乙酰膽堿酯酶活性抑制劑篩選比色法檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

PAGEPAGE3乙酰膽堿酯酶活性抑制劑篩選比色法檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）主要用途Ellman試劑反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-值的變化，即采用比色法來評(píng)價(jià)樣品酶活抑制能力的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種抑制劑篩選檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。技術(shù)背景乙酰膽堿酯酶AcetylcholinesterasAchEC3.1.1.7，又稱為紅細(xì)胞膽堿酯酶RBCcholinesteras，廣泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在腦組織、神經(jīng)肌肉連接處（neuromuscularjunction、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能突觸（cholinergicsynapses）和紅細(xì)胞膜上高度表達(dá)，催化主要的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的水nasphyxiation（acetylthiocholineiodide膽堿thiocholine），與Ellma試劑5,5-二硫基-雙2-硝基苯甲酸[5,5-dithiobis（2-nitrobenzoicacid；DTNB反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoicaci；TN，通過其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來定量分析乙酰膽堿酯酶抑制劑的效應(yīng)。乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)為：Acetylcholinesteraseacetylthiocholineiodide → acetate + inhibitorDTNB + thiocholine → TNB+ choline-S-S-TNB產(chǎn)品內(nèi)容緩沖液（ReagentA）反應(yīng)液（ReagentB）底物液（ReagentC）陰性液（ReagentD）產(chǎn)品說明書

20毫升2毫升2毫升1毫升1份保存方式保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（ReagentB）和底物液（ReagentC）避免光照；有效保證6月用戶自備乙酰膽堿酯酶：用于抑制劑篩選1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器比色皿或96孔板：用于比色的容器分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析實(shí)驗(yàn)步驟一、測(cè)定準(zhǔn)備準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里備用開啟并設(shè)定好分光光度儀（37℃412n53次（15分鐘零從－20℃冰箱里取出試劑，反應(yīng)液（ReagentB）底物液（ReagentC）照緩沖液（Reagent96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、完全活性和待測(cè)抑制劑樣品輕輕搖動(dòng)96輕輕搖動(dòng)96孔板，混勻，放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作內(nèi)容物緩沖液（Reagent空背景對(duì)照10微升樣本背景10微升完全酶活性10微升待測(cè)抑制劑酶活性10微升A）陰性液（ReagentD）10微升5微升5微升——待測(cè)抑制劑——5微升――5微升用戶自備的純化酶————5微升5微升（1至5毫單位）（1至5毫單位）96孔板每孔總量空背景對(duì)照孔（20微升）樣本背景孔（20微升）完全活性孔（20微升）待測(cè)抑制劑樣品孔（20微升）130緩沖液（Reagent96孔板的所有孔里25反應(yīng)液（ReagentB）25底物液（Reagent96孔板373分鐘20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品3715分鐘10．（選擇步驟）完全酶活計(jì)算：[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）XX0.20（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X13.6（毫摩爾吸光系數(shù)0.6（光徑距離；厘米15（反應(yīng)時(shí)間；分鐘單位/毫升樣品蛋白濃度）毫克毫升＝單位毫克單位＝微摩爾硫代膽堿11．抑制活性計(jì)算：（完全活性讀數(shù)－空背景對(duì)照讀數(shù)）－（抑制劑樣品活性讀數(shù)－樣本背景讀數(shù)）（讀數(shù)－空背景對(duì)照讀數(shù)）＝實(shí)際抑制百分率X（所需抑制劑樣品濃度）＝（）X50％3）（Y）為吸光單位（OD；橫座標(biāo)（X）為已知抑制劑濃度注意事項(xiàng)20操作時(shí)，須戴手套樣品須澄清，至關(guān)重要315用戶根據(jù)實(shí)際需求，可以調(diào)整純酶的濃度如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度可以使用乙酰膽堿酯酶抑制劑