第五章 衛(wèi)生指標(biāo)菌的檢測(cè)OK

第五章衛(wèi)生指標(biāo)細(xì)菌的檢驗(yàn)

1/13/20231第一節(jié)食品中菌落總數(shù)的測(cè)定1/13/20232一、菌落總數(shù)概念：是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后,單位質(zhì)量（g）、容積（mL）或表面積（cm2）內(nèi)所形成的好氧或兼性厭氧細(xì)菌菌落的總數(shù)。

是活菌計(jì)數(shù)，需氧菌數(shù)；不代表實(shí)際所有的細(xì)菌總數(shù)。1/13/20233二、菌落總數(shù)測(cè)定的意義1、判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。2、了解細(xì)菌在食品中的繁殖動(dòng)態(tài)。3、預(yù)測(cè)食品貯藏期限的長(zhǎng)短。1/13/20234三、菌落總數(shù)測(cè)定的方法※平板傾注法＃平板表面涂布法平板表面點(diǎn)滴法1/13/20235四、平板傾注法測(cè)定菌落總數(shù)

GB4789.2-2010原理：樣品經(jīng)過稀釋后，使樣品懸液中的細(xì)菌分期存在，接種一定量（一般為1mL）到培養(yǎng)基中，再加入適量的培養(yǎng)基，充分混勻。從理論上講，微生物在培養(yǎng)基中分散呈單個(gè)存在，一個(gè)菌體長(zhǎng)出一個(gè)肉眼可見的菌落。1/13/20236檢驗(yàn)步驟(程序)：1/13/20237（一）樣品稀釋及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入46℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂15~20mL25g/ml樣品生理鹽水1/13/20238（一）樣品稀釋及做平板1/13/20239

檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。

1/13/202310（二）培養(yǎng)倒放平板普通食品：36℃±1℃48h±2h水產(chǎn)品:30℃±1℃72h±3h如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的平板計(jì)數(shù)瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按上步條件進(jìn)行培養(yǎng)。1/13/202311（三）計(jì)數(shù)和報(bào)告

到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0~4℃，但不得超過24h。1/13/2023121、菌落的選擇（1）單個(gè)菌做一個(gè)菌落計(jì)（2）呈鏈狀生長(zhǎng)的菌落之間無(wú)任何明顯界限，作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不同來(lái)源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算。（3）如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。1/13/2023132、平板菌落計(jì)數(shù)的選擇(1)

選取菌落數(shù)在30～300之間的平板（SN標(biāo)準(zhǔn)要求為25～250個(gè)菌落）若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1）計(jì)算：1/13/202314式中：N——樣品中菌落數(shù)；ΣC——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。1/13/202315注意：舊版標(biāo)準(zhǔn)的做法為：比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字1/13/202316（2）如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（3）如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告（4）如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，不在30～300之間，以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（5）如所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。

1/13/2023173、菌落數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)在1～100時(shí)，按“四舍五入”原則，以整數(shù)報(bào)告；如大于100時(shí)，則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算。固體檢樣以克（g）為單位報(bào)告，CFU/g;液體檢樣以毫升（mL）為單位報(bào)告，CFU/mL;表面涂擦則以平方厘米（cm2）報(bào)告，CFU/cm2;。

1/13/2023181/13/202319(四)檢驗(yàn)注意事項(xiàng)1、對(duì)照平板出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí)，要追加對(duì)照平板；2、吸管進(jìn)出瓶子或試管時(shí)，吸管口不得觸及瓶口、管口的外圍部分；3、吸管插入試樣液內(nèi)的深度不得小于2.5cm,調(diào)整時(shí)要使管尖與容器內(nèi)壁緊貼;4、進(jìn)行稀釋時(shí),吸管口不得與稀釋液接觸;5、檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min.1/13/2023206、為防止細(xì)菌增殖產(chǎn)生片狀菌落，在檢液加入平皿后，應(yīng)在20min傾入瓊脂，并立即使之與瓊脂混合均勻。(在平面上先左右搖動(dòng)，后順時(shí)針和逆時(shí)間旋轉(zhuǎn))7、加入平皿內(nèi)的檢樣稀釋液有時(shí)帶有檢樣顆粒，需加做平皿放在4℃的環(huán)境中，以便計(jì)數(shù)時(shí)排除顆粒的影響。8、稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，不可作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。(四)檢驗(yàn)注意事項(xiàng)1/13/202321復(fù)習(xí)題1、什么是菌落總數(shù)？2、測(cè)定食品、飲料等產(chǎn)品的菌落總數(shù)有什么意義？3、畫出平板傾注法測(cè)定菌落總數(shù)的示意圖。4、在測(cè)定菌落總數(shù)時(shí)，如何選擇菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)？5、在菌落總數(shù)的檢驗(yàn)中，要注意哪些事項(xiàng)？6、在菌落總數(shù)的檢驗(yàn)中，如何根據(jù)樣品的特性選擇培養(yǎng)溫度和時(shí)間？1/13/202322第二節(jié)食品中大腸菌群的檢驗(yàn)1/13/202323一、大腸菌群

1、

什么是大腸菌群？

指一群在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧及兼性厭氧的革蘭氏染色陰性無(wú)芽胞桿菌。2、大腸菌群的組成:大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬(又叫產(chǎn)氣桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌)、克雷伯氏菌屬的一部分和沙門氏菌屬的第III亞屬。1/13/202324屬代表種致病性埃希氏菌屬（Escherichia）大腸埃希氏菌(E.coli)

腸道外感染，急性腹瀉志賀氏菌屬（Shigella）痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)細(xì)菌性痢疾愛德華氏菌屬（Edwardsiella）遲純愛德華氏菌(E.tarda)蛇類等血?jiǎng)游锏恼Ｄc道寄居菌，偶見于健康人或腹瀉者糞便內(nèi)沙門氏菌屬（Salmonella）傷寒沙門氏菌(S.typhi)腸熱癥、急性腸炎、敗血癥枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)弗勞地氏枸櫞酸桿菌(C.freundii)條件致病菌，引起繼發(fā)性感染克雷伯氏菌屬(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系、創(chuàng)傷感染敗血癥等陰溝腸桿菌(Enterobacter)產(chǎn)氣桿菌(E.aerogenes)很少引起原發(fā)性感染哈夫尼亞菌屬(Hafnia)蜂窩啥夫尼亞菌(H.alvei)

對(duì)人無(wú)致病性沙雷氏菌屬(Serrati)粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcescens)條件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及創(chuàng)傷感染變形桿菌屬(Proteus)普通變形桿菌(P.vulgaris)食物中毒，泌尿系、呼吸道感染等耶爾森氏菌屬(Yersinia)

鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)鼠疫歐文氏菌屬(Erwinia)草原居民歐文氏菌(E.herbicola)

植物寄生菌，曾從人體腸道及化膿扁桃體中分離到1/13/2023251、糞便污染的指標(biāo)菌：可作為糞便污染的指標(biāo)有：大腸桿菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌；大腸桿菌更適合作為指標(biāo)菌，但該菌群可因環(huán)境而導(dǎo)致菌型的改變；大腸桿菌檢驗(yàn)方法繁雜，且并不確切；大腸菌群是更合適的指標(biāo)菌。二、大腸菌群檢驗(yàn)的衛(wèi)生學(xué)意義1/13/2023262、以大腸菌群作為糞便指標(biāo)菌原因在糞便中數(shù)量最大；在外環(huán)境中存活的時(shí)間與致病菌大體相同；檢測(cè)方法簡(jiǎn)便容易。二、大腸菌群檢驗(yàn)的衛(wèi)生學(xué)意義1/13/202327（1）判斷食品中否受到糞便污染。（2）有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行。（3）有利于控制食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況。3、大腸菌群檢驗(yàn)的意義二、大腸菌群檢驗(yàn)的衛(wèi)生學(xué)意義1/13/202328三、大腸菌群的生物學(xué)特性1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無(wú)芽胞桿菌。2.發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣

3.培養(yǎng)特性：在EMB瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤；在麥康凱瓊脂上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤(rùn)。1/13/202329EMB平板照片及原理呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤1/13/202330麥康凱瓊脂平板Ageofcultureis24h呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤(rùn)1/13/202331四、大腸菌群檢驗(yàn)方法及操作方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(2003版)：三步法：乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)→分離培養(yǎng)→證實(shí)試驗(yàn)(乳糖發(fā)酵試驗(yàn))

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：兩步法：推測(cè)試驗(yàn)→證實(shí)試驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(2010版)：兩步法：LST發(fā)酵→BGLB復(fù)發(fā)酵1/13/202332GB4789.3-2010月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯1/13/202333大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑膽鹽、洗衣粉、SDS、煌綠、結(jié)晶紫、孔雀綠等。我國(guó)常用膽鹽作為抑菌劑，豬、牛、羊3種膽鹽檢驗(yàn)效果無(wú)差別。3號(hào)膽鹽、混合膽鹽、去氧膽酸鈉、兔膽鹽會(huì)影響大腸菌群的檢驗(yàn)結(jié)果。用量、品牌、規(guī)格會(huì)影響結(jié)果。1/13/202334MPN法簡(jiǎn)介TheMostProbableNumberMethod1/13/2023351/13/202336檢樣稀釋處理EMB等革蘭氏染色乳糖發(fā)酵管革蘭氏陰性無(wú)芽胞產(chǎn)氣革蘭氏陽(yáng)性大腸桿菌陰性大腸桿菌陰性報(bào)告不產(chǎn)氣乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸桿菌陰性報(bào)告報(bào)告報(bào)告大腸桿菌陽(yáng)性三步法簡(jiǎn)介1/13/2023371:1001:10各加入1ml各加入10ml各加入1ml單料乳糖膽鹽發(fā)酵管單料乳糖膽鹽發(fā)酵管雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管初發(fā)酵檢樣稀釋檢樣量1g/ml檢樣量0.1g/ml檢樣量0.01g/mlEMB分離培養(yǎng)證實(shí)試驗(yàn)乳糖發(fā)酵管鏡檢查MPN表報(bào)告結(jié)果1/13/202338第三節(jié)糞大腸菌群的檢驗(yàn)糞大腸菌群：是大腸菌群的一種，又稱為耐熱大腸菌群，是指一群需氧及兼性厭氧，在44.5℃培養(yǎng)24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣和分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。1/13/202339表1糞大腸菌群在幾種常用分離培養(yǎng)上的菌落特征培養(yǎng)基菌落特征伊紅蘭培養(yǎng)基(EMB)紫黑色、有金屬光澤，紫黑色、不帶或略帶光澤，淡紫紅色、中心紫黑色、黑紅或深紫紅色品紅亞硫酸納(遠(yuǎn)藤氏平板)紫紅色、有金屬光澤，深紅色、不帶或略帶金屬光澤，淡紅色、中心較深中國(guó)蘭平板深藍(lán)色，淺藍(lán)色、中心深藍(lán)色麥康凱平板(MacC)桃紅色，粉紅色、中心桃紅色1/13/202340糞大腸菌群檢驗(yàn)程序1/13/2023411/13/2023421、從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。2、對(duì)產(chǎn)酸但未看到氣泡的乳糖發(fā)酵，用手輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。

3、不可用其他膽鹽代替指定的膽鹽。六、檢驗(yàn)注意事項(xiàng)1/13/202343第四節(jié)食品中大腸桿菌計(jì)數(shù)大腸桿菌（Escherichiacoli），學(xué)名大腸埃希氏菌，被歸為腸桿菌科，屬于埃希氏菌屬，革蘭氏陰性短桿菌，能在44.5℃發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，IMViC生化試驗(yàn)為++--，或?yàn)?+--。1/13/202344大腸桿菌檢驗(yàn)的衛(wèi)生學(xué)意義多數(shù)為腸道正常菌群，并產(chǎn)生有益的作用；直到20世紀(jì)中葉，才認(rèn)識(shí)到一些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性，它們能引起食物中毒，統(tǒng)稱為致病性大腸桿菌；大腸桿菌學(xué)用作受糞便污染的重要指標(biāo)；存活時(shí)間與一些常見的腸道病原菌接近，它們的出現(xiàn)可能預(yù)示首某些腸道疾病的病原菌存在，如志賀氏菌、沙門氏菌等。1/13/202345檢驗(yàn)程序：靛基質(zhì)(I)、甲基紅(M)、VP(Vi)、檸檬酸鹽(C)++---+--1/13/2023461/13/202347復(fù)習(xí)題1、什么是大腸菌群？大腸菌群由哪些微生物組成？2、測(cè)定食品、飲料等產(chǎn)品的大腸菌群數(shù)有什么意義？3、大腸菌群具有哪些生物學(xué)特性？4、在大腸菌群數(shù)的檢驗(yàn)中，要注意哪些事項(xiàng)？5、在水的大腸菌群數(shù)檢驗(yàn)中，如何進(jìn)行水樣的采集？1/13/202348第五節(jié)大腸菌群快速檢驗(yàn)食品大腸菌群快速檢驗(yàn)方法：LTSE法TTC顯色法；DC試管法；紙片法。1/13/202349(一)LTSE法LTSE培養(yǎng)基(Lactose-Tryptone-SodiumDodecylsulfate-TraceElements，LTSE)：P180原理：不同細(xì)菌以不同的途徑分解糖類，在其代謝過程中產(chǎn)生了丙酮酸及轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N酸類，大腸菌群能分解乳糖，由于具有甲酸解氫酶作用于甲酸，產(chǎn)生H2和CO2氣體，因此氣體的產(chǎn)生是在產(chǎn)酸的同時(shí)進(jìn)一步分解酸而形成的。據(jù)次將樣品接種到LTSE培養(yǎng)基肉湯內(nèi)15h，觀察有無(wú)氣體產(chǎn)生，然后加氧化酶試驗(yàn)和涂片革蘭色鏡檢結(jié)果綜合判斷是否有大腸菌群的存在。

1/13/202350LTSE檢驗(yàn)程序P1781/13/202351(二)TTC法

(氯化三苯四氮唑快速顯色法)P1811/13/202352（三）DC法

(去氧膽酸鈉半固體法)P183~1851/13/202353（四）紙片法P185~1861/13/202354（一）食品飲料大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片

使用方法：1.樣品稀釋同國(guó)標(biāo)法2.接種：飲料和飲用水采用原液、1:10、1:100三個(gè)稀釋度，固體食品采用1:1、1:10和1:100三個(gè)稀釋度。用1mL滅菌吸管吸取1mL同一稀釋度的稀釋液均勻涂布到袋中的紙片上，做三個(gè)重復(fù)。1/13/2023553.培養(yǎng)：將接種好的紙片輕輕壓平（可疊放），在36℃下培養(yǎng)15－24h觀察結(jié)果。4.結(jié)果判定:紙片上出現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn),其周圍有黃圈者,為陽(yáng)性.紙片為一種著色,無(wú)菌落生長(zhǎng)者為陰性.紙片呈紫蘭色,有紫紅色斑點(diǎn)，其周圍地黃圈者陰性.酸性食品接種后,紙片變黃,經(jīng)培養(yǎng)后無(wú)紫紅色斑點(diǎn)為陰性1/13/202356（二）餐具大腸菌群快速檢驗(yàn)(紙片法)使用方法：1.

采樣6—10份。碗、盤、杯等每份貼紙片兩張，用無(wú)菌生理鹽水濕潤(rùn)紙片后，立即貼于食具內(nèi)側(cè)表面，30s后取下，置于原塑料袋內(nèi)?？曜右?只為一份樣品，用吸管吸取生理鹽水濕潤(rùn)紙片后，立即將筷子進(jìn)口端（約5cm）抹拭兩張，放入原塑料袋內(nèi)。1/13/2023572.將已采樣的紙樣置于37°C培養(yǎng)15h.紙片在黃色背景上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)為陽(yáng)性，紙片在紫蘭色背景上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，但周圍沒有黃暈均為大腸菌群陰性。同一份樣品兩張紙片均是陰性為合格。1/13/202358食品冷飲大腸菌群檢驗(yàn)紙片

冷飲、乳制品和調(diào)味品等大腸菌群的測(cè)定1/13/202359食品飲料大腸菌群快速檢驗(yàn)紙片

飲料、食用純水和糕點(diǎn)的大腸菌群測(cè)定1/13/202360餐具大腸菌快速檢驗(yàn)紙片

餐具衛(wèi)生消毒效果檢測(cè)1/13/202361大腸菌群測(cè)試片

適用于需要對(duì)大腸菌群準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的樣品，如消毒牛乳、冷飲和調(diào)味品等。

1/13/202362實(shí)例：水的大腸菌群檢驗(yàn)大腸菌群MPN/100mL細(xì)菌總數(shù)CFU/mL

生活飲用水

≤3/L＜100

瓶裝飲用純凈水

≤3

≤20

飲用天然礦泉水罐裝產(chǎn)品0＜50地面水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

＜10000個(gè)/L

準(zhǔn)備加氯消毒后供飲用的水≤1000準(zhǔn)備加氯消毒后供飲用的水≤10000游泳池水≤100＜10001/13/202363（一）、水樣的采集

1、自來(lái)水（未含氯）：龍頭火燒滅菌，暢流5—10′后取樣。2、地面水源水：江湖河，水庫(kù)，水池等。浸入水下20cm下取樣。水井50cm下取樣。3、漂白粉處理的水樣：自來(lái)水，游泳池水，應(yīng)在瓶?jī)?nèi)加入0.03g硫代硫酸鈉/500ml，或2ml1.5%硫代硫酸鈉液/500ml，除氯。4、運(yùn)送：2小時(shí)內(nèi)送到檢驗(yàn)室。6—10℃，<6h,立即檢驗(yàn).5、檢驗(yàn)前：將水樣振搖5—10分鐘。1/13/202364（二）、生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗(yàn)（大腸菌群）

各加10ml各加100ml水樣初發(fā)酵三料乳糖膽鹽50毫升裝三料乳糖膽鹽5毫升裝EMB分離36℃培養(yǎng)24h復(fù)發(fā)酵乳糖發(fā)酵鏡檢36℃培養(yǎng)24