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文檔簡介

Illumina16S宏基因組學(xué)文庫制備流程DNA制備、質(zhì)檢V3、V4區(qū)擴增擴增產(chǎn)物純化、質(zhì)檢PCR導(dǎo)入測序接頭文庫純化、質(zhì)檢上機前文庫定量、pooling文庫變性、稀釋上機一、DNA制備、質(zhì)檢：提取試劑：OMEGA試劑盒：Soil，Water，Stool等。具體看樣品。購買裂解液，組合AMPureXPbeads提取。DNA質(zhì)量：濃度≥5ng/μl；260/280=1.8；260/230=1.8；如果純度低，用Qubit測值。瓊脂糖凝膠電泳沒有嚴(yán)重降解；將DNA稀釋到5ng/μl；二、V3.V4區(qū)擴增：序列：另附文獻(xiàn)；Forward：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG--CCTACGGGNGGCWGCAG-3'Reverse：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG--GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'試劑：2xKAPAHiFiHotStartReadyMix；Code：KK2601；操作流程：三、擴增產(chǎn)物純化、質(zhì)檢：20μl（0.8×）BECKMANAMPureXPbeads純化PCR產(chǎn)物；磁珠回溶52μl，吸取50μl。測試階段根據(jù)濃度大?。涵傊请娪净蛘逜gilent2100確定擴增是否準(zhǔn)確。四、PCR導(dǎo)入測序接頭：序列：Nexteraindexkit-PCRPrimerN701:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-TCGCCTTA-GTCTCGTGGGCTCGG-3’N501:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TAGATCGC-TCGTCGGCAGCGTC-3’試劑：2xKAPAHiFiHotStartReadyMix；Code：KK2601；操作流程五、文庫純化、質(zhì)檢56μl（1×）BECKMANAMPureXPbeads純化PCR產(chǎn)物；回溶27μl，吸取25μl；QubitHSdsDNAKit測定文庫濃度；根據(jù)文庫濃度：瓊脂糖電泳或者Agilent2100確定擴增是否準(zhǔn)確。六、上機前文庫定量、pooling根據(jù)公式：；計算文

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