抗生素類藥物分析

第十六章抗生素類藥物分析1編輯ppt第一節(jié)概述2編輯ppt一、抗生素的定義及特點(diǎn)◆低化學(xué)純度－同系物多、異構(gòu)體多、降解物多◆活性組分的變異性－生產(chǎn)過(guò)程中條件的變化◆不穩(wěn)定性－不穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)

是指“生物在其生命活動(dòng)中產(chǎn)生的，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機(jī)能的化學(xué)物質(zhì)的總稱”3編輯ppt抗生素的分類β－內(nèi)酰胺類抗生素四環(huán)素類抗生素氨基糖苷類抗生素大環(huán)內(nèi)酯類抗生素多烯大環(huán)類抗生素－制菌霉素、兩性霉素多肽類抗生素－放線菌素、多黏菌素酰胺醇類抗生素－氯霉素抗腫瘤類抗生素其他抗生素二、抗生素類藥物的分類按化學(xué)結(jié)構(gòu)分4編輯ppt三、抗生素類藥物的細(xì)菌耐藥性5編輯ppt6編輯ppt7編輯ppt8編輯ppt三、抗生素類藥物的細(xì)菌耐藥性◆1、耐藥性的種類固有耐藥性：天然耐藥性，由細(xì)菌染色體基因決定獲得性耐藥性：◆2、耐藥的機(jī)制（1）產(chǎn)生滅活酶，使抗菌藥失活如β-內(nèi)酰胺酶（2）抗菌藥物作用靶位改變（3）降低細(xì)菌外膜通透性（4）影響主動(dòng)流出系統(tǒng)9編輯ppt10編輯ppt四、抗生素藥物的質(zhì)量分析鑒別試驗(yàn)㈠1、官能團(tuán)的顯色反應(yīng)－特殊基團(tuán)的反應(yīng)2、光譜法－特征吸收3、色譜法－保留行為4、生物學(xué)方法－抗菌能力11編輯ppt㈡檢查1、影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項(xiàng)目－水份、酸堿度等2、控制有機(jī)和無(wú)機(jī)雜質(zhì)的檢查項(xiàng)目3、與臨床安全性密切相關(guān)的檢查項(xiàng)目－異常毒性、熱原等4、其他檢查項(xiàng)目－其他共存組分12編輯ppt㈢含量或效價(jià)測(cè)定1、微生物檢定法比濁法管碟瓊脂擴(kuò)散法－抑菌圈Potency:是指每ml或每mg中含有某種抗生素有效成分的多少U/mg是以抗生素對(duì)微生物的殺傷或抑制程度為指標(biāo)來(lái)判斷效價(jià)的一種方法方法13編輯ppt靈敏度高、需用量少適用范圍廣－純品、不純品、已知的和新的可一次測(cè)定同類型抗生素的總效價(jià)－無(wú)需分離純化與臨床的應(yīng)用要求一致操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力誤差較大是結(jié)構(gòu)復(fù)雜和多組分抗生素效價(jià)測(cè)定的首先方法優(yōu)點(diǎn)㈢含量或效價(jià)測(cè)定1、微生物檢定法缺點(diǎn)14編輯ppt2、物理化學(xué)法

HPLCLC-MSUV

容量法準(zhǔn)確可靠、專屬性高、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、樣品用量少1、對(duì)結(jié)構(gòu)已知或提純的抗生素2、需要標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照儀器分析方法㈢含量或效價(jià)測(cè)定15編輯ppt第二節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素16編輯pptβ-內(nèi)酰胺類抗生素6-氨基青霉烷酸（6-APA）；青霉素類；7-氨基頭孢菌烷酸（7-ACA）；頭孢菌素類；一、結(jié)構(gòu)及分類氫化噻嗪環(huán)氫化噻唑環(huán)17編輯ppt青霉素（青霉素鉀、鈉）18編輯ppt氨芐西林

（氨芐青霉素）19編輯ppt阿莫西林

（羥氨芐青霉素）20編輯ppt普魯卡因青霉素21編輯ppt頭孢氨芐22編輯ppt頭孢羥氨芐23編輯ppt㈡理化性質(zhì)1、酸性與溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不穩(wěn)定性24編輯ppt酸性一、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與性質(zhì)Na與堿金屬(Na+、K+)成鹽

（一）羧基

易溶于水

25編輯ppt與有機(jī)堿(普魯卡因)成鹽

難溶于水普魯卡因青霉素26編輯ppt（二）手性C

頭孢菌素類C6C7青霉素類C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡27編輯ppt

（三）共軛體系頭孢菌素類母核有共軛體系

青霉素類母核無(wú)明顯UV

多數(shù)有苯環(huán)取代基

UV28編輯ppt（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性

水溶液

不穩(wěn)定

干燥純凈

穩(wěn)定

不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大

酰胺鍵易水解

含水量純度

29編輯ppt青霉素類

某些氧化劑酸、堿、青霉素酶（某些金屬離子）（溫度）降解失效（四）β–內(nèi)酰胺環(huán)

30編輯ppt與含水量和純度密切相關(guān)青霉素的降解途徑31編輯ppt青霉素的降解產(chǎn)物青霉噻唑酸－青霉素酶青霉酸－強(qiáng)酸性環(huán)境青霉烯酸－弱酸性環(huán)境青霉醛－強(qiáng)酸性-加熱青霉胺－強(qiáng)酸性-加熱/青霉素酶-重金屬降解產(chǎn)物32編輯ppt二、鑒別反應(yīng)（一）顯色反應(yīng)1、異羥肟酸鐵反應(yīng)33編輯ppt2.茚三酮反應(yīng)

α-氨基-氨基茚三酮藍(lán)紫色34編輯ppt3.雙縮脲反應(yīng)似肽鍵（開(kāi)環(huán)分解）-內(nèi)酰胺類堿性酒石酸銅紫35編輯ppt36編輯ppt4.與重氮苯磺酸反應(yīng)橙黃色重氮苯磺酸--56OHHC（偶合）酚羥基頭孢哌酮37編輯ppt1.K+、Na+的火焰反應(yīng)（二）各種鹽的反應(yīng)

焰色→鮮黃色

+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼鈉→↓白

K+38編輯ppt2.沉淀反應(yīng)（青霉素鹽）遇酸→↓在過(guò)量HCl或有機(jī)溶劑中溶解白青霉素青霉素鈉

青霉素鉀

+H+39編輯ppt3.重氮化-偶合反應(yīng)

重氮化-偶合反應(yīng)芳伯氨基40編輯ppt光譜法（三）1、UV法樣品、分解產(chǎn)物Cu2+頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉

A280nm/A264nm=1.30～1.5041編輯ppt42編輯ppt2、IR法3180cm-1N-Hβ–內(nèi)酰胺C=O1780cm-13470cm-1O-H1690cm-1仲酰胺C=O1250cm-1C-O以阿莫西林為例43編輯ppt色譜法（四）1、TLC法對(duì)照品對(duì)照法2、HPLC法44編輯ppt三、雜質(zhì)檢查

藥物

檢查項(xiàng)目

檢查方法

頭孢他啶聚合物HPLC法

頭孢曲松鈉

頭孢哌酮鈉

頭孢噻肟鈉

頭孢呋辛酯有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體HPLC法

頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)反相TLC法

青霉素鉀（鈉）吸收度紫外分光光度法

45編輯ppt

1.頭孢他啶聚合物的測(cè)定分子排阻色譜法

固定相：葡聚糖凝膠G-10

流動(dòng)相A：3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液

流動(dòng)相B：0.01%十二烷基硫酸鈉

對(duì)照品溶液：頭孢他啶對(duì)照品100μg/ml

46編輯ppt1）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：理論塔板數(shù)和拖尾因子用1mg/ml藍(lán)色葡聚糖2000、流動(dòng)相A測(cè)定；重復(fù)性用對(duì)照品溶液、流動(dòng)相B測(cè)定。

N不低于900，拖尾因子0.75~1.5，峰面積的RSD應(yīng)小于5.0%

2）測(cè)定方法

進(jìn)樣供試液，用流動(dòng)相A；進(jìn)樣對(duì)照液，用流動(dòng)相B。以外標(biāo)法計(jì)算，含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計(jì)不得超過(guò)0.3%。47編輯ppt2.頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查

固定相：ODS

流動(dòng)相：0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇（62:38）

1）頭孢呋辛酯Δ2-異構(gòu)體的制備：頭孢呋辛酯對(duì)照品+流動(dòng)相頭孢呋辛酯Δ2-異構(gòu)體。

2）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：各異構(gòu)體之間的R>1.5，以頭孢呋辛酯A異構(gòu)體計(jì)算n>1500。48編輯ppt

3）異構(gòu)體：

相對(duì)保留時(shí)間1--被測(cè)物

2--標(biāo)準(zhǔn)物異構(gòu)體相對(duì)保留時(shí)間判斷B異構(gòu)體0.85供試液譜圖中A異構(gòu)體的峰面積A異構(gòu)體1.0與A、B異構(gòu)體峰面積和之比應(yīng)為0.48~0.55。

異構(gòu)體A異構(gòu)體B頭孢呋辛49編輯ppt3.頭孢氨芐中有關(guān)物質(zhì)的檢查-反相TLC法

固定相：活化后的硅膠G板置5%（V/V）正十四烷的正己烷溶液中，展至頂部，涼干展開(kāi)劑：0.1mol/L枸櫞酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉-丙酮（120：80：3）

供試液：本品50mg/ml

對(duì)照液（1）：本品0.5mg/ml

對(duì)照液（2）：α-苯甘氨酸0.5mg/ml

對(duì)照液（3）：7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸

0.5mg/ml50編輯ppt結(jié)果判斷：供試液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，與對(duì)照液（2）（3）位置相同上所的斑點(diǎn)比較，其顏色不得更深；如顯其他雜質(zhì)斑點(diǎn)，與對(duì)照液（1）所顯的主斑點(diǎn)比較，其顏色不得更深。51編輯ppt4.青霉素鈉（鉀）的吸收度檢查：供試液1.80mg/ml，

結(jié)果判斷：A280不得大于0.1052編輯ppt（一）高效液相色譜法原理：利用青霉素類抗生素在一定條件下在反相硅膠上的保留行為的不同而實(shí)現(xiàn)高效分離，并與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)照，而對(duì)其進(jìn)行定量的一種方法。優(yōu)化色譜分析條件（1）Column-CNODSC18C8-Ben（2）mobilephase/flowrate（3）columntemperature（4）detectionwavelength（5）workstationsamplepreparation四、含量測(cè)定-容量法和儀器分析法53編輯ppt實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)（1）色譜峰要達(dá)到較好的分離－基線分離(baseseparation)（2）需要標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，用外標(biāo)法定量（3）可同時(shí)測(cè)定多個(gè)組分的含量（4）需要排除制劑中輔料等雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾54編輯ppt（二）生物樣本中β-內(nèi)酰胺類抗生素的分析血漿尿樣唾液膽汁生物樣本色譜柱：HypersilODSC18(200mm×4.6mm,I.D.5μm)樣品制備：取血漿200μL，加入內(nèi)標(biāo)5μL，再加入HCLO4，窩旋提取InternalstandardIS55編輯ppt56編輯ppt第三節(jié)氨基糖苷類抗生素57編輯ppt第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素58編輯ppt鏈霉素鏈霉胍+鏈霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺

苷元糖鏈霉雙糖胺59編輯ppt鏈霉素：鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺60編輯ppt巴龍霉素D-葡萄糖胺+脫氧鏈霉胺+D-核糖+巴龍霉糖巴龍胺苷元巴龍二糖胺

糖61編輯ppt慶大霉素

糖苷元絳紅糖胺+脫氧鏈霉胺+加洛糖胺

糖62編輯ppt絳紅糖胺紫素胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺63編輯ppt慶大霉素C復(fù)合物慶大霉素C1R=HR1、R2=CH3

慶大霉素C2R=R2=H

R1=CH3

慶大霉素C1aR、R1、R2=H

慶大霉素C2aR=CH3R1=R2=H慶大霉素C2bR=R1=HR2=CH364編輯ppt一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)多與硫酸成鹽鏈霉素3個(gè)慶大霉素5個(gè)堿性中心堿性（一）水溶性溶解性（二）65編輯ppt鏈霉素

pH5～7.5慶大霉素pH2～12

穩(wěn)定穩(wěn)定性（四）UV（三）66編輯ppt坂口反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)67編輯ppt二、

鑒別

茚三酮反應(yīng)（一）△羥基胺結(jié)構(gòu)68編輯ppt

（2）Molisch反應(yīng)具有五碳糖或六碳糖的氨基糖苷類抗生素經(jīng)酸水解后，在鹽酸作用下脫水生成糠醛或羥甲基糠醛，加入α–萘酚（紅紫色）或蒽酮（藍(lán)紫色）69編輯ppt紅紫色70編輯ppt

（3）Elson-Morgan反應(yīng)水解產(chǎn)生的N-甲基-L-葡萄糖胺在堿性溶液中與乙酰丙酮合成吡咯衍生物，再與對(duì)二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反應(yīng)，生成櫻桃紅色縮合物。藍(lán)紫色71編輯ppt

（4）麥芽酚反應(yīng)－鏈霉素的特征反應(yīng)鏈霉素水解得到的鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴(kuò)大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍，生成α-甲基-β-羥基-γ-吡喃酮（麥芽酚），該化合物與Fe3+在弱酸性溶液中形成紅紫色配位化合物。72編輯ppt紫紅麥芽酚73編輯ppt（5）坂口反應(yīng)－鏈霉胍的特有反應(yīng)向鏈霉素的水解產(chǎn)物鏈霉胍與NaBrO2反應(yīng)得產(chǎn)物1；8-羥基喹啉也和NaBrO2反應(yīng)得產(chǎn)物2。產(chǎn)物1和產(chǎn)物2再相互作用生成橙紅色化合物。74編輯ppt（八）色譜法（1）TLC法：硫酸慶大霉素的鑒別

點(diǎn)樣：供試液：展開(kāi)、涼干、碘蒸氣中顯色

對(duì)照液

判斷：供試液與對(duì)照液所顯斑點(diǎn)的顏色與位置應(yīng)一致。

點(diǎn)樣：供試液

對(duì)照液①：硫酸鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品

對(duì)照液②：硫酸鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品+硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品+硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品

75編輯ppt判定法：供試液中主斑點(diǎn)的位置、顏色、大小應(yīng)與對(duì)照液①相同，

對(duì)照液②應(yīng)顯示分離清晰的3個(gè)斑點(diǎn)否則試驗(yàn)無(wú)效。

（2）HPLC法：硫酸慶大霉素的鑒別

比較供試液與對(duì)照液各組分的保留時(shí)間。76編輯ppt

特殊雜質(zhì)的檢查（1）鏈霉素中鏈霉素B的檢查－TLC法硅膠G板（使用前需活化）、展開(kāi)劑甲苯-冰乙酸-甲醇（50:25:25）、0.2％二羥萘的乙醇－20％硫酸混合液（2）慶大霉素中組分C的檢查－衍生化后HPLC色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、衍生化條件的摸索

組分C的毒副作用和耐藥性與慶大霉素有差異，導(dǎo)致產(chǎn)品的效價(jià)和臨床療效77編輯ppt++410.pH吲哚衍生物巰基醋酸鄰苯二醛氨基λmax=330nm衍生化原理

1.78編輯ppt1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物79編輯pptRP－HPLC方法

2.規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%計(jì)算

3.峰面積歸一化法80編輯ppt81編輯ppt四、

含量測(cè)定微生物檢定法各國(guó)藥典主要采用HPLC法常用于體內(nèi)藥分

返回82編輯ppt第四部分：四環(huán)素類抗生素TrtracyclinesTC83編輯ppt

理化特性（1）酸堿兩性－C4（二甲氨基）、C10（酚羥基）（2）旋光性－含有手性中心（一般為左旋）（3）紫外吸收特性－具有共軛雙鍵體系（吸收波長(zhǎng)為長(zhǎng)波方向）（4）與金屬離子的配位化合物反應(yīng)－酚羥基和烯醇基（5）不穩(wěn)定性－對(duì)各種外界條件，包括氧化劑、酸、堿，易形成差向、脫水和異四環(huán)素，顏色加深84編輯ppt弱酸性環(huán)境ETC差向四環(huán)素85編輯ppt強(qiáng)酸性環(huán)境ATC脫水四環(huán)素86編輯ppt堿性環(huán)境EATC異四環(huán)素差向脫水四環(huán)素87編輯ppt二、

鑒別試驗(yàn)

濃H2SO4反應(yīng)（一）黃色朱紅色綠藍(lán)深紫色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素42SOH鹽酸美他環(huán)素橙紅色88編輯pptFeCl3反應(yīng)（二）褐色橙褐色深褐色紅棕色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素3FeCl89編輯pptTLC法（三）鹽酸土霉素的鑒別

HPLC法（五）EDTA

克服痕量金屬造成的拖尾現(xiàn)象比較保留時(shí)間90編輯ppt三、

特殊雜質(zhì)檢查

·

4-差向四環(huán)素（ETC）

·脫水四環(huán)素（ATC）

·差向脫水四環(huán)素（EATC）

·鹽酸金霉素（CTC）

有關(guān)物質(zhì)（一）HPLC法（2000版）鹽酸四環(huán)素91編輯ppt四環(huán)素有關(guān)物質(zhì)TLC圖I.供試液(5mg/ml)ETC(0.2mg/ml)

ATC(0.025mg/ml)IV.EATC(0.025mg/ml)CTC(0.1mg/ml)VI.混合液4％0.5％0.5％2％92編輯ppt吸收度（二）nmmax355268l、鹽酸四環(huán)素93編輯ppt雜質(zhì)吸收度

取供試品配成每10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm處測(cè)定，其吸收度不得超過(guò)0.12。應(yīng)嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間94編輯ppt四、

含量測(cè)定HPLC法

鹽酸四環(huán)素的測(cè)定

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：鹽酸四環(huán)素、有關(guān)物質(zhì)及ATC峰間的分離度均應(yīng)符合要求。

定量方法：外標(biāo)法以峰面積計(jì)。

95編輯ppt第五節(jié)抗生素類藥物中高分子雜質(zhì)的檢查1.高分子雜質(zhì)分子量大于藥物本身的雜質(zhì)總稱。96編輯ppt

蛋白、多肽、多糖或抗生素與蛋白、多肽、多糖的結(jié)合物。主要來(lái)自于發(fā)酵工藝，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。

藥物的自身聚合物，來(lái)自于生產(chǎn)、貯存過(guò)程。可引發(fā)過(guò)敏。

外源性雜質(zhì)內(nèi)源性雜質(zhì)97編輯ppt2、基本特點(diǎn)－對(duì)青霉素而言青霉噻唑多肽－外源性的（2400～3500）青霉素聚合物－內(nèi)源性的（聚合度）

母核參與的聚合反應(yīng)－N型聚合反應(yīng)側(cè)鏈參與的聚合反應(yīng)－L型聚合反應(yīng)分類98編輯ppt（1）生產(chǎn)過(guò)程中的任何蛋白或碎片都可帶入產(chǎn)品中，易與藥物形成多肽類雜質(zhì)（2）形成的聚合物也可發(fā)生不同程度的降解（3）異構(gòu)體之間可以相互聚合－L-L、D-D、L-D（4）高分子雜質(zhì)與生產(chǎn)工藝密切相關(guān)特點(diǎn)99編輯ppt高分子雜質(zhì)的控制方法（1）高效液相色譜法（2）凝膠色譜－自身對(duì)照外標(biāo)法Se