第五章 衛(wèi)生指標菌的檢測OK

第五章衛(wèi)生指標細菌的檢驗

1/13/20231第一節(jié)食品中菌落總數(shù)的測定1/13/20232一、菌落總數(shù)概念：是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后,單位質量（g）、容積（mL）或表面積（cm2）內所形成的好氧或兼性厭氧細菌菌落的總數(shù)。

是活菌計數(shù)，需氧菌數(shù)；不代表實際所有的細菌總數(shù)。1/13/20233二、菌落總數(shù)測定的意義1、判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質量。2、了解細菌在食品中的繁殖動態(tài)。3、預測食品貯藏期限的長短。1/13/20234三、菌落總數(shù)測定的方法※平板傾注法＃平板表面涂布法平板表面點滴法1/13/20235四、平板傾注法測定菌落總數(shù)

GB4789.2-2010原理：樣品經(jīng)過稀釋后，使樣品懸液中的細菌分期存在，接種一定量（一般為1mL）到培養(yǎng)基中，再加入適量的培養(yǎng)基，充分混勻。從理論上講，微生物在培養(yǎng)基中分散呈單個存在，一個菌體長出一個肉眼可見的菌落。1/13/20236檢驗步驟(程序)：1/13/20237（一）樣品稀釋及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入46℃營養(yǎng)瓊脂15~20mL25g/ml樣品生理鹽水1/13/20238（一）樣品稀釋及做平板1/13/20239

檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。

1/13/202310（二）培養(yǎng)倒放平板普通食品：36℃±1℃48h±2h水產品:30℃±1℃72h±3h如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的平板計數(shù)瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉平板，按上步條件進行培養(yǎng)。1/13/202311（三）計數(shù)和報告

到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應將平板放置于0~4℃，但不得超過24h。1/13/2023121、菌落的選擇（1）單個菌做一個菌落計（2）呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算。（3）如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。1/13/2023132、平板菌落計數(shù)的選擇(1)

選取菌落數(shù)在30～300之間的平板（SN標準要求為25～250個菌落）若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結果。若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內時，按公式（1）計算：1/13/202314式中：N——樣品中菌落數(shù)；ΣC——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。1/13/202315注意：舊版標準的做法為：比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字1/13/202316（2）如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（3）如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告（4）如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，不在30～300之間，以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告（5）如所有稀釋度均無菌落生長，則應按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。

1/13/2023173、菌落數(shù)的報告菌落數(shù)在1～100時，按“四舍五入”原則，以整數(shù)報告；如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。固體檢樣以克（g）為單位報告，CFU/g;液體檢樣以毫升（mL）為單位報告，CFU/mL;表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告，CFU/cm2;。

1/13/2023181/13/202319(四)檢驗注意事項1、對照平板出現(xiàn)幾個菌落時，要追加對照平板；2、吸管進出瓶子或試管時，吸管口不得觸及瓶口、管口的外圍部分；3、吸管插入試樣液內的深度不得小于2.5cm,調整時要使管尖與容器內壁緊貼;4、進行稀釋時,吸管口不得與稀釋液接觸;5、檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min.1/13/2023206、為防止細菌增殖產生片狀菌落，在檢液加入平皿后，應在20min傾入瓊脂，并立即使之與瓊脂混合均勻。(在平面上先左右搖動，后順時針和逆時間旋轉)7、加入平皿內的檢樣稀釋液有時帶有檢樣顆粒，需加做平皿放在4℃的環(huán)境中，以便計數(shù)時排除顆粒的影響。8、稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，不可作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。(四)檢驗注意事項1/13/202321復習題1、什么是菌落總數(shù)？2、測定食品、飲料等產品的菌落總數(shù)有什么意義？3、畫出平板傾注法測定菌落總數(shù)的示意圖。4、在測定菌落總數(shù)時，如何選擇菌落進行計數(shù)？5、在菌落總數(shù)的檢驗中，要注意哪些事項？6、在菌落總數(shù)的檢驗中，如何根據(jù)樣品的特性選擇培養(yǎng)溫度和時間？1/13/202322第二節(jié)食品中大腸菌群的檢驗1/13/202323一、大腸菌群

1、

什么是大腸菌群？

指一群在37℃能分解乳糖產酸、產氣，需氧及兼性厭氧的革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌。2、大腸菌群的組成:大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬(又叫產氣桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產氣腸桿菌)、克雷伯氏菌屬的一部分和沙門氏菌屬的第III亞屬。1/13/202324屬代表種致病性埃希氏菌屬（Escherichia）大腸埃希氏菌(E.coli)

腸道外感染，急性腹瀉志賀氏菌屬（Shigella）痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)細菌性痢疾愛德華氏菌屬（Edwardsiella）遲純愛德華氏菌(E.tarda)蛇類等血動物的正常腸道寄居菌，偶見于健康人或腹瀉者糞便內沙門氏菌屬（Salmonella）傷寒沙門氏菌(S.typhi)腸熱癥、急性腸炎、敗血癥枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)弗勞地氏枸櫞酸桿菌(C.freundii)條件致病菌，引起繼發(fā)性感染克雷伯氏菌屬(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系、創(chuàng)傷感染敗血癥等陰溝腸桿菌(Enterobacter)產氣桿菌(E.aerogenes)很少引起原發(fā)性感染哈夫尼亞菌屬(Hafnia)蜂窩啥夫尼亞菌(H.alvei)

對人無致病性沙雷氏菌屬(Serrati)粘質沙雷氏菌(S.marcescens)條件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及創(chuàng)傷感染變形桿菌屬(Proteus)普通變形桿菌(P.vulgaris)食物中毒，泌尿系、呼吸道感染等耶爾森氏菌屬(Yersinia)

鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)鼠疫歐文氏菌屬(Erwinia)草原居民歐文氏菌(E.herbicola)

植物寄生菌，曾從人體腸道及化膿扁桃體中分離到1/13/2023251、糞便污染的指標菌：可作為糞便污染的指標有：大腸桿菌、糞鏈球菌、產氣莢膜梭菌；大腸桿菌更適合作為指標菌，但該菌群可因環(huán)境而導致菌型的改變；大腸桿菌檢驗方法繁雜，且并不確切；大腸菌群是更合適的指標菌。二、大腸菌群檢驗的衛(wèi)生學意義1/13/2023262、以大腸菌群作為糞便指標菌原因在糞便中數(shù)量最大；在外環(huán)境中存活的時間與致病菌大體相同；檢測方法簡便容易。二、大腸菌群檢驗的衛(wèi)生學意義1/13/202327（1）判斷食品中否受到糞便污染。（2）有利于控制腸道傳染病的發(fā)生和流行。（3）有利于控制食品在生產加工、運輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況。3、大腸菌群檢驗的意義二、大腸菌群檢驗的衛(wèi)生學意義1/13/202328三、大腸菌群的生物學特性1.形態(tài)與染色：革蘭氏染色陰性，無芽胞桿菌。2.發(fā)酵乳糖產酸產氣

3.培養(yǎng)特性：在EMB瓊脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤；在麥康凱瓊脂上的典型菌落:呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤。1/13/202329EMB平板照片及原理呈深紫黑色或中心深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，常有金屬光澤1/13/202330麥康凱瓊脂平板Ageofcultureis24h呈桃紅色或中心桃紅、圓形，扁平，光滑濕潤1/13/202331四、大腸菌群檢驗方法及操作方法國家標準(2003版)：三步法：乳糖膽鹽發(fā)酵試驗→分離培養(yǎng)→證實試驗(乳糖發(fā)酵試驗)

行業(yè)標準：兩步法：推測試驗→證實試驗國家標準(2010版)：兩步法：LST發(fā)酵→BGLB復發(fā)酵1/13/202332GB4789.3-2010月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯1/13/202333大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑膽鹽、洗衣粉、SDS、煌綠、結晶紫、孔雀綠等。我國常用膽鹽作為抑菌劑，豬、牛、羊3種膽鹽檢驗效果無差別。3號膽鹽、混合膽鹽、去氧膽酸鈉、兔膽鹽會影響大腸菌群的檢驗結果。用量、品牌、規(guī)格會影響結果。1/13/202334MPN法簡介TheMostProbableNumberMethod1/13/2023351/13/202336檢樣稀釋處理EMB等革蘭氏染色乳糖發(fā)酵管革蘭氏陰性無芽胞產氣革蘭氏陽性大腸桿菌陰性大腸桿菌陰性報告不產氣乳糖膽鹽發(fā)酵管產氣不產氣大腸桿菌陰性報告報告報告大腸桿菌陽性三步法簡介1/13/2023371:1001:10各加入1ml各加入10ml各加入1ml單料乳糖膽鹽發(fā)酵管單料乳糖膽鹽發(fā)酵管雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管初發(fā)酵檢樣稀釋檢樣量1g/ml檢樣量0.1g/ml檢樣量0.01g/mlEMB分離培養(yǎng)證實試驗乳糖發(fā)酵管鏡檢查MPN表報告結果1/13/202338第三節(jié)糞大腸菌群的檢驗糞大腸菌群：是大腸菌群的一種，又稱為耐熱大腸菌群，是指一群需氧及兼性厭氧，在44.5℃培養(yǎng)24h內能發(fā)酵乳糖產酸產氣和分解色氨酸產生靛基質的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。1/13/202339表1糞大腸菌群在幾種常用分離培養(yǎng)上的菌落特征培養(yǎng)基菌落特征伊紅蘭培養(yǎng)基(EMB)紫黑色、有金屬光澤，紫黑色、不帶或略帶光澤，淡紫紅色、中心紫黑色、黑紅或深紫紅色品紅亞硫酸納(遠藤氏平板)紫紅色、有金屬光澤，深紅色、不帶或略帶金屬光澤，淡紅色、中心較深中國蘭平板深藍色，淺藍色、中心深藍色麥康凱平板(MacC)桃紅色，粉紅色、中心桃紅色1/13/202340糞大腸菌群檢驗程序1/13/2023411/13/2023421、從制備樣品勻液至稀釋完畢,全過程不得超過15min。2、對產酸但未看到氣泡的乳糖發(fā)酵，用手輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，應考慮可能有氣體產生，應作進一步試驗。

3、不可用其他膽鹽代替指定的膽鹽。六、檢驗注意事項1/13/202343第四節(jié)食品中大腸桿菌計數(shù)大腸桿菌（Escherichiacoli），學名大腸埃希氏菌，被歸為腸桿菌科，屬于埃希氏菌屬，革蘭氏陰性短桿菌，能在44.5℃發(fā)酵乳糖、產酸、產氣，IMViC生化試驗為++--，或為-+--。1/13/202344大腸桿菌檢驗的衛(wèi)生學意義多數(shù)為腸道正常菌群，并產生有益的作用；直到20世紀中葉，才認識到一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有致病性，它們能引起食物中毒，統(tǒng)稱為致病性大腸桿菌；大腸桿菌學用作受糞便污染的重要指標；存活時間與一些常見的腸道病原菌接近，它們的出現(xiàn)可能預示首某些腸道疾病的病原菌存在，如志賀氏菌、沙門氏菌等。1/13/202345檢驗程序：靛基質(I)、甲基紅(M)、VP(Vi)、檸檬酸鹽(C)++---+--1/13/2023461/13/202347復習題1、什么是大腸菌群？大腸菌群由哪些微生物組成？2、測定食品、飲料等產品的大腸菌群數(shù)有什么意義？3、大腸菌群具有哪些生物學特性？4、在大腸菌群數(shù)的檢驗中，要注意哪些事項？5、在水的大腸菌群數(shù)檢驗中，如何進行水樣的采集？1/13/202348第五節(jié)大腸菌群快速檢驗食品大腸菌群快速檢驗方法：LTSE法TTC顯色法；DC試管法；紙片法。1/13/202349(一)LTSE法LTSE培養(yǎng)基(Lactose-Tryptone-SodiumDodecylsulfate-TraceElements，LTSE)：P180原理：不同細菌以不同的途徑分解糖類，在其代謝過程中產生了丙酮酸及轉變?yōu)楦鞣N酸類，大腸菌群能分解乳糖，由于具有甲酸解氫酶作用于甲酸，產生H2和CO2氣體，因此氣體的產生是在產酸的同時進一步分解酸而形成的。據(jù)次將樣品接種到LTSE培養(yǎng)基肉湯內15h，觀察有無氣體產生，然后加氧化酶試驗和涂片革蘭色鏡檢結果綜合判斷是否有大腸菌群的存在。

1/13/202350LTSE檢驗程序P1781/13/202351(二)TTC法

(氯化三苯四氮唑快速顯色法)P1811/13/202352（三）DC法

(去氧膽酸鈉半固體法)P183~1851/13/202353（四）紙片法P185~1861/13/202354（一）食品飲料大腸菌群快速檢驗紙片

使用方法：1.樣品稀釋同國標法2.接種：飲料和飲用水采用原液、1:10、1:100三個稀釋度，固體食品采用1:1、1:10和1:100三個稀釋度。用1mL滅菌吸管吸取1mL同一稀釋度的稀釋液均勻涂布到袋中的紙片上，做三個重復。1/13/2023553.培養(yǎng)：將接種好的紙片輕輕壓平（可疊放），在36℃下培養(yǎng)15－24h觀察結果。4.結果判定:紙片上出現(xiàn)紫紅色斑點,其周圍有黃圈者,為陽性.紙片為一種著色,無菌落生長者為陰性.紙片呈紫蘭色,有紫紅色斑點，其周圍地黃圈者陰性.酸性食品接種后,紙片變黃,經(jīng)培養(yǎng)后無紫紅色斑點為陰性1/13/202356（二）餐具大腸菌群快速檢驗(紙片法)使用方法：1.

采樣6—10份。碗、盤、杯等每份貼紙片兩張，用無菌生理鹽水濕潤紙片后，立即貼于食具內側表面，30s后取下，置于原塑料袋內?？曜右?只為一份樣品，用吸管吸取生理鹽水濕潤紙片后，立即將筷子進口端（約5cm）抹拭兩張，放入原塑料袋內。1/13/2023572.將已采樣的紙樣置于37°C培養(yǎng)15h.紙片在黃色背景上出現(xiàn)紅色斑點為陽性，紙片在紫蘭色背景上呈現(xiàn)紅色斑點，但周圍沒有黃暈均為大腸菌群陰性。同一份樣品兩張紙片均是陰性為合格。1/13/202358食品冷飲大腸菌群檢驗紙片

冷飲、乳制品和調味品等大腸菌群的測定1/13/202359食品飲料大腸菌群快速檢驗紙片

飲料、食用純水和糕點的大腸菌群測定1/13/202360餐具大腸菌快速檢驗紙片

餐具衛(wèi)生消毒效果檢測1/13/202361大腸菌群測試片

適用于需要對大腸菌群準確計數(shù)的樣品，如消毒牛乳、冷飲和調味品等。

1/13/202362實例：水的大腸菌群檢驗大腸菌群MPN/100mL細菌總數(shù)CFU/mL

生活飲用水

≤3/L＜100

瓶裝飲用純凈水

≤3

≤20

飲用天然礦泉水罐裝產品0＜50地面水質量標準

＜10000個/L

準備加氯消毒后供飲用的水≤1000準備加氯消毒后供飲用的水≤10000游泳池水≤100＜10001/13/202363（一）、水樣的采集

1、自來水（未含氯）：龍頭火燒滅菌，暢流5—10′后取樣。2、地面水源水：江湖河，水庫，水池等。浸入水下20cm下取樣。水井50cm下取樣。3、漂白粉處理的水樣：自來水，游泳池水，應在瓶內加入0.03g硫代硫酸鈉/500ml，或2ml1.5%硫代硫酸鈉液/500ml，除氯。4、運送：2小時內送到檢驗室。6—10℃，<6h,立即檢驗.5、檢驗前：將水樣振搖5—10分鐘。1/13/202364（二）、生活飲用水或食品生產用水的檢驗（大腸菌群）

各加10ml各加100ml水樣初發(fā)酵三料乳糖膽鹽50毫升裝三料乳糖膽鹽5毫升裝EMB分離36℃培養(yǎng)24h復發(fā)酵乳糖發(fā)酵鏡檢36℃培養(yǎng)24