酶活性濃度的測(cè)定技術(shù)

第五章

診斷酶學(xué)湘南學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系

臨床生化檢驗(yàn)教研室1教學(xué)目標(biāo)[教學(xué)時(shí)數(shù)]6學(xué)時(shí)[掌握]血清酶的分類、生理變異、病生機(jī)制等，同工酶及其亞型測(cè)定，臨床診斷中常用的血清酶及其同工酶，重要血清酶的測(cè)定、原理及評(píng)價(jià)。[熟悉]酶的有關(guān)酶基本知識(shí)，酶活性濃度的測(cè)定技術(shù)及酶的免疫化學(xué)測(cè)定。2

第一節(jié)血清酶

3一、血清酶的來源根據(jù)酶的來源及其在血漿中發(fā)揮催化功能的情況，將其分為：一般代謝酶組織專一酶血漿特異酶非血漿特異酶外分泌酶細(xì)胞酶一般代謝酶組織專一酶血漿特異酶非血漿特異酶外分泌酶細(xì)胞酶血清酶4

名稱

血漿特異酶

非血漿特異酶

外分泌酶細(xì)胞酶一般代謝酶組織專一酶來源肝消化腺或其它外分泌腺

各組織器官

（無器官專一性）

肝

（有器官專一性）

種類凝血酶原、Ⅹ因子、Ⅻ因子、纖溶酶原、ChE、CER、LCAT、脂蛋白脂肪酶等

胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等LDH、AST、ALT、CK、MDH等

OCT等

5二、血清酶的去路酶蛋白在血管內(nèi)的失活與降解（主要代謝去路）血清酶的半壽期（T1/2)：酶失活至原來活性一半所需時(shí)間。有助于了解同一疾病不同酶升高持續(xù)時(shí)間的差異。肝或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)血清酶的清除少數(shù)以酶原形式存在的血清酶類（凝血酶原、纖溶酶原）在活化后迅速被肝清除，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)也可能參與血清酶（LD、AST、AMY、CK等）的清除。血清酶的排泄尿路是血清中低分子量酶的重要排泄途徑，如胃蛋白酶原、淀粉酶（AMY）。轉(zhuǎn)入其它體液只有血清酶的來源與去路保持平衡，才能維持酶活性保持相對(duì)恒定。但一些病理情況往往促使這種平衡被打破，導(dǎo)致血清酶活性的變化。6三、血清酶變化的病理機(jī)制（一）合成異常合成減少合成增多肝損害導(dǎo)致合成酶的能力受損（ChE、LCAT）酶基因變異引起酶合成減少（銅氧化酶）增生性疾?。ü趋兰膊。珹LP)惡性腫瘤（前列腺癌，ACP)酶的誘導(dǎo)作用（乙醇，γ-GT）7（二）釋放增加（大多數(shù)血清酶增高的主要機(jī)制）細(xì)胞內(nèi)外酶濃度的差異對(duì)于非血漿特異酶，細(xì)胞內(nèi)外濃度差可在千倍以上，只要有少量細(xì)胞壞死或病變，血中酶濃度明顯升高。對(duì)血漿特異酶，細(xì)胞病變很少引起血中酶濃度明顯升高。酶的相對(duì)分子量（影響細(xì)胞內(nèi)釋出的關(guān)鍵）酶從細(xì)胞內(nèi)釋出的速度與酶的相對(duì)分子量成反比。如AMI時(shí)，血中最先升高的是CK（MW：85kD)，LD（MW：125kD)出現(xiàn)升高明顯延遲。酶的組織分布含酶量高且血流豐富的組織器官，其細(xì)胞內(nèi)酶進(jìn)入血流的可能性大；除少數(shù)組織專一性酶以外，大多數(shù)血清酶不能特異反映某個(gè)特定組織的病變。但同工酶的發(fā)現(xiàn)大大提高酶檢測(cè)的組織的特異性。酶在細(xì)胞內(nèi)的定位及存在形式線粒體酶不易從細(xì)胞中釋出，如ASTm的檢測(cè)往往反映肝細(xì)胞的損傷程度，且是AMI中最后升高的酶，用于判斷預(yù)后；有些酶在細(xì)胞內(nèi)與結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，較難釋放。ATP

ATP不足，細(xì)胞內(nèi)酶容易釋放。8（三）排出異常腎功能減退，血清AMY活性升高可能因酶排泄障礙而在血液中滯留。膽道梗阻，血清ALP升高的原因是梗阻區(qū)ALP合成加強(qiáng)，ALP排泄受阻而逆流入血。大多數(shù)酶，不存在以上的清除機(jī)制。9四、血清酶的生理差異（一）性別多數(shù)酶無差異，少數(shù)有差異男性高于女性：CK、ALP、γ-GT女性高于男性：LDH1（青年婦女）（二）年齡

最明顯的例子是ALP，新生兒血清中ALP略高于成人，1～5歲增至成人的2～3倍，然后逐漸下降，到10～15歲，ALP又明顯升高，可達(dá)成人的3～5倍，20歲后降至成人值。（三）飲食

血清中大多數(shù)酶不受進(jìn)食影響，故測(cè)定酶活性不一定需要空腹采血。（四）運(yùn)動(dòng)

激烈的肌肉運(yùn)動(dòng)可使血清中多種酶，如CK、LD、AST、ALD、ALT等活性升高。（五）妊娠（六）其它10第二節(jié)

酶活性濃度的測(cè)定技術(shù)11酶活性濃度的測(cè)定技術(shù)酶活性濃度概念酶活性濃度測(cè)定連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)酶活性濃度工具酶血清酶活性濃度測(cè)定條件的優(yōu)化酶活性濃度的單位12一、酶活性濃度的概念1.酶的特性：微量性、高效性等。直接測(cè)量非常困難（mmol/L或mg/dl）通過測(cè)定被加速化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率，來間接反映酶的濃度2.酶促反應(yīng)SSEE+ESEPE+PV＝dsdt或V＝dpdtES13

3.酶活性濃度

即酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率，用酶促反應(yīng)中單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來計(jì)算。注意：只有當(dāng)酶所催化的反應(yīng)速度僅與[E]成正比，而不受其它因素影響時(shí)，即在酶促反應(yīng)的零級(jí)期，才能根據(jù)酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速率來確切表示酶活性濃度的大小。14實(shí)際上是通過檢測(cè)酶活性濃度間接反映酶的量，因?yàn)橹苯訖z測(cè)酶的質(zhì)量濃度要求的實(shí)驗(yàn)條件及技術(shù)條件非常高，價(jià)格昂貴，不適用于臨床檢測(cè)，因此測(cè)定酶活性濃度是臨床酶學(xué)分析最為常見的方法，具有迅速、靈敏、成本低等特點(diǎn)。但僅在上述前提下，只能在反應(yīng)的零級(jí)期，即只有在酶促反應(yīng)的最適條件下，才能真實(shí)地代表酶含量。因此可根據(jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線，采用合理的方法進(jìn)行酶活性濃度的檢測(cè)。15零級(jí)一級(jí)[P][S]V＝dpdt反應(yīng)級(jí)數(shù)時(shí)間4.酶促反應(yīng)進(jìn)程延滯期線性期非線性期LagphaseZeroorderLinearphaseFirstorder酶促反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線16單試劑測(cè)定體系酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線17結(jié)論：

為了計(jì)算酶活性濃度，必須根據(jù)線性反應(yīng)期（零級(jí)反應(yīng)期）的反應(yīng)速率才能準(zhǔn)確計(jì)算出酶活性濃度否則將導(dǎo)致誤差。酶活性濃度測(cè)定就是要使酶促反應(yīng)的初速度達(dá)到Vmax，即在過量底物存在下的零級(jí)反應(yīng)期的V，此時(shí)V與[E]之間有線性關(guān)系。18二、酶活性濃度測(cè)定方法（一）按檢測(cè)方法分類1、量氣法其原理是通過測(cè)量一封閉反應(yīng)系統(tǒng)中氣體變化后的氣體體積或壓力，從而計(jì)算出氣體的變化量適用于測(cè)定在反應(yīng)中產(chǎn)生或消耗氣體的酶2、分光光度法酶促反應(yīng)的底物與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同，光吸收譜也有差異，不僅能在可見光范圍測(cè)定有色溶液的濃度，還能在紫外光波長(zhǎng)范圍測(cè)定特異的帶有雙鍵或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的無色物質(zhì)3、熒光法和放射性核素法通過熒光光度計(jì)測(cè)定酶促反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的速率，此速率與酶濃度成正比4、其它方法19（二）按反應(yīng)時(shí)間分類1、定時(shí)法（取樣法、終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，測(cè)定時(shí)酶促反應(yīng)已被終止，故比色計(jì)或分光光度計(jì)無需保溫設(shè)備，顯色劑的選擇不考慮對(duì)酶活性的影響。缺點(diǎn)：無法知道在整個(gè)酶促反應(yīng)進(jìn)程中是否都是零級(jí)反應(yīng)。注意：應(yīng)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)找出酶促反應(yīng)速率恒定的時(shí)期，確定線性時(shí)間；保證酶和底物在所選定的溫度下作用時(shí)間要精確。20

定時(shí)法，早期測(cè)定酶活性濃度的方法，大多是使酶作用一段時(shí)間，然后加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應(yīng)，測(cè)定這段時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)的平均速度。

連續(xù)監(jiān)測(cè)法，即指連續(xù)測(cè)定酶促反應(yīng)過程中某一產(chǎn)物或底物濃度隨時(shí)間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶促反應(yīng)初速度，間接計(jì)算出酶活性濃度的方法。其是臨床測(cè)定酶活性濃度最常用方法。212、連續(xù)監(jiān)測(cè)法（動(dòng)力學(xué)法、速率法）優(yōu)點(diǎn)：容易找到直線區(qū)域，選擇線性反應(yīng)期來計(jì)算酶活性，不需終止反應(yīng)。缺點(diǎn)：線性反應(yīng)期因酶種類和反應(yīng)條件而異，必須用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行確定，必須選取酶促反應(yīng)的最適反應(yīng)條件，需要有可以連續(xù)監(jiān)測(cè)的設(shè)備。3、平衡法

目前臨床應(yīng)用較少，通過測(cè)定酶促反應(yīng)開始至反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來求出酶活性濃度的方法。22三、連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性濃度（一）種類1.直接法

不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過測(cè)定反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物理化性質(zhì)的變化（如：A、熒光、旋光性，pH、電導(dǎo)率、粘度等），從而計(jì)算出酶活性濃度。評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)單，但只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)方面有顯著性差異時(shí)，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直接法測(cè)定。23（1）目前以分光光度法最為廣泛，利用340nm處吸光度的變化測(cè)定各種脫氫酶。NAD(P)++H+NAD(P)H

僅在260nm處有吸收峰

在260、340nm處有吸收峰

340nm處A的變化可以反映反應(yīng)體系中NAD(P)H量的增減，進(jìn)而反映酶活性濃度。（2）利用一類人工合成的所謂色原性底物，其本身為無色或微黃色，酶作用后生成有色化合物。24（1）在原反應(yīng)體系中加入一些試劑，其只和酶反應(yīng)物迅速作用，產(chǎn)生可被檢出的物質(zhì)，但該試劑不和酶反應(yīng)，也不影響酶的活性。SPE+試劑可被檢出的物質(zhì)（2）酶偶聯(lián)法目前應(yīng)用最多，即在原反應(yīng)體系中加入另一些酶試劑，所進(jìn)行的酶促反應(yīng)和被測(cè)酶反應(yīng)偶聯(lián)起來。25（二）酶偶聯(lián)反應(yīng)反應(yīng)模式ABPExEi被測(cè)酶被測(cè)酶始發(fā)反應(yīng)始發(fā)反應(yīng)指示反應(yīng)指示酶指示反應(yīng)指示酶ABCPExEaEi輔助酶輔助反應(yīng)酶偶聯(lián)體系輔助酶輔助反應(yīng)261.酶偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)相酶偶聯(lián)反應(yīng)一開始不能反映酶活性，在反應(yīng)中存在幾個(gè)時(shí)相。以臨床常規(guī)酶學(xué)分析中常見的ALT的檢測(cè)為例，在該酶偶聯(lián)體系中的指示酶為脫氫酶，反應(yīng)原理如下：L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸α-丙酮酸＋NADH乳酸＋NAD+ALTLDH此時(shí)反應(yīng)的方向由NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD，隨反應(yīng)進(jìn)行，A應(yīng)隨之而下降，通過檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物A在340nm處A的變化速率，可以檢測(cè)指示酶反應(yīng)。ALT雙試劑法測(cè)定中，首先使血清與缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37°C保溫5m，將樣品中所含的內(nèi)源性α-酮酸消耗完。然后再加入α-酮戊二酸啟動(dòng)ALT催化的反應(yīng)。27反應(yīng)一開始加入的試劑1中只有丙氨酸，不存在α-酮戊二酸，在此時(shí)相中，存在于樣品中的干擾物質(zhì)（內(nèi)源性α-酮酸）消耗完。加入試劑2（即α-酮戊二酸）啟動(dòng)反應(yīng)，在初始階段，產(chǎn)物α-丙酮酸開始出現(xiàn)，并逐漸增多，但處于較低水平，指示酶反應(yīng)速度也較低，不能代表待測(cè)酶的Vx。隨著產(chǎn)物α-丙酮酸增加到一定程度，Ex和Ei反應(yīng)V相同，達(dá)到穩(wěn)態(tài)期。此階段340nm處A出現(xiàn)明顯的線性變化。最后由于底物的消耗，反應(yīng)V逐漸減慢，偏離線性。P150

282.酶偶聯(lián)反應(yīng)注意事項(xiàng)(1)延滯期應(yīng)越短越好，測(cè)定時(shí)間要避開此期。(2)不是所有的酶都適合用酶偶聯(lián)法進(jìn)行測(cè)定，酶偶聯(lián)反應(yīng)V應(yīng)超過或等于Vx，Ei反應(yīng)必須是一級(jí)反應(yīng)，即指示酶反應(yīng)速率和測(cè)定酶的產(chǎn)物B濃度成正比。只有使用大量的Ei及其Km值很小時(shí)才能做到。(3)從經(jīng)濟(jì)方面考慮應(yīng)選用一些來源容易且價(jià)格便宜的酶（指示酶）制劑。(4)適當(dāng)?shù)闹甘久傅挠昧浚磸?fù)實(shí)驗(yàn)法確定，即做到酶偶聯(lián)速率不隨酶量的增加而升高，并在所選的最適條件下，指示酶偶聯(lián)反應(yīng)速率和酶活性濃度成正比。29（三）干擾因素(1)其他酶和物質(zhì)的干擾(2)酶的污染(3)非酶反應(yīng)(4)分析容器的污染(5)沉淀形成

解決方法之一可通過試劑空白管檢出并加以校正，另一個(gè)有效途徑就是不用單一試劑而改用雙試劑測(cè)定酶活性。30四、工具酶工具酶：酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性濃度的酶。指示酶和輔助酶作為反應(yīng)系統(tǒng)中的試劑。（一）工具酶（二）常用工具酶常用工具酶多為氧化還原酶類工具酶純度不必要求過高工具酶中雜質(zhì)的含量有一定的限制31（三）工具酶參與的指示反應(yīng)臨床生化檢驗(yàn)中，很多項(xiàng)目的測(cè)定往往使用有工具酶參與的類似的反應(yīng)原理－－共通（通用）反應(yīng)途徑。1.偶聯(lián)H2O2的工具酶及其指示反應(yīng)葡萄糖尿酸膽固醇甘油丙酮酸葡萄糖氧化酶尿酸氧化酶膽固醇氧化酶甘油氧化酶丙酮酸氧化酶H2O2以H（e）為受體的指示酶以NAD(P)H為輔酶參與的指示酶觸酶POD(最常用）2H2O2+4-AAP+酚

醌亞胺(紅色)+4H2OPOD32例：葡萄糖氧化酶法測(cè)定血清葡萄糖Glu＋O2＋H2OGA＋H2O2H2O2＋4-AAP＋酚H2O＋O2＋紅色醌類化合物GODPOD葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）利用O2和H2O將Glu氧化成GA，并釋放H2O2

，過氧化物酶（peroxidase，POD）在色原性氧受體存在時(shí)將H2O2分解為H2O和O2

，并將色原性氧受體4-AAP和酚去氫縮合為紅色醌類化合物，即Trinder反應(yīng)。紅色醌類化合物的量與Glu含量成正比。即POD催化下，H2O2氧化芳香族胺色素原生成有色色素，此類色素原供氫體包括：OT、DAB、ODA、TMB。332.NAD(P)+或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應(yīng)許多氧化還原反應(yīng)，尤其是作為工具酶如LD、GLD、G6PD等參與時(shí)，常將底物的H去除后傳遞給NAD(P)+形成NAD(P)H。借助NAD(P)H340nm處特征性的光吸收，借此用分光光度法檢測(cè)。如：葡萄糖、尿素、β-羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD、ICD等。例：尿素＋H2O2NH3＋CO2NH3＋α-酮戊二酸＋NADH＋H+

谷氨酸＋NAD+＋H2O尿素酶GLDP+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+

34五、血清酶活性濃度測(cè)定條件的優(yōu)化方法儀器設(shè)備試劑自動(dòng)生物化學(xué)分析儀參數(shù)設(shè)置標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存35標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存溶血：細(xì)胞內(nèi)酶而言，細(xì)胞內(nèi)外濃度差異大；所以應(yīng)及時(shí)進(jìn)行分離，靜脈采血后應(yīng)在1～2h內(nèi)分離血清。抗凝劑：利用草酸鹽、枸櫞酸鹽、EDTA抗凝的血漿一般不用作酶活性測(cè)定；肝素對(duì)ALT、AST、CK、LD、ACP檢測(cè)均無影響，可用于急診；臨床多用血清為首選測(cè)定標(biāo)本。溫度：大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定，一般在血清分離當(dāng)天測(cè)定，否則應(yīng)放冰箱冷藏；通常在0～4°C下使用、處理及保存，除了一些冷變性的酶；液氮可作為酶學(xué)測(cè)定時(shí)血清標(biāo)本及質(zhì)控長(zhǎng)期保存的方法。36六、酶活性濃度單位（一）酶活性單位慣用單位用首先報(bào)告該種酶測(cè)定方法的臨床酶學(xué)家的名字來命名其單位，即使同一種酶因方法不同而有數(shù)種活性單位，參考值差別很大。國(guó)際單位1963年，1IU＝1μmol/min（25°C

及其他最適條件下）1976年，1U＝1μmol/min（特定條件下）1979年，1Katal＝1mol/s（規(guī)定條件下），1U＝16.67nKatal37（二）酶活性濃度單位以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示；各國(guó)學(xué)者習(xí)慣用U/L表示體液中酶催化活性濃度，

1U/L=16.67nKatal/L正常上限（upperlimitsofnormal，ULN）倍數(shù)

把酶測(cè)定值轉(zhuǎn)換為正常上限值的倍數(shù)；易于比較解釋來自不同方法的結(jié)果，利于各實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)調(diào)查；可將ULN進(jìn)一步適當(dāng)分級(jí)，制定出輕度、中度及重度增加的范圍，使檢測(cè)結(jié)果更加一目了然；38（三）酶活性濃度計(jì)算

連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)酶活性濃度時(shí)，使用摩爾消光系數(shù)（ε）。其定義為：特定條件下，一定波長(zhǎng)的光，光徑為1.0cm時(shí)，通過所含吸光物質(zhì)的濃度為1.00mol/L時(shí)的吸光度。

連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化（ΔA/min）U/L＝ΔAmin×V×106ε×v×LΔA—吸光度變化106

—把mol換算成μmol

v—樣品量（ml）L

—比色杯光徑（cm）V—反應(yīng)體系體積（ml）ε—摩爾消光系數(shù)（cm2

·mol-1）39自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定同一酶，條件固定時(shí)，從理論上講V，v和L均為固定值，ε為常數(shù)，則可將公式簡(jiǎn)寫為：

U/L＝ΔAmin×KV×106ε×v×LK=K為酶活性濃度定量系數(shù)主要用于臨床酶活性測(cè)定的計(jì)算與校正K值設(shè)置應(yīng)考慮酶的參考值上限及測(cè)定時(shí)間兩方面，這些均與儀器測(cè)定的噪音有關(guān)。40第三節(jié)

酶的免疫化學(xué)測(cè)定41一、報(bào)告方式酶活性濃度單位：U/L質(zhì)量濃度單位：ng/ml，μg/L二、優(yōu)點(diǎn)靈敏度高特異性高能用于檢測(cè)一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白特別適用于同工酶的檢測(cè)樣品中其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶不受體液中其它物質(zhì)的影響酶原或去輔基酶蛋白42三、缺點(diǎn)要制備足夠量多的提純酶作為抗原和具有免疫化學(xué)性質(zhì)的抗血清步驟多，操作繁瑣測(cè)定成本高43第四節(jié)

同工酶及其亞型測(cè)定44一、概念同工酶（isoenzyme）

同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化功能，但其分子組成、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及器官分布和細(xì)胞內(nèi)定位不同的一類酶。亞型（isoform）

即指基因在編碼過程中由于翻譯后修飾的差異所形成的多種形式的一類酶，往往在基因編碼產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)釋入血漿時(shí)因肽酶作用降解而形成。45二、分析方法臨床同工酶的分析可分為兩步首先精確地分離出某酶的各同工酶組分測(cè)定酶的總活性和各同工酶或亞型組分的活性46二、分析方法（一）電泳法原理使用最為廣泛簡(jiǎn)便、快速、分離效果好、不破壞酶的天然構(gòu)象可分為：乙酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳及毛細(xì)管電泳測(cè)定步驟為：區(qū)帶分離、活性顯色和檢測(cè)結(jié)果方法同工酶氨基酸組成不同（一級(jí)結(jié)構(gòu)不同），pI不同，電泳遷移率也就不同，電泳可將其分開。47顯色染料偶氮染料四唑鹽離子型化合物，易溶于水，難溶于一般的有機(jī)試劑，利用其進(jìn)行的偶合反應(yīng)，生成不同顏色的偶氮色素進(jìn)行同工酶譜檢測(cè)受氫體作用，四唑鹽可被還原成紫紅色的formazan，常用的有：NBT、INT、MTT等。其中NBT使用最多。掃描定量光密度計(jì)熒光計(jì)P16348（二）色譜法

柱色譜法離子交換色譜親和色譜商品化微型色譜柱49（三）免疫分析法免疫抑制法免疫沉淀法其它免疫學(xué)方法

利用同工酶的一種亞基與相應(yīng)抗體結(jié)合后，酶活性受到抑制，測(cè)定加與不加抗體前后樣品中酶活性的變化

利用分離提純的同工酶作抗原制備的抗體與含該型同工酶的待測(cè)樣品混合，在一定條件下抗原抗體復(fù)合物形成沉淀，離心后測(cè)定上清液中其它型別的酶活性，將加入抗體前測(cè)得的總活性減去上清液酶活性，即可求出被沉淀的同工酶的活性。免疫電泳、RIA、EIA和CLIA50（四）動(dòng)力學(xué)分析法底物特異性分析法抑制劑分析法

pH分析法熱失活分析法（五）蛋白酶水解法51三、同工酶檢測(cè)意義提高酶診斷的特異性提高診斷的靈敏度對(duì)某些疾病的預(yù)后有評(píng)價(jià)價(jià)值有些同工酶有明顯的組織分布和細(xì)胞內(nèi)定位差異有些同工酶的變化可在總酶變化之前發(fā)生線粒體酶的測(cè)定52第五節(jié)臨床常用血清酶分析53一、轉(zhuǎn)氨酶（Aminotransferases

）及其同工酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine

aminotransferases，ALT)/谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate

aminotransferases，AST/谷草轉(zhuǎn)氨酶GOT1.催化反應(yīng)L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸L-天冬氨酸＋α-酮戊二酸α-草酰乙酸＋L-谷氨酸ALTAST兩種酶均需要磷酸吡哆醛（VitB6）為輔基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白為脫輔基酶蛋白，無催化活性。542.組織分布

ALT大量存在于肝組織，其次為腎、心、骨骼肌等。其有兩種活性同工酶，α(ALTs)、β(ALTm)，分別存在細(xì)胞質(zhì)及線粒體中。肝細(xì)胞中ALT大多存在細(xì)胞質(zhì)，少量在線粒體，肝細(xì)胞壞死時(shí)血清中以ALTs為主。

AST存在多種器官，按含量多少為心、肝、骨骼肌和腎。其有兩種同工酶ASTs、ASTm，分別存在細(xì)胞質(zhì)及線粒體中。細(xì)胞輕度損傷ASTs顯著升高，而嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)ASTm

大量出現(xiàn)于血清中。血中AST升高多來自心臟或肝臟損傷。553.標(biāo)本溶血標(biāo)本不能用于檢測(cè)

宜用血清，4℃

冰箱中可貯存1星期，活性無明顯改變。4.臨床意義

ALT是反映肝損傷的一個(gè)靈敏指標(biāo)急性肝炎早期升高，ALT>AST；

急性肝炎恢復(fù)指標(biāo)

Deritis比值可用于肝炎診斷、鑒別診斷及判斷轉(zhuǎn)歸酶膽分離是肝細(xì)胞壞死先兆56

AST主要用于肝臟疾病的診斷

AMI發(fā)病6-8h即升高，48-60h達(dá)高峰，4-5d恢復(fù)正常。由于AST在AMI時(shí)升高遲于CK，恢復(fù)早于LD，故目前診斷AMI價(jià)值不大。

急性肝炎，AST升高程度不及ALT；慢性肝炎，特別肝硬化、慢性活動(dòng)性肝炎時(shí)，AST升高程度超過ALT。57二、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyl

transpeptid,γ-GT/GGT）

1.催化反應(yīng)又稱：γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GTP/GGTP)一種含巰基的線粒體酶，可催化γ-谷氨?；鶑腉SH或其它含γ-谷氨酰基化合物中轉(zhuǎn)移至另一肽或氨基酸分子上。

GSH＋氨基酸

γ-谷氨酰氨基酸＋半胱氨酰甘氨酸GGT58

2.組織分布

腎臟中含量最多，其次為胰、肺、肝等。血清中的GGT主要來自肝膽。

3.標(biāo)本

GGT較穩(wěn)定，室溫下可放置2d，

4℃可存放1w，

-20℃可儲(chǔ)存1y；RBC中幾乎無GGT，因此溶血標(biāo)本可以檢測(cè)。594.臨床意義

有助肝膽疾病的鑒別診斷與ALP聯(lián)合進(jìn)行肝臟疾病檢測(cè)膽道疾病，GGT陽性率高，而且升高明顯，可高達(dá)5-30ULN，肝實(shí)質(zhì)疾病是GGT一般只是中度升高，可達(dá)2-5ULN。若ALP升高而GGT正常，則完全排除ALP的肝來源，若ALP和GGT都增加，則應(yīng)先排除肝外引起GGT增加的原因，一旦排除，則GGT增高為肝病所致。(1)肝膽疾病檢出陽性率最高的酶

(2)用于判斷惡性腫瘤有無肝轉(zhuǎn)移

(3)乙醇、巴比妥類藥物等可誘導(dǎo)GGT的升高。P168

60三、肌酸激酶及其同工酶和亞型肌酸激酶（creatine

kinase，CK）1.催化反應(yīng)

CK催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之間的磷酸轉(zhuǎn)移的可逆性反應(yīng)，所產(chǎn)生的磷酸肌酸含高能磷酸鍵，是肌肉收縮時(shí)能量的直接來源。

磷酸肌酸＋ADP肌酸＋ATPCK612.組織分布

廣泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦。CK由兩種不同亞基（M，B）組成的二聚體，細(xì)胞質(zhì)中存在三種同工酶：CK-BB(CK1)、CK-MB(CK2)、CK-MM(CK3)，線粒體中存在CK-Mt(CK4)，其電泳速率最慢。

CK同工酶又可分為不同亞型，CK-MM有三種亞型，CK-MM1，CK-MM2，CK-MM3，電泳速率依次減慢；CK-MB有CK-MB2和CK-MB1兩種亞型。3.標(biāo)本

不得用溶血標(biāo)本，RBC中含有AK，可干擾測(cè)定，引起測(cè)定值偏高；測(cè)定樣品宜用血清或肝素抗凝血漿，其它抗凝劑都抑制CK活性。62

4.臨床意義

CK及其同工酶和亞型是目前臨床上測(cè)定次數(shù)最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和腦疾患的診斷。

(1)AMI的早期診斷總CK在AMI診斷中意義不大CK-MB為診斷AMI的金指標(biāo)CK-MM3/CK-MM1>1.0為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)（排除急性骨骼肌損傷）CK-MB2>1.9U/L或CK-MB2/CK-MB1>1.5為診斷AMI的標(biāo)準(zhǔn)之一

(2)全身疾病特別是肌肉疾病時(shí)，CK極度升高63四、乳酸脫氫酶及其同工酶和亞型乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LD/LDH）

1.催化反應(yīng)

LD催化乳酸氧化成丙酮酸，同時(shí)將氫轉(zhuǎn)移給輔酶而成為NADH，依條件不同而有可逆性。

L-乳酸＋NAD+

丙酮酸＋NADH＋H+pH8.8～9.8Ph7.4～7.864

2.組織分布

LD是一種含鋅的糖酵解酶，廣泛存在于人體各組織中，以肝、心肌、腎、肌肉、RBC含量最高。

LD是由兩種不同亞基（M和H）組成的四聚體，形成5種結(jié)構(gòu)不同的同工酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和LD5(M4)。

1.以LD1為主，主要在心肌，可占總LD活性50％以上，也存在于RBC內(nèi)；

2.以LD5為主，以橫紋肌為代表，肝臟中也有；

3.以LD3為主，存在于脾肺。一般成年人血中LD同工酶存在如下規(guī)律：LD2>LD1>LD3>LD4>LD5，部分正常兒童血中可見LD1>LD2。653.標(biāo)本

一般用血清，用血漿需離心去除血小板（血小板中含有大量的LD），采血后迅速分離血清；因RBC中LD含量比血清高100倍以上，不宜用溶血標(biāo)本。

LD4、LD5宜冷變性，不應(yīng)放在冰箱中，25℃放2-3d，LD活性變化不大。664.臨床意義

亞急性心肌梗死診斷有一定價(jià)值，但其特異性差；

(1)診斷心臟疾病

心肌梗死和心肌炎時(shí)以LD1和LD2升高為主，大多數(shù)AMI患者血中會(huì)出現(xiàn)“反轉(zhuǎn)比率”，即LD1>LD2；

(2)診斷肝臟疾病

肝細(xì)胞損傷時(shí)常出現(xiàn)LD5>LD4;

急性肝炎時(shí)LD1LD2相對(duì)下降，LD5升高；慢性肝炎時(shí)LD5升高，且LD1<LD3；肝硬化時(shí)為L(zhǎng)D2下降和LD5升高；肝癌時(shí)LD5升高，但LD1>LD3；

(3)診斷骨骼肌疾病

骨骼肌損傷時(shí)常出現(xiàn)LD5>LD4;67五、堿性磷酸酶及其同工酶堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP/AKP）1.催化反應(yīng)一種含鋅的糖蛋白，在堿性環(huán)境中（pH10.0）可以水解各種天然及人工合成的磷酸單酯化合物。2.組織分布

ALP廣泛存在于各組織器官中，其含量以肝臟為最多，其次為腎、胎盤、小腸和骨骼等。血清中的ALP主要來自肝臟和骨骼。

生長(zhǎng)期兒童血清內(nèi)ALP主要來自成骨母細(xì)胞和生長(zhǎng)中的骨軟骨細(xì)胞，少量來自肝。68

3.標(biāo)本

空腹采血，避免脂肪餐的影響；樣品用血清，不能用明顯溶血標(biāo)本；在室溫或冰箱放置，活性逐漸升高，可增加5-10％，應(yīng)在采血當(dāng)日測(cè)定。

4.臨床意義很多骨骼疾病如變形性骨炎等患者血中ALP升高，我國(guó)常用于早期診斷佝僂病和軟骨病。

(1)診斷骨骼性疾病

(2)診斷肝膽系統(tǒng)疾病，尤其是黃疸急性肝炎時(shí)ALP增高達(dá)2-5ULN，肝硬化、膽石癥和腫瘤引起的膽汁淤積，ALP增高達(dá)5-20ULN。90％以上肝外膽道阻塞患者血清ALP升高，升高程度和阻塞程度、病變程度成正比。69六、酸性磷酸酶及其同工酶酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）1.催化反應(yīng)作用類似ALP的磷酸酶（最適pH在7.0以下）

2.組織分布

ACP存在于人體不同組織，如前列腺、紅細(xì)胞、血小板、腎