環(huán)狀RNA的研究課件

揭開環(huán)狀RNA的神秘面紗環(huán)狀RNA類病毒？擬病毒？偶然錯配出現(xiàn)的？有什么功能？怎么形成的？現(xiàn)有的研究結(jié)果怎樣？存在于動物體內(nèi)or體外也可以？未來研究的可深入方向？類病毒是目前已知最小的可傳染的致病因子，比普通病毒簡單。類病毒是無蛋白質(zhì)外殼保護(hù)的游離的共價閉合環(huán)狀單鏈RNA分子，侵入宿主細(xì)胞后自我復(fù)制，并使宿主致病或死亡。類病毒的分子量在0.5～1.2×105，是已知的最小RNA衛(wèi)星壞死病毒大小的1/4。1971年首次報道的馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒(PSTV)只有359個核苷酸，最小的草矮生類病毒(HSV)僅含290～300個核苷酸，較大的柑桔裂皮病類病毒(CEV)亦只含371個核苷酸。目前關(guān)于類病毒的感染和復(fù)制機(jī)理尚不清楚。擬病毒也稱為類類病毒，它是一種環(huán)狀單鏈RNA。它的侵染對象是植物病毒。被侵染的植物病毒被稱為輔助病毒，擬病毒必須通過輔助病毒才能復(fù)制。單獨的輔助病毒或擬病毒都不能使植物受到感染。20世紀(jì)80年代以來，在澳大利亞陸續(xù)從絨毛煙、苜蓿、莨菪和地下三葉草上發(fā)現(xiàn)了四種新的植物病毒。這些病毒的蛋白質(zhì)衣殼內(nèi)都含有兩種RNA分子，一種分子量為1.5×106Da的線狀RNA1，另一種為分子量約為105Da的類似于類病毒的環(huán)狀RNA2，這種RNA2分子被稱為擬病毒(Virusoid)。30年前，通過電子顯微鏡的觀察第一次在真核生物中發(fā)現(xiàn)了RNAs能夠以環(huán)狀的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。錯排外顯子傳統(tǒng)認(rèn)為的拼接模式如左圖所示，按照5端到3端的順序依次進(jìn)行外顯子的轉(zhuǎn)錄；右圖為環(huán)狀RNA的拼接模式假想圖，主要是關(guān)于不帶A尾等末端結(jié)構(gòu)的外顯子的供體與受體的假設(shè)。

最具特征性的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物存在于噬齒類動物中。小鼠的Y染色體性別決定基因由單一的外顯子組成。過去認(rèn)為它對應(yīng)的RNA是以線性形式存在而具有翻譯蛋白質(zhì)的功能?，F(xiàn)在的研究表明它主要是以環(huán)狀的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，并且基本沒有翻譯功能。有研究表明染色體上SRY外顯子的錯亂逆序復(fù)制形成環(huán)狀。另外還有鈉轉(zhuǎn)運基因（NCX1）和大鼠細(xì)胞色素P4502C24基因也低水平的表達(dá)為環(huán)狀亞型。盡管沒有實質(zhì)的證據(jù)，NCX1基因的環(huán)狀亞型被認(rèn)為具有翻譯蛋白的功能。但這些已知的研究報告均認(rèn)為人體細(xì)胞中環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物的水平遠(yuǎn)低于線性分子。于是，環(huán)狀RNA被認(rèn)為是偶然出現(xiàn)在動物體內(nèi)又或者說是線性RNA的一個形成前體。本文作者收集5名患有急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)患兒的腫瘤樣本，利用IlluminaGAII對ALL樣品進(jìn)行末端配對測序，隨后將生成的讀值與數(shù)據(jù)庫中人類轉(zhuǎn)錄組外顯子-外顯子連接(exon-exonjunction,EEJ)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對，他們發(fā)現(xiàn)有超過1200種基因轉(zhuǎn)錄物中存在順序錯亂的外顯子。其中大量的轉(zhuǎn)錄物表明基因中存在的相當(dāng)大比例的異構(gòu)體。更進(jìn)一步的試驗中，作者證實這種外顯子錯排現(xiàn)象不僅存在于白血病細(xì)胞中，在Hela細(xì)胞系及正常人原代血細(xì)胞中也有。并且，對3種白細(xì)胞類型的RNA測序試驗結(jié)果顯示有800多種基因存在重排異構(gòu)體，約占轉(zhuǎn)錄物比例的10%。另外，研究人員對通過公共渠道獲得的HeLa細(xì)胞和人類胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，也發(fā)現(xiàn)了1748種非標(biāo)準(zhǔn)序列的外顯子異構(gòu)體。對小鼠大腦RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后的結(jié)果證實，這樣的異構(gòu)體同樣也存在于其他動物中。通過隨后的統(tǒng)計學(xué)及生物化學(xué)分析，研究人員推導(dǎo)出這樣的結(jié)論，外顯子重排通常形成了環(huán)狀而非線性的轉(zhuǎn)錄物，數(shù)以百計這樣的轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中呈高水平表達(dá)，甚至在某些情況下水平與標(biāo)準(zhǔn)的異構(gòu)體相似。環(huán)狀RNA的生物源性目前為止還是不清楚本文作者使用之前鑒定的一個高表達(dá)環(huán)狀RNA，主要研究其對miR-7的影響。研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)這一環(huán)狀RNA包含了70個miR-7的結(jié)合位點，并將其命名為ciRS-7(circularRNAspongeformiR-7)。而ciRS-7的表達(dá)使得miR-7活性受到抑制，miR-7靶基因表達(dá)增高，研究團(tuán)隊推測這是因為ciRS-7捕獲和失活了miR-7。MicroRNAs是一些通過結(jié)合和阻止mRNA翻譯阻斷基因表達(dá)的短片段RNA。而MiR-7的靶標(biāo)與癌癥和帕金森氏病存在著關(guān)聯(lián)。本文還對前面提到的環(huán)狀SRY對miR-138功能的影響進(jìn)行了研究。這也是目前來說第一次對自然表達(dá)的環(huán)狀RNA功能的研究。C圖為轉(zhuǎn)染了SRY表達(dá)載體和空載體在HEK293細(xì)胞（細(xì)胞中存在miR-138和miR-769）上的表達(dá)量。D圖為轉(zhuǎn)染了SRY表達(dá)載體和空載體在HEK293細(xì)胞（細(xì)胞中存在miR-138和miR-7）上的表達(dá)量這說明環(huán)狀SRY在miR-138存在時能提高表達(dá)量，或許存在與miR-138的結(jié)合位點。同時，這也再次證明環(huán)狀RNA分子與miRNA存在功能調(diào)節(jié)上的關(guān)系。無獨有偶，差不多時間發(fā)表于nature上的另一篇研究環(huán)狀RNA功能的文章也將注意力放在了miRNA上面。這一研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)一種人類的circRNAs，它能夠調(diào)節(jié)翻譯小腦退化相關(guān)的蛋白1的轉(zhuǎn)錄物，故稱之為CDR1as。而這一circRNAs上含有63個隱藏的miRNA-7結(jié)合位點。在石斑魚體內(nèi)敲除miRNA或者CDR1as表達(dá)都會影響其中腦的發(fā)育。圖為石斑魚的腦組織，可以看出miRNA與CDR1as均能損害其中腦的發(fā)育，但當(dāng)二者一起作用時卻出現(xiàn)了拮抗作用，中腦發(fā)育的影響不大。CDR1asandmiR-7haveoverlappingandspecificexpressioninneuronaltissuesCDR1as和miR-7在小鼠神經(jīng)元細(xì)胞上能夠一樣地表達(dá)，但是在小鼠的其他組織中CDR1as幾乎不表達(dá)，而miR-7則在各個組織中均有表達(dá)，而且個別組織中表達(dá)量很大。1、這兩篇發(fā)表nature上的文章作者都有提到，環(huán)狀RNA的功能可能還有很多，但是從他們的實驗可以得出一個結(jié)論就是：環(huán)狀RNA可以調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)。2、從后面這篇文章來看，環(huán)狀RNA本身可能就具有調(diào)節(jié)mRNA的功能，并且反過來講的話，miRNA可能也會作用于circRNAs，它們的作用可能是相互的。3、值得一提的是，關(guān)于miRNA的研究目前已經(jīng)很多了，而circRNAs的具體研究則剛剛起步，這或許