酶工程筆記和期末重點(diǎn)

17/17第五章生物藥物的酶學(xué)分析法酶學(xué)分析法原理：利用酶作為分析工具，測定樣品中待測物質(zhì)含量的方法稱作酶法分析。待測物質(zhì)應(yīng)是酶的底物，或者是酶的抑制劑、活化劑或酶的輔因子，否則不能采用酶法進(jìn)行分析檢查。酶法分析可分為終點(diǎn)法和反應(yīng)速度法。（一）終點(diǎn)法，又稱總變量法基本原理：利用酶的生物催化反應(yīng)，使待測物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，然后測定產(chǎn)物產(chǎn)量或底物殘余量，通過定量分析，從而明確待測物質(zhì)的含量?？梢允菃蚊阜磻?yīng)，也可以是幾種酶構(gòu)成的偶聯(lián)酶反應(yīng)。在生物藥物分析中，終點(diǎn)法是最常用的酶法分析。終點(diǎn)法的條件必須有專一地作用該被測物質(zhì)的酶，并能得到它的制品。能夠確定使這種酶反應(yīng)接近進(jìn)行完全的條件。反應(yīng)中底物的減少或產(chǎn)物的增加或輔酶物質(zhì)的改變等可以借助某種簡單的方法進(jìn)行測定。在能滿足這些條件的情況下，最好是采用單一酶反應(yīng)就能進(jìn)行定量檢測。使用終點(diǎn)法應(yīng)注意的問題1．酶的底物專一性：絕對專一性相對專一性立體異構(gòu)專一性對于酶法分析來說，最理想的酶是具有絕對專一性的酶。若樣品中存在除待測物質(zhì)外其他可作為底物的物質(zhì)時，可利用偶聯(lián)酶的專一性進(jìn)行區(qū)別定量分析。2．反應(yīng)的平衡對于終點(diǎn)法來說，要求反應(yīng)接近進(jìn)行完全，故對不同的酶反應(yīng)須采取不同的措施使反應(yīng)進(jìn)行到接近完全。若酶反應(yīng)平衡十分偏向進(jìn)行方向，則可方便的用終點(diǎn)法進(jìn)行檢測，不需進(jìn)行任何處理。若反應(yīng)的平衡并不十分偏向進(jìn)行方向，或偏向逆方向，那么由于反應(yīng)不能完全，因而也就不能正常定量。為了解決這一問題，通常采取以下一些措施：對于雙底物反應(yīng)盡可能提高第二底物的濃度對氧化還原之類與H＋有關(guān)的反應(yīng)要選擇適當(dāng)?shù)膒H設(shè)法除去產(chǎn)物用具有不同平衡常數(shù)的輔酶類似物代替原有的輔酶和第二底物的再生系統(tǒng)偶聯(lián)，則第一底物可能完全轉(zhuǎn)化為反應(yīng)產(chǎn)物3．反應(yīng)液中的酶量對于一個具體的測定來說不同的酶反應(yīng)有不同的Km值，通過米氏方程和均相溶液反應(yīng)的動力學(xué)推算和分析，可以大致得到如下的結(jié)論：對于單酶反應(yīng)的酶法分析：所加入的酶量（u/ml）相當(dāng)于Km（mmol）對于偶聯(lián)反應(yīng)的酶法分析，所加入的酶量如下：第一反應(yīng)為酶量（u/ml）相當(dāng)于Km1（mmol）第二反應(yīng)為酶量（u/ml）相當(dāng)于（1～2）×Km2（mmol）4.反應(yīng)產(chǎn)物抑制二、反應(yīng)速度法抑制劑的測定酶循環(huán)放大分析法酶循環(huán)放大法的原理、步驟（超微量前列腺素的定量為例）（三步）第一步：轉(zhuǎn)換反應(yīng)第二步：循環(huán)反應(yīng)第三步：指示反應(yīng)：利用終點(diǎn)法測Glu（或3磷酸甘油酸）的量如何測得循環(huán)數(shù)n？用已知量的NADH已知作為NADH轉(zhuǎn)在相同條件下進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)和指示反應(yīng)NADH已知=NADH指示/nn=NADH指示/NADH已知（即用已知量的NADH已知平行做循環(huán)反應(yīng)，指示反應(yīng)）在這種方法中應(yīng)注意的幾個問題：1.在進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)之前，必須設(shè)法除去轉(zhuǎn)換反應(yīng)中剩余的輔酶，在上例中就是設(shè)法除去NAD+除去的方式：NAD和NADP的氧化型和還原型在不同的pH值下其穩(wěn)定性不同，可通過調(diào)節(jié)pH來達(dá)到目的NAD+NADP+(氧化型)NADHNADPH(還原型)pH2（25℃）1h穩(wěn)定5min99.9%被破壞pH13（60℃）10min99.9%被破壞1001h仍穩(wěn)定2.在循環(huán)反應(yīng)中，底物（不是輔酶）需夠量4．要用已知量的循環(huán)底物（上例中NADH）平行做循環(huán)反應(yīng)和指示反應(yīng)以求得循環(huán)數(shù)n（二）應(yīng)用范圍1.有循環(huán)底物參加的酶反應(yīng)的底物或酶可測定NAD、NADP、CoA等2.能與以上反應(yīng)偶聯(lián)的酶反應(yīng)的底物或酶可測定。酶法分析與酶活力測定的異同相同點(diǎn)：二者均使用了酶促反應(yīng)不同點(diǎn)：測定的目的物不同，實(shí)驗(yàn)設(shè)計不同酶活力測定中待測物為酶，因而酶必須是限速因素，而底物和輔酶等必須過量；酶法分析中待測物不是酶，而是底物或輔酶或抑制劑或激動劑等等。因而必須使待測物成為該反應(yīng)的限速因素。因此二者是不相酶法分析與酶活力測定的異同同的，不能混為一談。第六章抗生素藥物的分析一、抗生素藥物1、抗生素抗生素是指在低微濃度下即可對某些生命活動有特異抑制作用的化學(xué)物質(zhì)。抗生素主要是細(xì)菌、放線菌和真菌等微生物的代謝產(chǎn)物，對各種病原微生物有強(qiáng)大的抑制或殺滅作用?？股厮幬锏臋z查項目包括：①鑒別試驗(yàn)②異常毒性試驗(yàn)③無菌試驗(yàn)④熱原試驗(yàn)⑤降壓試驗(yàn)⑥酸堿度試驗(yàn)⑦水分測定⑧溶液澄清度檢查⑨效價測定⑩其他檢測（抗生素組分、有關(guān)物質(zhì)、比重度、熔點(diǎn)、晶型、溶媒殘留量、重金屬、溶出度等）?？股匦r單位抗生素效價的標(biāo)示量，原則上應(yīng)按所含特定的抗菌活性部分的重量來計算。在應(yīng)用中，抗生素類藥物有效成分的表示方法，是按照各種抗生素的特點(diǎn)及使用經(jīng)驗(yàn)，采用符合客觀實(shí)際的效價單位表示。常用的抗生素效價單位有重量單位、類似重量單位、重量折算單位、特定單位。（1）重量單位以抗生素中所含特定的抗菌活性部分（純游離堿或游離酸）的重量1μg作為1單位，即1mg=1000單位。如鏈霉素、紅霉素、卡那霉素、新霉素、慶大霉素、土霉素；氯霉素、新生霉素酸、利福霉素SV等均以重量單位表示。用這種方法表示，對不同有機(jī)酸根的同一抗生素，只要單位一樣或有效部分重量一樣，則這一抗生素的各種鹽類雖然稱重不同，但實(shí)際有效含量是相同的。（2）類似重量單位以特定的純抗生素制品鹽的重量1μg作為一個單位，即1mg＝1000單位，其中包括了無抗菌活性的酸根在內(nèi)。如四環(huán)素鹽酸鹽（包括無生物活性的鹽酸根在內(nèi)）。這種類似重量單位，雖然并不合理，但在國際上已經(jīng)習(xí)慣沿用。（3）重量折算單位以特定的純抗生素制品的某一重量為一個單位而加以折算。如青霉素國際標(biāo)準(zhǔn)品（1952年）青霉素G鈉稱重0.5998μg為1單位，即1mg=1670單位，則80萬單位的青霉素G鈉稱重應(yīng)為0.48g。（4）特定單位以一特定量的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品（或?qū)φ掌罚┳鳛?單位。如第一批桿菌肽國際標(biāo)準(zhǔn)品（1953年）桿菌肽A為1mg=55單位。制霉菌素（1963年）為1mg=3000單位等。這類抗生素的效價單位的精確定義很難確定，折算效價也難以計算，只能以國際標(biāo)準(zhǔn)品的效價單位，作為比較的基準(zhǔn)。目前，抗生素的劑量原則上以純品的重量表示，并加注單位。如土霉素0.25g（250000單位）；但個別品種仍以習(xí)慣沿用，如青霉素仍用單位表示劑量。第二節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素的分析一、結(jié)構(gòu)及分類6-氨基青霉烷酸（6-APA）；青霉素類；7-氨基頭孢菌烷酸（7-ACA）；頭孢菌素類；㈡理化性質(zhì)1、酸性與溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不穩(wěn)定性一、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與性質(zhì)（一）羧基酸性與堿金屬(Na+、K+)成鹽；與有機(jī)堿(普魯卡因)成鹽；（二）手性碳旋光性青霉素類C3C5C6；頭孢菌素類C6C7（三）共軛體系：青霉素類母核無明顯UV多數(shù)有苯環(huán)取代基頭孢菌素類母核有共軛體系（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性青霉素的降解途徑，與含水量和純度密切相關(guān)不穩(wěn)定性因素1、四元環(huán)張力大2、酰胺鍵易水解干燥純凈穩(wěn)定水溶液不穩(wěn)定青霉素類在某些氧化劑、酸、堿、青霉素酶（某些金屬離子）（溫度）降解失效。青霉素的降解產(chǎn)物青霉噻唑酸－青霉素酶青霉酸－強(qiáng)酸性環(huán)境青霉烯酸－弱酸性環(huán)境青霉醛－強(qiáng)酸性-加熱青霉胺－強(qiáng)酸性-加熱/青霉素酶-重金屬二、鑒別反應(yīng)（一）顯色反應(yīng)：1、異羥肟酸鐵反應(yīng)2.茚三酮反應(yīng)α-氨基茚三酮藍(lán)紫色加熱3、雙縮脲反應(yīng)β-內(nèi)酰胺類在堿性酒石酸銅作用下（開環(huán)分解）呈藍(lán)紫色4、與重氮苯磺酸反應(yīng)頭孢哌酮（酚羥基）1.頭孢他啶聚合物的測定分子排阻色譜法固定相：葡聚糖凝膠G-10流動相A：3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液流動相B：0.01%十二烷基硫酸鈉對照品溶液：頭孢他啶對照品100μg/ml2.頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查固定相：ODS流動相：0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇（62:38）1）頭孢呋辛酯Δ2-異構(gòu)體的制備：頭孢呋辛酯對照品+流動相頭孢呋辛酯Δ2-異構(gòu)體。2）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：各異構(gòu)體之間的R>1.5，以頭孢呋辛酯A異構(gòu)體計算n>1500。3、頭孢氨芐中有關(guān)物質(zhì)的檢查-反相TLC法固定相：活化后的硅膠G板置5%（V/V）正十四烷的正己烷溶液中，展至頂部，涼干展開劑：0.1mol/L枸櫞酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉-丙酮（120：80：3）供試液：本品50mg/ml對照液（1）：本品0.5mg/ml對照液（2）：α-苯甘氨酸0.5mg/ml對照液（3）：7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸0.5mg/ml結(jié)果判斷：供試液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，與對照液（2）（3）位置相同上所的斑點(diǎn)比較，其顏色不得更深；如顯其他雜質(zhì)斑點(diǎn)，與對照液（1）所顯的主斑點(diǎn)比較，其顏色不得更深。四、含量測定-容量法和儀器分析法（一）高效液相色譜法原理：利用青霉素類抗生素在一定條件下在反相硅膠上的保留行為的不同而實(shí)現(xiàn)高效分離，并與標(biāo)準(zhǔn)品相對照，而對其進(jìn)行定量的一種方法。第三節(jié)氨基糖苷類抗生素含量測定HPLC法各國藥典主要采用抗生素類藥物中高分子雜質(zhì)的檢查外源性雜質(zhì)：蛋白、多肽、多糖或抗生素與蛋白、多肽、多糖的結(jié)合物。主要來自于發(fā)酵工藝，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。內(nèi)源性雜質(zhì)：藥物的自身聚合物，來自于生產(chǎn)、貯存過程。可引發(fā)過敏。特點(diǎn)：（1）生產(chǎn)過程中的任何蛋白或碎片都可帶入產(chǎn)品中，易與藥物形成多肽類雜質(zhì)（2）形成的聚合物也可發(fā)生不同程度的降解（3）異構(gòu)體之間可以相互聚合－L-L、D-D、L-D（4）高分子雜質(zhì)與生產(chǎn)工藝密切相關(guān)高分子雜質(zhì)的控制方法（1）高效液相色譜法（2）凝膠色譜－自身對照外標(biāo)法SephadexG-10（3）離子交換色譜凝膠色譜法：利用凝膠的分子篩作用，讓藥物分子自由的進(jìn)入到凝膠顆粒內(nèi)部，而高分子雜質(zhì)被排阻的原理進(jìn)行的。故此大分子則先流出色譜柱，小分子后出峰而得以分離。高分子雜質(zhì)的分析方法分析方法1、HPLC系統(tǒng)2、簡單測定系統(tǒng)色譜適用性條件（1）藍(lán)色葡聚糖在高分子分離中的N＞2500/m，拖尾因子0.75～1.5（2）峰面積的RSD＜5％抗生素效價的微生物檢定法瓊脂擴(kuò)散法(diffusemethod即管碟法)管碟法是目前國際上測定抗生素效價的通用方法。我國藥典收載的微生物檢定法也是管碟法。此法靈敏度高，但操作較麻煩，影響試驗(yàn)結(jié)果的因素較多，需要從各個操作步驟嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，盡可能減小試驗(yàn)誤差，才能使試驗(yàn)結(jié)果達(dá)到精密、準(zhǔn)確。二、管碟法測定效價1、管碟法的原理管碟法是利用抗生素在攤布特定試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，形成含一定濃度抗生素的球型區(qū)，抑制了試驗(yàn)菌的繁殖，通過透明瓊脂培養(yǎng)基，可觀察到透明的抑菌圈。在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，對數(shù)濃度（劑量）與抑菌圈面積或直徑成正比。方法設(shè)計是在同樣條件下將已知效價的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與未知效價的供試品溶液的劑量反應(yīng)（抑菌圈）進(jìn)行比較；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品是屬于同一性質(zhì)的抗生素時，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，對一定試驗(yàn)菌所得的劑量反應(yīng)曲線，在一定劑量范圍內(nèi)應(yīng)互相平行。根據(jù)以上原理，可設(shè)計為一劑量法、二劑量法及三劑量法等，從而可以較為準(zhǔn)確地測定供試品的效價。第七章維生素及輔酶類藥物的分析如果人體缺少某種維生素，就會引起維生素缺乏癥，而影響人體的正常生理機(jī)能。VitA缺乏—夜盲癥VitB1缺乏—腳氣病VitC缺乏—壞血病VitD缺乏—佝僂病[]結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）環(huán)己烯+共軛多烯側(cè)鏈；5個雙鍵（2）存在多種立體異構(gòu)體，具有UV吸收天然VitA側(cè)鏈為全反式；（3）通常所說的維生素A是指維生素A1（4）天然來源為魚肝油，主要為醋酸酯和棕櫚酸酯。目前多為人工合成產(chǎn)物維生素A一、性質(zhì)不穩(wěn)定性共軛多烯側(cè)鏈--性質(zhì)不穩(wěn)定;臨床用其醋酸酯或棕櫚酸酯的油溶液維生素A的氧化產(chǎn)物：無生物活性紫外吸收特性具有共軛多烯側(cè)鏈—紫外吸收。λmax=325～328nm，隨VA存在狀態(tài)以及所用的溶劑，最大吸收波長的位置有所不同與SbCl3呈色—Carr-Priceλmax=620nm鑒別含量測定二、鑒別試驗(yàn)（一）三氯化銻反應(yīng)Carr-Price反應(yīng)機(jī)理：VA與三氯化銻(SbCl3)中存在的SbCl5作用形成不穩(wěn)定的藍(lán)色正碳離子。注意事項：反應(yīng)需在無水、無醇條件下進(jìn)行。水可使SbCl3水解成SbOCl乙醇可與正碳離子作用，使正電荷消失溶劑：無水三氯化銻的無醇氯仿溶液（二）紫外分光光度法UVVitA：5個共軛雙鍵，無水乙醇液λmax=326nmVitA2、A3：6個共軛雙鍵，紅移（三）薄層色譜法TLC目的：鑒別醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯含量測定（一）紫外-可見分光光度法Ch