基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（三）：實(shí)驗(yàn)4 植物有絲分裂的孚爾根(Feulgen)核染色觀察

實(shí)驗(yàn)四植物有絲分裂的孚爾根(Feulgen)核染色觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆真跔柛巳旧姆椒āＡ私怄跔柛旧脑?。有絲分裂實(shí)驗(yàn)原理浮爾根染色法是鑒別細(xì)胞中DNA的組織化學(xué)方法.DNA—１ＮHCl,60OC水解,部分地破壞核糖與嘌呤之間的糖苷鍵—嘌呤堿脫掉—核糖的C1上的醛基呈游離態(tài)—與Schiff試劑的無(wú)色亞硫酸品紅分子反應(yīng)——呈現(xiàn)為紫紅色的化合物。酸解使DNA醛基暴露醛基與Schiff試劑發(fā)生顯色反應(yīng)1NHCl60℃孚爾根核染色法是Feulgen和Rossonbek于1924年提出的鑒定細(xì)胞中DNA的組織化學(xué)方法。其優(yōu)點(diǎn)是制片清潔、染色體清晰、組織軟化好，易于壓片。但對(duì)小型染色體（如玉米、水稻）效果較差。在切片、涂片上研究核和染色體時(shí)，能減少細(xì)胞質(zhì)著色對(duì)觀察的影響。在細(xì)胞學(xué)研究中普遍采用Schiff試劑的組成及配制Schiff試劑：即無(wú)色亞硫酸品紅。配制方法：溶解1g堿性品紅于200ml煮沸的重蒸水中，輕輕搖動(dòng)，繼續(xù)煮5min使其完全溶解，冷卻至55-50℃時(shí)過濾到棕色帶塞子的玻璃瓶中，加入1NHCl20ml，繼續(xù)冷卻至25℃左右，再加入1g偏重亞硫酸鈉，搖動(dòng)使之溶解，置黑暗低溫處或冰箱內(nèi)18-24小時(shí)后檢查，試劑如透明無(wú)色或淡黃色即可使用。漂洗液——200ml水+10ml1MHCl+1g偏亞硫酸鉀（鈉）材料：大蒜根尖、洋蔥根尖1mol/L鹽酸(常溫和60℃)Schiff試劑45%醋酸或亮綠固定：將新鮮的活組織從生物體取下后，立即投入固定劑中，借助化學(xué)藥品的作用，使細(xì)胞保持原有形態(tài)結(jié)構(gòu)的一種手段。實(shí)驗(yàn)步驟固定的目的迅速防止細(xì)胞的死后變化，防止自溶、腐敗，盡量保持生長(zhǎng)狀態(tài)結(jié)構(gòu)。使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持生前狀態(tài)。使組織內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折射率，便于鑒定、觀察。使不同組織成分對(duì)染料有不同的親和力，便于染色。防止細(xì)胞過度收縮或膨脹，失去原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定液簡(jiǎn)單固定液：如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等?；旌瞎潭ㄒ海喝鏑arnoy’s固定液、AF液（乙醇:甲醛=9:1)Carnoy’s固定液Carnoy’s固定液：冰醋酸:氯仿:無(wú)水乙醇=1:3:6改良Carnoy’s固定液：冰醋酸:無(wú)水乙醇=1:3預(yù)處理的目的及方法目的：改變細(xì)胞質(zhì)粘度，破壞和抑制紡錘體的形成，使染色體適度縮短和分散。方法：0.04-0.2%秋水仙素溶液2-4小時(shí)。對(duì)二氯苯飽和溶液3-5小時(shí)。0.002M(或0.03%)8-羥基喹啉1.5-2小時(shí)以上，室溫。低溫：1-4℃處理24小時(shí)。1、取材:每人1-2個(gè)根尖置于eppendorf管——dH2O洗2-3次——1NHCl，室溫2分鐘。2、水解:倒掉HCL，換入60O預(yù)熱的HCl——60O水浴10’。去掉熱HCl，再換冷HCl，1分鐘，——蒸餾水洗2次3、染色:吸凈水分，加入Schiff試劑,蓋上蓋子，暗處染色30’——漂洗液漂洗2次，2分鐘/次4、取根尖置于載玻片上，用鑷子夾碎后，再加一滴45%的醋酸，壓片鏡檢。分組：6人一組

HEXIUNIVERSITY根冠分生區(qū)伸長(zhǎng)區(qū)成熟區(qū)根尖形態(tài)與結(jié)構(gòu)注意事項(xiàng)Schiff試劑小心取放，及時(shí)清洗吸取Schiff試劑的吸管。黑暗條件下染色。實(shí)驗(yàn)作業(yè)繪制你所觀察到的圖象，并說(shuō)明是有絲分裂的哪一個(gè)時(shí)期，并注明放大倍數(shù)。前期、中期、后期、末期思考題為什么要嚴(yán)格掌握DNA的水解條件？為什么實(shí)驗(yàn)材料從60℃鹽酸中倒出后，還要放入室溫的鹽酸中呢？為什么RNA在此過程中不會(huì)著色？為什么要嚴(yán)格掌握DNA的水解條件？溫度過低，時(shí)間過短：則DNA的水解不夠徹底，醛基暴露不充分，染色會(huì)過淺。溫度過高，時(shí)間過長(zhǎng)：則DNA過度水解，游離的核苷酸會(huì)漂移到細(xì)胞質(zhì)中，造成染色淺或不均一。

材料從60℃的鹽酸倒出后溫度還相當(dāng)高，如果直接轉(zhuǎn)入Schiff試劑中，則會(huì)使Schiff試劑發(fā)生分解影響效果。所以我們首先要把材料轉(zhuǎn)入室溫的鹽酸溶液中，做一個(gè)緩沖以避免Schiff試劑分解。為什么要在實(shí)驗(yàn)材料從60℃鹽