專題和蛋白質(zhì)技術(shù)

專題和蛋白質(zhì)技術(shù)第一頁，共七十三頁，2022年，8月28日課題1DNA的粗提取與鑒定

第二頁，共七十三頁，2022年，8月28日一、提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路（1）選用一定的________或________方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。（2）

DNA的粗提取就是利用DNA與______、______和________等在物理或化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。物理化學(xué)RNA蛋白質(zhì)脂質(zhì)第三頁，共七十三頁，2022年，8月28日（1）利用DNA的溶解性 DNA的溶解度2、提取DNA分子的基本原理第四頁，共七十三頁，2022年，8月28日

DNA不_______酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則_______酒精。利用這一原理，可將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。溶于溶于第五頁，共七十三頁，2022年，8月28日①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但對(duì)________沒有影響。②大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受____________的高溫，而

DNA在80℃以上才會(huì)變性。③洗滌劑能夠瓦解__________，但對(duì)________沒有影響。溫度洗滌劑DNA60-80℃細(xì)胞膜DNA（2）利用DNA和蛋白質(zhì)對(duì)酶、_______和________的耐受性不同第六頁，共七十三頁，2022年，8月28日（3）DNA的鑒定：

DNA在沸水浴的條件下，遇________反應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)________二苯胺藍(lán)色第七頁，共七十三頁，2022年，8月28日二、DNA的粗提取與鑒定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取

材料：新鮮的雞血注意：本實(shí)驗(yàn)中，要往雞血中加入抗凝劑（檸檬酸鈉溶液）

原則上只要含DNA的生物材料都可以，但是選取DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功率更大。第八頁，共七十三頁，2022年，8月28日(1)先將新鮮的雞血離心，獲得雞血細(xì)胞(2)在雞血細(xì)胞中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液1、破碎細(xì)胞討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？利用了什么原理？2、過濾，獲取含DNA的濾液第九頁，共七十三頁，2022年，8月28日（三）去除濾液中的雜質(zhì)討論：為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)

答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)第十頁，共七十三頁，2022年，8月28日討論：方案二與方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離

方案二利用了酶的專一性；方案三利用了DNA的穩(wěn)定性。第十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日（四）

DNA的析出與鑒定DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95％），靜置2-3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水1、DNA的析出第十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日A:2mol/L的NaCl溶液5ml+DNA絲狀物+

二苯胺試劑4ml

B:2mol/L的NaCl溶液5ml

+二苯胺試劑4ml混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否有藍(lán)色2、DNA的鑒定第十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取②雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長1、雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料的原因①雞血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得第十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日2、實(shí)驗(yàn)原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為0.14mol／L時(shí),DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。②DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。③DNA遇二苯胺（沸水浴）會(huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。第十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)材料和用具實(shí)驗(yàn)材料：1、雞血細(xì)胞液（5~10ml）；2、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液（實(shí)驗(yàn)前置于冰箱內(nèi)冷卻24h）；3、蒸餾水；4、質(zhì)量濃度為0.1g/ml的檸檬酸鈉溶液（抗凝劑）5、物質(zhì)的量濃度分別為2mol/L和0．015mol/L的NaCl溶液；6、二苯胺試劑第十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日第十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日答：因?yàn)镈NA不溶于冷酒精，而其他物質(zhì)可以溶解在酒精中，使含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物可以析出,懸浮于溶液中討論：（2）觀察絲狀物呈什么顏色？答：白色（1）為什么要加50mL的冷酒精？第十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日答：有絲狀物的試管變成藍(lán)色，另一試管還是原來顏色（4）這一鑒定結(jié)果說明什么問題？（3）比較兩個(gè)試管中溶液的顏色有什么不同？答：提取出的絲狀物是DNA（5）DNA的直徑約為20×10-10m，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的絲狀物的粗細(xì)是否表示1個(gè)DNA分子直徑的大小？答：DNA分子直徑只有2nm。絲狀物是多個(gè)DNA子聚在一起形成的第十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日答：整個(gè)實(shí)驗(yàn)共“兩次蒸餾水，三次過濾，六次攪拌”總結(jié)：①兩次蒸餾水第一次：使雞血細(xì)胞吸水脹破，提取核DNA

第二次：稀釋NaCl溶液，使DNA黏稠物析出（1）此實(shí)驗(yàn)過程中有幾次使用蒸餾水？幾次過濾，幾次攪拌？第二十頁，共七十三頁，2022年，8月28日②三次過濾第一次：過濾核外物質(zhì)，除去不溶的雜質(zhì)第二次：過濾除DNA的其他核內(nèi)物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)

第三次：過濾含DNA的NaCl溶液，得到濾液

第二十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日六次攪拌：攪拌目的第一次

攪拌加蒸餾水的雞血細(xì)胞液，加速細(xì)胞破裂第二次

攪拌含DNA的高濃度鹽溶液，加速

_______________________第三次

攪拌加蒸餾水的NaCl溶液，

____________________________第四次

攪拌含DNA的高濃度鹽溶液，加速

_______________________第五次

攪拌含DNA的酒精溶液，提取

__________________________第六次

攪拌含DNA白色絲狀物的鹽溶液，加速

__________________DNA的溶解均勻稀釋以析出更多DNADNA的溶解含雜質(zhì)較少的DNADNA的溶解第二十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日

觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備四、課題成果評(píng)價(jià)（一）是否提取出了DNA第二十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日

本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)（二）分析DNA中的雜質(zhì)第二十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷第二十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:第二十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日3.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)（1）DNA分子是由

的（脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。（2）

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。（3）兩條鏈上的堿基通過

連結(jié)起來，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對(duì)，

一定同胞嘧啶配對(duì)。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤第二十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日4.DNA的復(fù)制b.時(shí)期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期。c.場(chǎng)所細(xì)胞核（主要）、線粒體、葉綠體。a.概念由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的DNA的過程。d.基本條件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈第二十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物總結(jié)：胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸第二十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日一、PCR技術(shù)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。第三十頁，共七十三頁，2022年，8月28日（1）3′端和5′端：為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基（—OH）末端稱為________，而含____________的末端稱為________；一個(gè)雙鏈DNA分子中含兩個(gè)3′端和兩個(gè)5′端，如果一條鏈的方向是________，則另一條鏈的方向就是________，這就是反向平行的含義。3’端5’端磷酸基團(tuán)5’→3’3’→5’1、PCR擴(kuò)增方向第三十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日（2）DNA分子中相鄰兩個(gè)脫氧核苷酸殘基通過________________相連，該化學(xué)鍵是由一分子脫氧核苷酸中3號(hào)碳原子上的羥基（—OH），與相鄰的另一分子脫氧核苷酸中5號(hào)碳原子上的磷酸基團(tuán)脫水聚合而成。所以DNA的合成方向總是從子鏈的________向________延伸。3’5’磷酸二酯鍵5’端3’端第三十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日第三十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日2、PCR技術(shù)原理（1）PCR：DNA分子在一定條件下可以進(jìn)行________復(fù)制。（2）DNA的熱變性原理：在________的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為________；當(dāng)溫度緩慢下降后，兩條被分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈，這個(gè)過程稱為________。體外80-100℃變性復(fù)性第三十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日二、PCR的反應(yīng)過程DNA模板與模板DNA兩條鏈相結(jié)合的兩種引物1、反應(yīng)條件穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境四種脫氧核苷酸耐熱的DNA聚合酶嚴(yán)格控制溫度變化的控溫設(shè)備第三十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日靶序列靶序列第一步：變性（90-95℃）2、反應(yīng)過程第三十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’第二步：復(fù)性（50℃左右）第三十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶第三步：延伸（72℃左右）第三十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日靶序列

靶序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)DNA分子第三十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日3、結(jié)果（P60頁圖5-9復(fù)制結(jié)果）（1）PCR的每一輪循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸三步，從第二輪循環(huán)開始，每次循環(huán)的產(chǎn)物也做模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸。這樣，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的DNA序列呈____________。指數(shù)擴(kuò)增第四十頁，共七十三頁，2022年，8月28日（2）PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，處于兩引物間固定長度的序列數(shù)目約為________。230第四十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日1、PCR儀（一）.設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。三、PCR的實(shí)驗(yàn)操作第四十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。第四十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日1.準(zhǔn)備2.移液（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上。用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑?；旌虾笊w嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。3.混合（1）過程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s。4.離心（2）離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。第四十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。5.反應(yīng)循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟──變性、復(fù)性和延伸.第四十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：6.注意事項(xiàng)（1）隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；（2）分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭第四十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日（一）、理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算三、課題成果評(píng)價(jià)1.一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2.a條DNA，復(fù)制n次，DNA為a×2n（二）、實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1.原理可以通過計(jì)算DNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2.過程（1）稀釋2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋.第四十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值DNA含量(g)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)50：在標(biāo)準(zhǔn)厚度為1cm比色杯中，OD260為1相當(dāng)于50g/mL的雙鏈DNA分子（2）對(duì)照調(diào)零（3）計(jì)算（4）計(jì)算第四十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日光吸收波長／nm2602402202800.10.2第四十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日比色杯第五十頁，共七十三頁，2022年，8月28日課題3血紅蛋白的提取和分離第五十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日一、分離蛋白質(zhì)的基本方法原理1、凝膠色譜法（分配色譜法）：a.凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）

b.概念：根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用來進(jìn)行分離。

第五十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日相對(duì)分子質(zhì)量直徑大小運(yùn)動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)速度運(yùn)動(dòng)路程洗脫次序大____凝膠顆?？障吨睆?，被排阻在____垂直向下移動(dòng)____較短先從凝膠柱洗脫出來小____凝膠顆?？障吨睆?，可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部垂直向下移動(dòng)，無規(guī)則擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒____較長后從凝膠柱洗脫出來大于凝膠外部快小于慢第五十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日第五十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。大分子流動(dòng)快小分子流動(dòng)慢收集大分子收集小分子混合物上柱洗脫第五十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日2、

緩沖溶液的作用和組成：

（1）作用：能夠抵制____________的對(duì)溶液___

的影響，維持pH基本不變。外界的酸或堿pH值(2)緩沖溶液的配制

通常由_______種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的_________就可以制得______________

使用的緩沖液。1--2比例在不同pH范圍內(nèi)第五十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日思考：在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的pH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察紅色和材料的科學(xué)研究活性。第五十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日在同一電場(chǎng)下，由于各種分子帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）的差異及分子本身大小、形狀的不同，而使帶電粒子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。（2）原理：（1）概念：帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程3、電泳：第五十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日（3）常見方法瓊脂糖凝膠電泳聚丙稀酰胺凝膠電泳第五十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日二、粗提取血紅蛋白蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：血液血漿血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白兩個(gè)a－肽鏈兩個(gè)β一肽鏈樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定第六十頁，共七十三頁，2022年，8月28日第六十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日(1)目的：去除__________1、紅細(xì)胞的洗滌雜質(zhì)蛋白(2)方法：采集血樣：為防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血?jiǎng)幟仕徕c

低速短時(shí)間離心：500r/min，離心2min，這樣做的目的是防止紅細(xì)胞與白細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離效果

吸去血漿：用膠頭吸管吸去上層黃色血漿

：直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已經(jīng)洗滌干凈，否則需重復(fù)洗滌第六十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日

④生理鹽水洗滌：向盛有暗紅色紅細(xì)胞液體的燒杯中加入五倍體積的生理鹽水，緩緩攪拌10min

⑤低速短時(shí)間離心

⑥重復(fù)③④步驟3次：直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已經(jīng)洗滌干凈，否則需重復(fù)洗滌第六十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日（1）方法：加_________到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘。（2）目的：使紅細(xì)胞吸水____，血紅蛋白釋放出來。漲破蒸餾水2、血紅蛋白的釋放（3）原理：滲透作用第六十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日3、分離血紅蛋白溶