常用分子生物學試劑選擇中文

常用分子生物學試劑選擇中文用于分子克隆的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶DNA核酸酶核酸修飾酶如何選擇最合適的限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的生物功能影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的生物功能

主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈細菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達主要特性I型II型III型限制修飾蛋白結構輔助因子識別序列切割位點異源三聚體多功能同源二聚體異源二聚體距識別序列1kb處隨機性切割旋轉對稱序列TGAN8TGCTAACN6GTGC距識別序列下游24-26bp處識別序列內(nèi)或附近特異性切割GAGCC限制性核酸內(nèi)切酶的類型限制性核酸內(nèi)切酶單功能雙功能ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶屬名種名株名Haemophilunitssinflunitsenzaed嗜血流感桿菌d株HindIII同一菌株中含多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶,表示在該菌株中發(fā)現(xiàn)這種酶的先后次序。限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構EcoRI的切割位點EcoRI的識別序列5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI等產(chǎn)生的5’粘性末端

5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’

5’…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’OHPOHP退火4-7℃PstI等產(chǎn)生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3’…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃退火4-7℃OHPOHPPvunitsII等產(chǎn)生的平頭末端5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvunitsII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10units酶加大反應總體積延長反應時間措施：DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Saunits3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現(xiàn)象EcoRI在正常條件下識別并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5‘PunitsPunitsATPyPy3’或者5‘AATT3’影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素星號活性在非標準反應條件下,也能切割一些與其特異識別序列類似的序列。在酶的名稱右上角加一個星號(*)表示,如EcoRⅠ*。必須采用規(guī)范的實驗步驟,堅持應用推薦的反應條件。同裂酶(isoschizomer)或異源同工酶:不同來源的限制酶可切割同一靶序列同尾酶(isocaunitsdiners)：來源不同、識別序列不同，但產(chǎn)生相同粘性末端的酶。遠距離裂解酶(distantcleavage)：識別位點與切割位置不一致可變酶：識別序列中的一個或幾個核苷酸是可變的Sunitsbset酶：一種酶的識別序列包含于另一些酶的識別序列之中

酶切反應注意事項價格昂貴的酶決不能用水稀釋,以免變性失活。預先加入除酶以外的所有其他試劑。取酶立即放于冰上。分裝小份避免反復凍融。使用無菌的新吸頭。少加水,使體積最小,但保證酶液體積不超過總體積的10％,否則酶液中的甘油會抑制酶活性。

常用內(nèi)切酶的單位價格比較

產(chǎn)品名稱公司規(guī)格價格單位價格BamHIN50002800.056T20001200.06P25002600.104BglIIN10002800.28T5001200.24P5002280.456DpnIN5003100.62T

P2003841.9175HindIIIN50002800.056T30001200.04P50001560.03NdeIN20003100.115T4002000.5P5007411.482如何選擇最合適的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性PCR實驗的不同需求DNA聚合酶的特性純度穩(wěn)定性酶活性PCR實驗的不同需求長片段擴增PCR試劑盒擴增效率保真性特異性基因組擴增、RT-PCR基因篩選、測序、基因克隆復雜模板擴增（GC含量高、二級結構）構建基因圖譜、測序、分子遺傳學復雜模板擴增、大規(guī)?；驒z測特異性－熱啟動Taq酶原理

蠟封抗體抑制化學修飾特點

避免非特異性擴增提高PCR反應的特異性用途

基因組擴增

RT-PCRTaqDNA聚合酶

廠商及貨號規(guī)格價格￥應用范圍與產(chǎn)品特性

熱啟動TaqDNA聚合酶Invitrogen10966-018100rxn1,0505u/ul，用于提高聚合酶鏈反應特異性的自動“熱啟動”Invitrogen10966-026250rxn2,510Invitrogen10966-034500rxn4,540MBIER0601100u600

TakaraDR007A250u350適用于HotStartPCR法擴增DNA和DNA序列測定。TakaraDRR006A250u550SGB0095-100U

100u300HeatstartTaqSG

B0095-200U

200u540SGB0095-500U

500u1,100TiangenET102-01250u200超純特異性最強的耐熱DNA聚合酶TiangenET102-02500u380保真性—高保真酶原理用途

表達基因的克隆基因的定點突變細胞內(nèi)基因點突變分析（SNP）

3’-5’核酸外切酶活性降低堿基錯配率

TaqDNA聚合酶

廠商及貨號規(guī)格價格￥應用范圍與產(chǎn)品特性

高保真DNA聚合酶Invitrogen12344-024200rxn3,180AccPrimePfxDNA聚合酶，具有高產(chǎn)量和高特異性的特高PCR保真度，為普通Taq的26倍，可擴增12kbDNA。PCR優(yōu)化最小化。Invitrogen12344-0321000rxn15,070

Invitrogen12344-040200rxn3,980AccPrimePfxSuperMix，同上。Invitrogen12346-086200rxn3,210AccuPrimeTaq，具有高特異性和高產(chǎn)量的高保真度PCR，為普通Taq的9倍，可擴增20kbDNA。PCR優(yōu)化最小化。Invitrogen12346-0941000rxn14,270Invitrogen11304-011100rxn1,610PlatinumTaq，5u/ul，RobustPCR擴增具有高產(chǎn)量,保真度為普通Taq的6倍，可擴增20kbDNA。室溫反應組裝。Invitrogen11304-029500rxn7,140Invitrogen11304-1025000rxn60,010Invitrogen12532-016100rxn2,270PlatinumPCRSuperMix，1.1X，同上。MBIK0191100u398HighFidelityPCREnzymeMix,可擴增10-20kbDNA。TakaraDRR100A250u280ExTaq,比普通Taq擴增效率高，保真度為其4倍。TakaraDR006A200u600Z-Taq,反應速度約為普通Taq的5倍，保真度為3倍。TakaraDR005A125u400PyrobestDNAPolymerase,保真度為普通Taq的10倍。高保真＋

高擴增效率原理混合酶－高擴增效率－3’－5’核酸外切用途超長片段擴增

－測序

－構建基因圖譜復雜模板擴增－GC含量高－二級結構PfunitsDNA聚合酶MBIEP0571100units545native,blunitsnt-endPCRprodunitsct,Errorrate:2.6x10-6MBIEP0501100units198recombinant,Errorrate:2.6x10-6PromegaM7741100units2–3units/μlSBSEP-500500units200耐熱，尤其適用于高保真擴增長度為3kb以下的片段SGB0093-100units

100units60SGB0093-200units

200units100

SGB0093-500units

500units200SGB0094S-100units

100units120SunitsperPfunitsSGB0094S-200units

200units220SGB0094S-500units

500units450

Stratagene600135100units1250native;高保真vsTaq:6X;<10KbStratagene600153100units1200cloned;高保真vsTaq:6X;<10KbTiangenEP101-01250units150超純高保真耐熱DNA聚合酶，配有10×PfunitsBunitsfferTiangenEP101-02500units280Pfunits熱啟動DNA聚合酶Stratagene600390100units1,500熱啟動;高保真vsTaq:20X;<19KbPhunitssionDNAPolymeraseNEBF-530S100units1,250高保真vsTaq:50X;Template:20KbPhunitssionHotstartDNAPolymeraseNEBF-540S100units1,500熱啟動;高保真vsTaq:50X;20KbVentDNAPolymeraseNEBM0254V100units310高保真vsTaq:5XNEBM0254S200units696DeepVentDNAPolymeraseNEBM0258V100units445高保真vsTaq:>6X產(chǎn)品名稱廠商及貨號規(guī)格價格￥應用范圍與產(chǎn)品特性

PhunitssionDNAPolymeraseNEBF-530S100units1,250長片段高保真;高保真vsTaq:50X;Template:20KbPhunitssionHotstartDNAPolymeraseNEBF-540S100units1,500熱啟動;高保真vsTaq:50X;20KbLongPCREnzymeMixMBIK0181100units3985units/unitsl,可擴增21-47kbLongPCRControlSetMBIK020125rxn398test20-30kbPCRfragmentsExpandLongTemplatePCRSystemRoche11681834001150units1,400HunitsmangenomicDNA:5-27KbAccunitsTaqLADNAPolymeraseSigmaD8045-125unitsN125units1,300高保真vsTaq:6.5X;genomicDNA:<20KbJunitsmpStartAccunitsTaqLADNAPolymeraseSigmaD5809-125unitsN125units1,550HotstartPCREXLDNAPolymeraseStragagene600340100units1,200高保真vsTaq:3X;GenomicDNA:<37Kb;vectorDNAtemplate:<50KbPfunitsunitsltraIIFunitssionHSDNAPolymeraseStratagene60067040rxn1,250GenomicDNA:<19Kb;cDNA:<9.6KbPfunitsunitsltraHotstartDNAPolymeraseStratagene600390100units1,500熱啟動;高保真vsTaq:20X;<19KbEXTaqTaKaRaDRR001A250units350GenomicDNATemplate:<20KbLATaqTaKaRaDRR002A125units300GenomicDNATemplate:<20Kb，

保真度為普通Taq的7倍。V-TaqSBSEVT-500500units260V-Taq,尤適合復雜長片段擴增,能擴增10kb的動植物基因組DNA和20kb的LambdaDNA。超純長片段擴增耐熱DNA聚合酶TiangenET103-01250units150配有10×LongTaqBunitsffer超純長片段擴增耐熱DNA聚合酶TiangenET103-02500units280TaqDNAPolymerase10xReactionBunitsfferPromegaM1881750unitsl50withMgcl2產(chǎn)品名稱廠商及貨號規(guī)格價格￥應用范圍與產(chǎn)品特性

PCR

MasterMix原理預配好的PCR反應液DNA聚合酶反應緩沖液dNTPPCR增強劑

PCRMasterMixPCR

MasterMix特點

快速簡便減少加樣誤差和污染

靈敏度高

可擴增低至2個拷貝的目的模板

特異性強降低PCR反應的要求，增強特異性

穩(wěn)定性好長期放置活性無改變適用范圍大規(guī)?；驒z測目的基因拷貝數(shù)極低的樣本

GC含量高,有二級結構的模板復雜基因組樣本可直接檢測菌落，基因點突變檢測,或者陽性克隆的篩選。產(chǎn)品名稱廠商及貨號規(guī)格價格￥應用范圍與產(chǎn)品特性

PCRMasterMix

PlatiunitsmqPCRSunitsperMix-unitsDGInvitrogen11743-100

2,250ForABI7000,7300,7700,7900(HT)2×PCRMasterMixMBIR01715ml87510050unitslrxns2×HostStartMasterMixMBIR02115ml1,0502XPCRMasterMixfor25020-unitslrxns;generates3'dAprodunitsctsunitspto4kbTaq2×MasterMixNEBM0270S8ml720400unitsTaq;Stableat4degreefor3monthsNEBM0270L5×8ml2,8802000unitsTaq;genomicDNA:4KbTaqPCRKitNEBE5000S200rxn1,200TaqDNApolymerase,dNTPs,DNAmarkerTaqPCRMasterMixQiagen2014433×1.7ml1,950250unitsTaqReadyMixTaqPCRReactionMixSigmaP4600-20RXN20rxn360WithMgCl2SigmaP4600-100RXN100rxn1,200

RedTaqReadyMixPCRReactionMixSigmaR2523-20RXN20rxn390Reddyeindicatesenzymeaddition&mixing;directloadingongel;highthrounitsgghpunitstapplicationsSigmaR2523-100RXN100rxn1,200Easy-AHighFidelityPCRmasterMixStratagene600640100rxn3,900

PfunitsunitsltraHotstartPCRMasterMixStratagene600630100rxn4,500VizarsSVGelandPCRClean-unitspSystemPromegaA928150preps562

如何選擇最合適的DNA修飾酶酶的作用DNA連接酶修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵修復與RNA鏈結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵連接多個平頭雙鏈DNA分子還可作用于RNA,但效率低得多,需ATP作輔因子。產(chǎn)品名稱廠商及貨號規(guī)格價格￥應用范圍與產(chǎn)品特性

DNA連接酶T4DNA連接酶Invitrogen15224-017100unitsnits610

Invitrogen15224-025500單位2,090Invitrogen15224-041250單位1,210T4DNALigase"HICONC."Invitrogen15224-0904×500單位6,740MBIEL0015200units158

NEBM0202V10,000unitsnits335400,000unitsnits/mlNEBM0202S20000unitsnits756

NEBM0202L100,000unitsnits3,024NEBM0202M20000units756Highconcentrationat2,000,000unitsnits/mlNEBM0202T100,000units3,024PromegaM1794500units1,248

PromegaM1801100units312PromegaM1804500units1,209

TakaraD2011A25,000units120E.coliDNAligase作用于5’端帶磷酸基團的DNA底物NAD+可促進該催化反應分子克隆使用不多，亦不能連接RNA。用途:cDNA第二鏈合成。產(chǎn)品名稱廠商及貨號規(guī)格價格￥應用范圍與產(chǎn)品特性

DNA連接酶E.coliDNA連接酶Invitrogen18052-019100unitsnits420

NEBM0205V100unitsnits280NEBM0205S200unitsnits636

NEBM0205L1,000unitsnits2,544TakaraD2160A1,000unitsnits150

T4RNAligase催化單鏈DNA或RNA連接。主要用途是對RNA進行3＇末端標記產(chǎn)品名稱廠商及貨號規(guī)格價格￥應用范圍與產(chǎn)品特性

RNA連接酶T4RNA連接酶MBIEL00211000units398NEBM0204S1000unitsnits636

NEBM0204L5000unitsnits2,544

PromegaM1051500units819TakaraD2050200units120

以核酸為底物的水解酶按底物專一性分：RNase、DNase、非專一性核酸酶按作用位點分：內(nèi)切或外切酶5‘-核酸酶或3’-核酸酶常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、綠豆核酸酶、RNaseARNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌體外切核酸酶等。許多核酸酶兼有內(nèi)切和外切活性核酸酶產(chǎn)品名稱廠商及貨號規(guī)格價格￥應用范圍與產(chǎn)品特性

核酸酶脫氧核糖核酸酶ⅠInvitrogen18047-01920,000u3,110

Invitrogen18068-015100u990RT-PCR擴增級

MBIEN05211000u405RNase-freeNEBM0303S1,000units756

NEBM0303L5,000units3,024

PromegaM6101

500RQ1RNase-FreeDNaseRoche10104159001100mg1,500

Roche1077678500110000u2,250RNase-freeSigmaD5052-15KU15000.00495SigmaD5052-150KU150000.002,000SigmaAMPD1-1KTkit900PCR擴增級TakaraD22103,000u120

TakaraD22151,000u120RNase-freeBAL-31核酸酶MBIEN017150u138NEBM0213S50units636

NEBM0213L250units2,544

TakaraD2510A50U120微球菌核酸酶MBIEN01818000u388

TakaraD29105,000U350

綠豆核酸酶NEBM0250V750units280

NEBM0250S1500units636

PromegaM43112,000u593TakaraD24201,000U120

S1核酸酶Invitrogen18001-01620,000u870I