補(bǔ)體檢測(cè)及應(yīng)用知識(shí)講解

補(bǔ)體檢測(cè)及應(yīng)用補(bǔ)體的固有成分；C1-C9、C1q、C1rC1s共11中蛋白分子調(diào)節(jié)和控制補(bǔ)體系統(tǒng)活化的成分；C1抑制物，膜協(xié)同因子蛋白等補(bǔ)體受體：補(bǔ)體C3的受體，CR1-5等補(bǔ)體系統(tǒng)組成補(bǔ)體系統(tǒng)功能

參與機(jī)體的抗感染防御反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞溶解，調(diào)理吞噬，免疫黏附以及參與炎癥反應(yīng)引起的機(jī)體的免疫損傷，是體內(nèi)具有生物學(xué)功能的免疫效應(yīng)系統(tǒng)和放大系統(tǒng)二、主要兩種補(bǔ)體的活化途徑（一）經(jīng)典途徑：是以IgG或IgM類抗體結(jié)合抗原后的免疫復(fù)合物為主要的激活劑，補(bǔ)體的11種成分全部參與的途經(jīng)。分為識(shí)別、活化和膜攻破三個(gè)階段。（二）替代途徑（旁路途經(jīng)）激活劑是微生物的菌體多糖、內(nèi)毒素、蛋白水解酶、IgG4和IgA聚合物等，參與的成分C3、C5-C9、B因子、D因子、P因子。兩種補(bǔ)體激活途徑的比較激活物抗原抗體復(fù)合物脂多糖、酵母多糖參與成分C1-C9C3、C5-C9B、D、P因子始動(dòng)分子C1qC3b所需離子Ca+2、Mg+2Mg+2C3

轉(zhuǎn)化酶C4b2aC3bBbC5轉(zhuǎn)化酶C4b2a3b（C3b）nBb或（C3b）nBbP經(jīng)典途徑替代途徑第二節(jié)補(bǔ)體總活性測(cè)定一、血清補(bǔ)體總活性測(cè)定（CH50試驗(yàn)）（一）實(shí)驗(yàn)原理：特異性抗體與紅細(xì)胞結(jié)合后可激活補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分滲入，引起紅細(xì)胞腫脹而發(fā)生溶血，溶血程度與補(bǔ)體的活性有關(guān)。溶血反應(yīng)程度與補(bǔ)體的劑量依賴呈S型曲線。（二）試驗(yàn)方法1.2%-5%綿羊紅細(xì)胞（SRBC）的配置2.溶血素：抗綿羊紅細(xì)胞抗體，是以SRBC免疫家兔所得的兔抗血清。試驗(yàn)前要進(jìn)行溶血素的稀釋和滴定。3.稀釋緩沖液:PH7.2-7.4磷酸鹽緩沖液Ca+2、Mg+2不同稀釋度溶血素的配置最終稀釋度稀釋液(ml)稀釋度溶血素（ml）1:10001.81:1000.21:20000.21:10000.21:30000.41:10000.21:40000.21:20000.21:50000.81:10000.21:60000.21:30000.21:80000.21:40000.21:100000.21:50000.2溶血素的滴定11：10000.10.20.20.1全溶血21：20000.10.20.20.1全溶血31：30000.10.20.20.137℃全溶血41：40000.10.20.20.130分鐘全溶血51：50000.10.20.20.1大部分溶血61：60000.10.20.20.1微溶血71：80000.10.20.20.1不溶血81：100000.10.20.20.1不溶血9對(duì)照__0.20.1不溶血管號(hào)溶血素試管內(nèi)加入的試劑量（ml）稀釋度溶血素1:60補(bǔ)體緩沖液2%SRBC結(jié)果以最高稀釋度的溶血素仍能產(chǎn)生完全溶血為最大有效反應(yīng)管(1：4000)即為1個(gè)單位，一般試驗(yàn)使用2個(gè)單位(1：2000)4.50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管配制5.血清總補(bǔ)體50%溶血活性測(cè)定(ml)10.10 1.40 0.5 0.52 0.15 1.35 0.5 0.53 0.20 1.30 0.5 0.54 0.25 1.25 0.5 0.55 0.301.20 0.5 0.56 0.35 1.15 0.5 0.57 0.40 1.10 0.5 0.58 0.45 1.05 0.5 0.59 0.50 1.00 0.5 0.510 0,00 1.50 0.5 0.5

試管號(hào) 1：20稀釋血清巴比妥緩沖2u溶血素2%SRBC 按以下公式求50%溶血的總補(bǔ)體值1CH50（U/ml）=×稀釋倍數(shù)血清用量總補(bǔ)體活性參考范圍:50-100U/ml(三)方法評(píng)價(jià)CH50測(cè)定經(jīng)典途徑總補(bǔ)體溶血活性反應(yīng)的是補(bǔ)體9種成分綜合水平緩沖液PH、離子強(qiáng)度、Ca+2、Mg+2濃度各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)加控制。第三節(jié)單個(gè)補(bǔ)體成分的測(cè)定主要檢測(cè)的單個(gè)補(bǔ)體成分：C3、C4、C1q、B因子和C1脂酶抑制物方法：免疫溶血法測(cè)定補(bǔ)體的溶血活性免疫化學(xué)法測(cè)定補(bǔ)體的含量一、免疫溶血法

定義：抗原與特異性抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解。當(dāng)缺乏某種補(bǔ)體成分時(shí)，加入指示系統(tǒng)，不能使補(bǔ)體連續(xù)激活，不發(fā)生溶血；再加入待測(cè)血清，使原來缺乏的成分得到補(bǔ)償，補(bǔ)體成分齊全，級(jí)聯(lián)反應(yīng)恢復(fù)，產(chǎn)生溶血，溶血程度與以待測(cè)補(bǔ)體成分活性有關(guān)，以50%溶血為終點(diǎn)。

（1）指示系統(tǒng)：兔抗血清致敏SRBC（2）實(shí)驗(yàn)反應(yīng)系統(tǒng)的補(bǔ)體：選用或制備缺乏某單一補(bǔ)體成分動(dòng)物或人血清的試劑（3）待測(cè)血清：待測(cè)血清標(biāo)本中的補(bǔ)體二、免疫化學(xué)法單向免疫擴(kuò)散法火箭免疫電泳透射比濁法散射比濁法第四節(jié)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)一、試驗(yàn)原理補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)三個(gè)系統(tǒng)：反應(yīng)系統(tǒng)：已知抗原或抗體與待測(cè)抗體或抗原補(bǔ)體系統(tǒng)：豚鼠血清指示系統(tǒng)：SRBC與溶血素結(jié)合成為致敏綿羊紅細(xì)胞圖19-3二、試驗(yàn)方法（一）試劑的制備1.抗原適當(dāng)純化2.抗原和抗體的滴定:選擇抗原與抗體均呈強(qiáng)陽性反應(yīng)（100%不溶血）的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價(jià)，即一個(gè)單位由方陣滴定表可見1:64的抗原和1:32的抗體為一個(gè)單位,正式試驗(yàn)抗原用2-4個(gè)單位,抗體用4個(gè)單位抗原與抗體效價(jià)的方陣滴定注:1、2、3、4分別表示補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)強(qiáng)度;0表示全溶血,補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陰性3.補(bǔ)體的滴定管號(hào) 1 2 3 4 5 6 1：60補(bǔ)體(ml)0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 緩沖液(ml) 0.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.16 抗原(2U/ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 37℃水浴30min 1%SRBC(ml)0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 37℃水浴30min 結(jié)果不溶血不溶血 微溶血 微溶血 全溶血 全溶血 能產(chǎn)生完全溶血的最少量的補(bǔ)體為1個(gè)實(shí)用單位，正式試驗(yàn)選用2個(gè)單位。由表19-9的結(jié)果為1：60的補(bǔ)體0.12ml可產(chǎn)生完全溶血為1個(gè)實(shí)用單位，按比例公式：2×0.12/60=0.2/X X=1/50（二）血清標(biāo)本及時(shí)分離血清，盡快檢測(cè)或-20℃保存試驗(yàn)前滅活補(bǔ)體（三）正式試驗(yàn)反應(yīng)物(ml) 待測(cè)血清陽性對(duì)照陰性對(duì)照抗原或抗體補(bǔ)體對(duì)照紅細(xì)胞 測(cè)定對(duì)照測(cè)定對(duì)照測(cè)定對(duì)照對(duì)照管2U1U0.5U對(duì)照管 稀釋血清 0.10.1 0.1 0.10.10.1- ---- 抗原或抗體 0.1- 0.1 -0.1- 0.1 0.10.10.1- 緩沖液 -0.1 - 0.1-0.10.1 0.10.10.10.4 補(bǔ)體2U 0.20.2 0.2 0.20.20.20.2 0.2--- 補(bǔ)體1U -- - --- - -0.2-- 補(bǔ)體0.5U -- ---- - --0.2- 混勻，37℃水浴1h或4℃16~18h SRBCs0.20.2 0.2 0.20.20.2 0.2 0.20.20.2