療法，但其治療效果也同樣遭到耐藥性的困擾。耐藥性是導致單克隆抗體藥物治療效果被抑制的原因之一，單克隆抗體藥物靶向結(jié)合腫瘤細胞后又被去除的情況，稱為抗體的調(diào)制。靶細胞通過順式或反式方式實現(xiàn)調(diào)制，并構(gòu)成二次吞噬，導致細胞聚集沉淀。本文將對每個經(jīng)過的證據(jù)以及應對策略進行討論。[本文關鍵詞語]單克隆抗體藥物；Fc受體；內(nèi)化作用；削除作用；免疫療法。0引言1975年，Kohler和Milstein對單克隆抗體的制備進行了描繪敘述，為抗體大規(guī)模應用于疾病治療奠定了基礎[1].Kohler和Milstein也因而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學獎，他們的技術(shù)導致了最早一代單克隆抗體藥物的誕生。此后，單克隆抗體治療充滿了挑戰(zhàn)，如早年使用鼠原抗體帶來嚴重的免疫原性問題，隨著嵌合抗體、人源化抗體技術(shù)及噬菌體挑選技術(shù)，小鼠表示出人源抗體技術(shù)以及臨床前及臨床試驗監(jiān)管力度的加大，免疫原性問題等有關單克隆抗體藥物安全性的情況得到了明顯改善。一些單克隆抗體藥物在臨床上表現(xiàn)出潛在的治療效果。抗CD20單克隆抗體藥物利妥昔單抗能夠明顯提高藥物的響應率和患者的總生存期，其批準上市，標志著B細胞惡性腫瘤治療現(xiàn)代的開場。單克隆抗體藥物不僅用于B細胞功能障礙相關疾病的治療，近期，其治療范圍擴大到本身免疫性疾病領域，標志著單克隆抗體藥物治療已經(jīng)進入了后利妥昔單抗時代.抗腫瘤壞死因子〔TNF,Anti-tumournecrosisfactor〕單克隆抗體藥物英夫利昔單抗〔Infliximab〕對本身免疫性疾病的治療產(chǎn)生了重要的影響。1998年，英夫利昔單抗被批準用于克羅恩病〔Crohnsdisease〕的治療，如今被批準的適應證擴大到了強直性脊柱炎、銀屑病關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎及潰瘍性結(jié)腸炎等。然而，這兩個成功的單克隆抗體藥物面臨著同樣的挑戰(zhàn)，即單克隆抗體藥物的耐藥性問題[2].1單克隆抗體藥物的藥效機制單克隆抗體藥物的藥效機制同小分子藥物完全不同。例如，單克隆抗體藥物結(jié)合特異靶點分子作用于天然配體〔如：Infiximab,單克隆抗體藥物的靶點是TNF-〕,單克隆抗體藥物還用于信號傳導的調(diào)節(jié)〔Herceptin阻止Her-2neu的二聚化〕[3],或用于免疫系統(tǒng)的效應調(diào)節(jié)，如啟動血清中的補體效應，或通過抗體Fc同NK細胞和巨噬細胞上Fc受體結(jié)合而啟動的ADCC效應〔抗體依靠細胞介導的細胞毒性作用〕.實際上，大多數(shù)治療性單克隆抗體是通過Fc受體，十分是Fc受體產(chǎn)生細胞效應用于疾病治療。Fc受體屬于進化相關的受體蛋白家族，一般按照其與IgG結(jié)合性和下游信號效應進行分類。人類和小鼠具有高親和力Fc受體，能夠同IgG單體結(jié)合，其余種屬的Fc受體屬于中度親和力受體，只能同水溶性IgG多聚體或細胞結(jié)合免疫復合物結(jié)合。FC受體的主要功能是通過FcR區(qū)域的鏈結(jié)合產(chǎn)生激活信號，鏈包含了免疫受體酪氨酸活化組件。然而，小鼠和人都具有單一的抑制性FcRIIB〔CD32B〕,是基于酪氨酸的免疫抑制性受體，能夠降低FcR或SHIP招募的其他刺激受體的激活作用[4].研究者以CD20單克隆抗體藥物作為研究對象，尋找FcR在單克隆抗體藥物發(fā)揮耐藥的機制，并需求解除這種耐藥現(xiàn)象的策略。以CD20單克隆抗體藥物的體外功能將其劃分為Ⅰ型〔利妥昔單抗樣〕和Ⅱ型〔托西莫單抗樣〕.Ⅰ型CD20單克隆抗體藥物的Fc片度的富集加強了C1q的招募作用，顯示其激活組分的能力，將CD20重新分布到細胞膜微區(qū)域的脂筏上。Ⅱ型CD20單克隆抗體藥物不具備這些作用，而是激發(fā)同質(zhì)粘附和溶酶體介導的非凋亡細胞死亡[5].除此之外，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體比Ⅱ型抗體更易從細胞外表內(nèi)化到細胞內(nèi)。我們對這兩類單克隆抗體的研究進展進行綜述，揭示單克隆抗體藥物的耐藥機制及應對策略。2單克隆抗體藥物的細胞內(nèi)化CD20在惡性腫瘤細胞中高度表示出，是抗體治療中理想的靶標分子。但是產(chǎn)生抗體的漿細胞和干細胞缺失CD20,并缺少抗原的下調(diào)現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因小鼠表示出人CD20的B細胞研究顯示，Ⅱ型抗CD20單克隆抗體較Ⅰ型單克隆抗體更易去除B細胞。使用Ⅱ型抗體治療需要的時間較長，程度較大，Ⅰ型和Ⅱ型單克隆抗體藥物通過不同的通路獨立介導補體激活和細胞程序性死亡。體內(nèi)實驗顯示，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體被內(nèi)化并在轉(zhuǎn)基因小鼠的B細胞中降解，這和抗CD20單克隆抗體處理體外原代和治療人類惡性B細胞的細胞實驗結(jié)果一樣，這一點和Ⅱ型抗CD20單克隆抗體的表現(xiàn)不同。內(nèi)化會縮短單克隆抗體藥物半衰期，并影響調(diào)理細胞的吞噬功能，這將直接導致單克隆抗體藥物治療效果降低和用藥費用增加。2.1單克隆抗體藥物的細胞內(nèi)化Lim等[6]對抗CD20單克?、裥涂贵w的細胞內(nèi)化機制進行了研究。實驗中利妥昔單抗F〔ab〕2片段的結(jié)合反響下降，表示清楚可能有Fc受體介入了這個經(jīng)過。當B細胞只表示出抑制性FcRIIB或使用特異性抗體封閉FcRIIB時，抗體的細胞內(nèi)化作用被抑制。另外，體外實驗表示清楚，細胞表示出的FcRIIB同細胞結(jié)合的利妥昔單克隆抗體藥物呈負相關。研究還表示清楚，mAb的Fc片段和FcR的Fc結(jié)合區(qū)域互相作用加強了單克隆抗體藥物的內(nèi)化作用。Ⅰ型抗CD20單克隆抗體和FcRIIB通過下述兩種方式發(fā)揮作用，與相鄰的細胞發(fā)生反式作用，在單細胞外表發(fā)生順式作用。Lim等[6]的重復實驗結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)細胞間發(fā)生的直接互相作用。結(jié)果表示清楚，為了實現(xiàn)抗體的細胞內(nèi)化，需要Ⅰ型抗CD20單克隆抗體和FcRIIB的順式互相作用，這一經(jīng)過被稱為抗體的雙極橋接。有研究表示清楚，使用利妥昔單克隆抗體藥物治療時，腫瘤細胞高水平表示出FcRIIB的患者較低水平表示出的患者的生存期明顯降低[6].另外，利妥昔單克隆抗體藥物治療濾泡性淋巴瘤患者的研究也顯示，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體的細胞內(nèi)化作用影響了治療效果。抗CD20的Ⅰ型抗CD20單克隆抗體和FcRIIB的順式互相作用與FcRIIB和抗體包被抗原免疫復合物間的互相作用方式類似。當抗原抗體復合物與B細胞受體結(jié)合時，抗體的Fc片段和FcRIIB通過順式發(fā)生互相作用，在細胞膜處將抑制型FcR和B細胞受體結(jié)合；激活抑制型B細胞受體，對于抗原特異性B細胞反響是一個負反應。抑制型BCR的活化，IgG免疫復合物引導FcRIIB的B2亞型的快速內(nèi)化，這個經(jīng)過是不依靠細胞區(qū)域完好ITIM序列的。上述研究表示清楚，抗CD20Ⅰ型單克隆抗體和FcRIIB的互相作用引導復合物向細胞膜接近，與磷酸化的FcRIIBITIM構(gòu)成三聚體復合物，加強了復合物的細胞內(nèi)化作用，經(jīng)過與免疫復合物的內(nèi)化類似。然而，Vaughan等[7]的研究顯示，F(xiàn)cRIIB的突變體缺乏完好的胞質(zhì)構(gòu)造，同樣能夠完成對抗CD20的Ⅰ型單克隆抗體內(nèi)化的加強作用，與野生型的FcRIIB效果一樣。這表示清楚FcRIIB和免疫復合物之間的互相作用、抗體連接CD20的內(nèi)化并不是通過FcR依靠的信號轉(zhuǎn)導，F(xiàn)cRIIB的作用可能僅限于物理構(gòu)造的互相作用。2.2脂筏的作用Ⅰ型抗CD20單克隆抗體不僅與FcRIIB相結(jié)合。事實上，B細胞靶標的抗原抗體復合物通過順式反響FcRIIB結(jié)合到細胞外表，還包括單克隆抗體與MHCⅡ、CD40和CD38的結(jié)合。然而，這些內(nèi)化作用一般不會對抗體連接受體的內(nèi)化產(chǎn)生影響，只要抗CD38和CD19的抗體會產(chǎn)生較為明顯的影響。為了進一步說明抗原調(diào)變機制，研究者對脂筏構(gòu)造FcRIIB在單克隆抗體藥物鏈接CD20內(nèi)化經(jīng)過中的加強作用進行研究。Ⅰ型抗CD20單克隆抗體介導了CD20向脂筏的重分布，而Ⅱ型抗CD20單克隆抗體與其他單克隆抗體直接和B細胞外表受體結(jié)合。除此之外，在與BCR互相作用時，F(xiàn)cRIIB也向脂筏重分布。向脂筏的重分布及后續(xù)的內(nèi)吞經(jīng)過存在于很多受體配體復合物及病毒的內(nèi)化經(jīng)過中。研究者揣測，F(xiàn)cRIIB和利妥昔單克隆抗體藥物在脂筏上的互相作用對于加強內(nèi)化是必需的，這就解釋了盡管FcRIIB被磷酸化，Ⅱ型抗CD20單克隆抗體內(nèi)化和抗體直接與其他受體的內(nèi)化比例基本相當[8].在脂筏的研究中，研究者使用具有CD20突變型的人骨髓瘤細胞作為研究對象，由于CD20的突變型不能重分布到脂筏上。在FcRIIB缺失時，表示出突變型CD20的細胞表現(xiàn)出比野生型細胞較慢的抗體內(nèi)化作用，這講明CD20向脂筏的重分布對于抗體內(nèi)化有重要影響。當細胞共轉(zhuǎn)染FcRIIB時，抗體內(nèi)化開場加速，這講明轉(zhuǎn)染的FcRIIB代替了突變的FcRIIB引領突變的CD20向脂筏的重分布。為了驗證這種情況，研究者利用FcRIIB得到不能向脂筏重分布的突變體FcRIIA.突變體FcRIIA能夠加強CD20的內(nèi)化，這講明內(nèi)化經(jīng)過中CD20向脂筏的作用中FcRIIB可能不是必須的。CD20內(nèi)化經(jīng)過中，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體和FcRIIB互相作用的詳細機制尚不清楚。內(nèi)吞作用的前提是膜的曲率，這將構(gòu)成內(nèi)吞小泡。Stachowiak等[9]對人工脂膜的研究顯示，高度擁擠的蛋白能夠誘發(fā)膜構(gòu)成褶皺及脂質(zhì)小管，褶皺的增加同蛋白質(zhì)濃度相關。研究者發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體、FcRIIB和CD20在細胞膜上聚集，而Ⅱ型抗體沒有這種重分布的情況發(fā)生。Stachowiak等人工脂膜的研究顯示，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體誘發(fā)CD20和FcRIIB的重分布，這可能觸發(fā)膜褶皺和隨后的內(nèi)吞。這個經(jīng)過中FcRIIB可能與抗體受體復合物發(fā)生強烈的互相作用，促進細胞膜上高密度的蛋白招募反響，進而引起細胞膜的形變。但這并不能完全解釋在Ⅱ型抗CD20單克隆抗體的順式反響中FcRIIB和CD20也發(fā)生互相作用，但是并沒有觸發(fā)CD20的內(nèi)化。然而，Ⅱ型單克隆抗體GA101〔Obinutu-zumab〕的晶體構(gòu)造的研究表示清楚，Ⅱ型抗體結(jié)合CD20的定位同Ⅰ型抗體不同。這種差異可能是順式反響中Ⅰ型和Ⅱ型單克隆抗體同F(xiàn)cR的互相作用的親和力和密度不同。固然Ⅱ型單克隆抗體和磷酸化的FcRIIB互相作用，但是活化的水平不高。即便對Ⅱ型抗CD20單克隆抗體的空間構(gòu)造進行調(diào)整，也不能啟動足夠的招募反響使膜引發(fā)皺褶并發(fā)生內(nèi)吞反響?；谏鲜龅难芯浚覀円詾?，Ⅱ型單克隆抗體不能誘導CD20向脂筏的重分布，Ⅱ型單克隆抗體直接定向特異性的靶點蛋白，并保存在細胞外表而不被內(nèi)化。3單克隆抗體藥物的削除機制另一種抗體耐藥性的解釋是抗體的削除機制或是Trogocytosis作用〔細胞吞噬的一種機制〕.Taylor等[10]基于使用利妥昔單克隆抗體藥物的慢性淋巴細胞白血病〔Chroniclymphocyticleukemia,CLL〕患者進行研究，提出抗體削除機制可能是患者對單克隆抗體藥物產(chǎn)生耐藥性的原因。這種機制有助于解釋在使用利妥昔單克隆抗體藥物治療初期循環(huán)CLL細胞數(shù)量降低，但是隨著藥物的持續(xù)使用，CD20陰性的CLL細胞數(shù)量逐步增加。單核細胞或巨噬細胞的FcR依靠免疫反響中，抗體和靶點復合物從靶細胞外表削除或拔掉。最初人們以為FcRI介導了這一經(jīng)過，之后研究發(fā)現(xiàn)，抗原抗體復合物與效應細胞FcR的結(jié)合能夠完成削除機制。抑制型FcRIIB的小鼠實驗也證明了削除機制的存在。而使用腹腔腫瘤小鼠得到的關于FcR的數(shù)據(jù)證實補體發(fā)揮