O157檢驗(yàn)方法的建立及實(shí)驗(yàn)室比對結(jié)果的報(bào)告

GB4789.36-2008

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)

大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)廖興廣

liaoxg@

河南省疾病預(yù)防控制中心2009.3.14一、背景任務(wù)來源

2.項(xiàng)目負(fù)責(zé)與協(xié)作單位

本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位是中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所協(xié)作單位：河南CDC、浙江CDC、北京CDC、湖北CDC、吉林CDC、上海CIQ3.背景資料認(rèn)識爆發(fā)與流行情況：國際、國內(nèi)二、標(biāo)準(zhǔn)制訂遵循的原則參照美國FDA、美國USDA、北歐食品分析委員會（NMKL）、AOAC的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的比對與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，吸取快速檢測方法，力求科學(xué)實(shí)用、準(zhǔn)確可靠，易于掌握和推廣使用。三、國際現(xiàn)狀食品中O157:H7大腸桿菌檢驗(yàn)的傳統(tǒng)方法，F(xiàn)DA/BAM、USDA/BAM、NMKL、CCFRA、AOAC/BAM等均制定了相關(guān)及檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)DA/BAM、AOAC/BAM、CCFRA方法中將免疫磁珠分離技術(shù)作為選用方法，USDA/BAM、NMKL將免疫磁珠分離技術(shù)作為指定方法。富集培養(yǎng)基：FDA/BAM使用EHECEnrichmentBroth(EEB)+CCV，USDA/BAM使用mEC+n，NMKL使用mTSB+Nov20mg/l，CCFRA使用BPW-VCC或mEC+n，AOAC/BAM使用mTSB+Nov。分離培養(yǎng)基：FDA/BAM為CT-SMAC、USDA/BAM為Rainbowagar、NMKL為CT-SMAC、CCFRA為SMAC和CT-SMAC、AOAC/BAM為Rainbowagar。分析樣品量USDA/BAM為65g，其余為25g。培養(yǎng)溫度：NMKL為41.5±0.5℃，USDA/BAM為35±2℃，其余為37℃。質(zhì)量控制與安全性控制：USDA/BAM四、主要修訂內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)第一法修改采用美國FDABacteriologicalAnalyticalManualOnlineChapter4ASeptember2002。第二法修改采用歐洲NMKLNordicCommitteeOnFoodAnalysisNo1641999。第三法修改采用AOAC-RIPerformanceTestedMethodsVIDAS

E.ColiO157（ECO）Test，2005.18。第四法等同采用AOAC-RIPerformanceTestedMethodsBAX?E.ColiO157:H7,2004.3。本標(biāo)準(zhǔn)第一法與美國FDA/BM方法的主要差異如下：—文本的格式、文字描述。—增菌培養(yǎng)基以mEC+nov肉湯替代了EEB＋CCV肉湯?！黾恿薈HROMagarTMO157顯色培養(yǎng)基?！黾恿速|(zhì)量控制與生物安全方面的內(nèi)容描述。本標(biāo)準(zhǔn)第二法與NMKLNordicCommitteeOnFoodAnalysisNo1641999的—文本的格式、文字描述。—增菌培養(yǎng)基以mEC+nov肉湯替代了mTSB肉湯?！薷脑鼍囵B(yǎng)溫度41.5℃±0.5℃為36℃±1℃。—增加了CHROMagarTMO157顯色培養(yǎng)基。本標(biāo)準(zhǔn)第三法與AOAC-RIPerformanceTestedMethodVIDAS

E.ColiO157（ECO）Test的主要差異如下：—文本的格式、文字描述?！霸鼍囵B(yǎng)基以mEC+nov肉湯替代了mTSB肉湯。腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)操作程序一、常規(guī)方法檢樣↓25g(mL)+改良EC肉湯(mEC+n）225ml

快速篩選陰性

36±1℃18～24h

陽性報(bào)告CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板

36±1℃↓18～24h挑取可疑菌落5～10個(gè),氧化酶陰性,革蘭氏陰性桿菌接種TSI↓MUG-LST36±1℃18～24h

陽性陰性↓↓非O157菌血清學(xué)試驗(yàn)↓生化試驗(yàn)

↓報(bào)告操作步驟1增菌以無菌操作取檢樣25g(mL)加入到含有225mLmEC+n肉湯的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1～2

min。于36±1℃培養(yǎng)18～24h。同時(shí)做陽性及陰性對照。

CCP:無菌操作，陰陽行對照避免交叉污染。2.分離取增菌后或篩選試驗(yàn)陽性的mEC+n肉湯，分別劃線或適當(dāng)稀釋后取0.1mL涂布接種于CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板上，于36±1℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落。必要時(shí)將混合菌落分純。在CT-SMAC平板上，發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色；典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色，用接種針挑起時(shí)無拉絲現(xiàn)象。在改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色-紫紅色，邊緣無色或淺灰色。CCP:增菌后的肉湯在取樣前，應(yīng)輕微搖晃混勻。劃線時(shí)應(yīng)多次往返，保證分離效果。涂布時(shí)應(yīng)適當(dāng)稀釋。注意區(qū)分典型菌落，必要十分純。大部分非O157E.coli發(fā)酵山梨醇，仍有6%不發(fā)酵山梨醇，它們與摩根氏菌和哈夫尼亞菌一樣在TC-SMAC上表現(xiàn)為與O157相同的菌落特征。3.初步生化試驗(yàn)在CT-SMAC和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板上挑取5～10個(gè)典型或可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時(shí)接種MUG-LST肉湯，于36±1℃培養(yǎng)18～24h。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈陽性反應(yīng)呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生H2S。置MUG-LST肉湯管于長波紫外燈下觀察，陽性對照應(yīng)無熒光產(chǎn)生，陰性對照應(yīng)有熒光；對分解乳糖且無熒光的菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上分純，于36±1℃培養(yǎng)18～24h，并進(jìn)行下列鑒定。CCP:菌落選擇：挑取典型菌落，數(shù)量在5個(gè)以上，盡量多挑。注意混合菌落的識別，進(jìn)行分純后挑去。在觀察MUG實(shí)驗(yàn)時(shí)，與陰性、陽性對照一起觀察，應(yīng)帶上防紫外線的護(hù)目鏡，注意紫外線對眼鏡的傷害

。4.鑒定4.1血清學(xué)試驗(yàn)在營養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157:H7標(biāo)準(zhǔn)血清或O157乳膠凝集試劑作玻片凝集試驗(yàn)。血清凝集試驗(yàn)應(yīng)做生理鹽水對照。對于H7因子血清不凝集者，應(yīng)穿刺接種半固體瓊脂管，檢查動力，經(jīng)連續(xù)傳代3次，動力試驗(yàn)陰性，H7因子血清凝集陰性者，確定為無動力株。CCP:先做O157血清凝集，后做H7因子凝集，注意自凝菌，用生理鹽水做對照。4.2生化試驗(yàn)用API20E或VITEK-GNI+或其它腸桿菌科生化鑒定試劑盒，按照生產(chǎn)商提供的使用說明進(jìn)行。CCP:進(jìn)行生化試驗(yàn)時(shí)應(yīng)是用新鮮培養(yǎng)物（24h）。菌液的稀釋應(yīng)注意無菌操作，濁度應(yīng)達(dá)到使用說明的要求。二、免疫磁珠捕獲法檢樣↓25g(mL)+改良EC肉湯(mEC+n）225ml

快速篩選陰性

36±1℃18～24h

陽性報(bào)告免疫磁珠捕獲CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板

36±1℃↓18～24h挑取可疑菌落5～10個(gè),氧化酶陰性,革蘭氏陰性桿菌接種TSI↓MUG-LST36±1℃18～24h

陽性陰性↓↓非O157菌血清學(xué)試驗(yàn)↓生化試驗(yàn)

↓報(bào)告操作步驟1.增菌：同常規(guī)法。2.磁珠分離：2.1將Eppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號，每個(gè)樣品使用1只Eppendorff管，然后插入到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E.coliO157免疫磁珠溶液后，用開蓋器打開每個(gè)Eppendorff管的蓋子，每管加入20μL

E.coliO157免疫磁珠懸液。CCP：磁珠在加入前在混旋器上短暫混勻，不可劇烈震蕩，避免產(chǎn)生泡沫。

2.2取mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物1mL，加入到Eppendorff管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩10s。每個(gè)樣品更換1只加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開進(jìn)行，避免交叉污染。

CCP:取樣前混勻，避開脂肪層與雜質(zhì)，必要時(shí)使用濾網(wǎng)。

加樣后立即混勻。對照同時(shí)做。

2.3結(jié)合：在18～30℃環(huán)境中，將上述Eppendorff管連同磁板架放在適合的裝置上轉(zhuǎn)動或用手輕微轉(zhuǎn)動10min，使E.coliO157與免疫磁珠充分接觸。

CCP：注意室內(nèi)溫度，保證結(jié)合時(shí)間。結(jié)合時(shí)不要將磁鐵插入到磁板架中。

用手轉(zhuǎn)動時(shí)應(yīng)輕輕顛倒Eppendorff管架，不可劇烈搖動。保證磁珠與O157的結(jié)合。2.4捕獲：將磁板插入到磁板架中濃縮磁珠。在3min內(nèi)不斷地傾斜磁板架，確保懸液中和蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來，此時(shí)，在Eppendorff管壁中間明顯可見的圓形或橢圓形棕色聚物。2.5吸取上清液：取1支滅菌的加長吸管，從免疫磁珠聚集物對側(cè)深入液面，輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過免疫磁珠積聚物時(shí)，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將其放回到Eppendorff管中，并重復(fù)2.4步驟。每個(gè)樣品換用1支加長吸管。免疫磁珠的滑落：某些樣品特別是那些富含脂肪的樣品，其磁珠積聚物易于滑落到管底。在吸取上清液時(shí)，很難做到不丟失磁珠，在這種情況下，可保留50～100μL上清液于Eppendorff管中。如果在后續(xù)的洗滌過程中也這樣做的話，脂肪的影響將減小，也可達(dá)到充分捕獲的目的。2.6洗滌：從磁板架上移走磁板，在每個(gè)Eppendorff中加入1mLPBS-Tween20洗液，轉(zhuǎn)動磁板架3次以上，洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟2.4～2.6。2.7重復(fù)上述步驟2.4～2.5CCP:洗滌共3次，動作要輕柔。吸取上清液至磁珠聚集物處時(shí)，應(yīng)放慢速度。上清液的吸取應(yīng)盡量完全。使用多塊磁珠分離裝置時(shí)，磁鐵與磁鐵應(yīng)遠(yuǎn)離放置。

2.8免疫磁珠懸?。阂谱叽虐?，將免疫磁珠重新懸浮在100μLPBS-Tween20洗液中。

2.9涂布平板用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取50μL免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板一側(cè)，然后用涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于36±1℃培養(yǎng)18～24h。注意，若CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157顯色瓊脂平板表面水分過多時(shí)，應(yīng)在37℃下干燥10～20min，涂布時(shí)避免將免疫磁珠涂布到平板的邊緣。2.10菌落識別、初步生化試驗(yàn)、鑒定同常規(guī)法。五、第一法與美國FDA方法比較實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

－樣品的選擇：生豬肉餡、生菜。

－樣品的染菌：將樣品充分混勻，稱取25g樣品，加入O157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC43888）生理鹽水懸液，染菌樣品的各種濃度見表1。

－實(shí)驗(yàn)操作：大腸埃希氏菌O157:H7檢驗(yàn)SOP。

－結(jié)果判斷：大腸埃希氏菌O157:H7常規(guī)檢驗(yàn)方法與美國FDA方法、免疫磁珠捕獲方法與NMKL方法進(jìn)行兩兩配對檢驗(yàn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法Chi-squareTest（X2檢驗(yàn)）進(jìn)行分析。結(jié)果表1常規(guī)法與美國FDA方法檢出率的比較表產(chǎn)品類別方

法0.5cfu/g1cfu/g5cfu/g合

計(jì)樣品數(shù)檢出率(％)P值樣品數(shù)檢出率(％)P值樣品數(shù)檢出率(％)P值樣品數(shù)檢出率(％)P值肉類常規(guī)法6561.50.8566587.70.7956595.40.69819581.50.897美國FDA法6563.16586.26593.819581.0蔬菜類常規(guī)法6558.50.8596586.20.6276592.30.73019579.00.805美國FDA法6557.96582.96593.819577.9總計(jì)常規(guī)法13060.01.00013086.90.59413093.81.00039080.30.789美國FDA法13060.013084.613093.839079.0

結(jié)論常規(guī)法與美國FDA法比較，分生肉類和蔬菜類兩類樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，染菌量在0.5cfu/g、1cfu/g、5cfu/g時(shí)，檢出率比較P值范圍在0.594～1.000，均大于0.05，無顯著性差異。六、免疫磁珠捕獲方法與NMKL方法的比較

產(chǎn)品類別方

法0.1cfu/g0.5cfu/g1cfu/g合

計(jì)樣品數(shù)檢出率(％)P值樣品數(shù)檢出率(％)P值樣品數(shù)檢出率(％)P值樣品數(shù)檢出率(％)P值肉類磁珠法6572.30.6906590.80.2866592.30.46519585.11.000NMKL法6575.46584.66595.419585.1蔬菜類磁珠法6572.30.8466587.70.5716590.81.00019583.60.891NMKL法6570.86590.86590.819584.1總計(jì)磁珠法13041.50.87913089.20.69813091.50.64239084.40.921NMKL法13042.313087.713093.139084.6表2磁珠法與NMKL方法的比較表結(jié)論磁珠法與NMKL法比較，分生肉類和蔬菜類兩類樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，染菌量在0.1cfu/g、0.5cfu/g、1cfu/g時(shí)，檢出率比較：P值范圍在0.286～1.000，均大于0.05，無顯著性差異。七、增菌培養(yǎng)溫度對結(jié)果的影響選擇36和42℃進(jìn)行比較（常規(guī)法）樣品種類樣品份數(shù)加入菌量

cfu/25g36℃42℃陽性數(shù)陽性率％陽性數(shù)陽性率％生豬肉51.25120120512.5360360香菜51.25360240512.551005100八、不同培養(yǎng)基分離效果CT-SMAC：菌落較大，存在較多的山梨醇發(fā)酵陰性的細(xì)菌菌落生長，干擾O157的檢出。CHROMagarO157：較多的非O157菌落生長，菌落較大，影響O157菌的檢出改良CHROMagarO157：非O157細(xì)菌生長較少且菌落相對局限，O157菌落特征性明顯。九、O157檢驗(yàn)方法的條件優(yōu)化1.增菌培養(yǎng)基：國際上采用的為mEC+n、mTSB+n、EHECEnrichmentBroth(EEB＝TSB)+CCV、BPW-VCC。通過比較，mEC與mTSB差異不大，且為我國“污染物監(jiān)測網(wǎng)”和“全國腸出血性大腸桿菌O157:H7感染性腹瀉”檢測中普遍使用。2.增菌培養(yǎng)溫度：國際方法中有3個(gè)培養(yǎng)溫度：NMKL為41.5±0.5℃、USDA/BAM為35±2℃，其余為37℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在41.5±0.5℃時(shí)，溫度作為一個(gè)選擇性因子，能夠抑制雜菌叢的生長，但