實驗SrRNA基因CR擴增、電泳與系統(tǒng)發(fā)育分析

實驗SrRNA基因CR擴增、電泳與系統(tǒng)發(fā)育分析實驗內(nèi)容?16SrRNA基因的PCR擴增、電泳及系統(tǒng)發(fā)育分析?染色體步移法克隆已知序列的側(cè)翼序列?大腸桿菌β-半乳糖苷酶的誘導表達?SDS分析融合蛋白的可溶性?綠色糖單胞菌的發(fā)酵及孢外酶的提取16SrRNA基因的PCR擴增、電泳及系統(tǒng)發(fā)育分析竇桂銘實驗目的掌握PCR的原理，增強對PCR重要性的認識；掌握電泳技術(shù)及系統(tǒng)發(fā)育分析的方法，為將來課題研究奠定基礎(chǔ)。PCR（PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應或PCR擴增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序設(shè)想—實現(xiàn)—改進與完善72℃94℃55℃PCR循環(huán)PCR技術(shù)的反應原理PCR技術(shù)的反應原理DNA或RNA模板5′5′待擴增DNA區(qū)域3′94℃5min5′5′55℃退火5′5′聚合3′3′5′5′3′循環(huán)25-30次變性70℃DNA引物DNA聚合酶dNTPsMg2+（緩沖液）12①5′5′目的基因變性加熱5′5′引物退火5′5′底物延伸5′5′5′加熱變性5′退火引物230個循環(huán)：230目標DNA片段達106-107變性－退火－延伸5′5′245′5′5′5′5′延伸5′5′5′5′5′一個標準的PCR過程核酸的凝膠電泳基本原理當一種分子被放置在電場中時，它們就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。這種電泳分子在電場作用下的遷移速度——電泳的遷移率。遷移率的影響因素：電場長度、電泳分子的電荷數(shù)量、電泳分子與支持介質(zhì)的摩擦系數(shù)等。在生理條件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團是呈離子化狀態(tài)的——叫做多聚陰離子。方向：負→正種類：水平垂直瓊脂糖聚丙烯酰胺普通DNARNA小分子量核酸二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖：線性多糖聚合物、從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。加熱→凝固：網(wǎng)孔狀的電泳介質(zhì)，密度由瓊脂糖的濃度決定。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的能力瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍:0.2-50kb凝膠濃度線形DNA的最佳分辨范圍（bp）0.5%1,000～30,0000.7%800～12,0001.0%500～10,0001.2%400～7,0001.5%200～3,0002.0%50～2,000瓊脂糖DNA分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個因素的影響：核酸分子量的大小分子狀態(tài)物理電壓緩沖液溫度電泳指示劑：溴芬蘭，距邊緣1cm左右停止電泳。電泳染色劑：溴化乙錠(ethidiumbromide,簡稱EtBr)，扁平染料，嵌到DNA或RNA分子的堿基之間，借助紫外燈觀察。DNAMarker1.2kb800bp操作步驟成分貯液濃度使用量(20μl體系)水——14μl10×GCBufferMg2+Plus2μldNTPs2.5mmol0.5μl16Sp110pmol/μl1μl16Sp210pmol/μl1μl基因組DNA100μg/ml1μlTaq酶5U/μl0.5μl循環(huán)次數(shù)反應條件195℃（10min）3094℃；30s58℃；1min72℃；1min30s172℃；10min172℃(10min)操作步驟(1)稱取瓊脂糖，用適當?shù)碾娪揪彌_液(常用1×TAE)配成所需濃度的膠；10×TAE緩沖液配制：0.4MTris-乙酸；0.02MEDTA，pH8.0(2)置微波爐中加熱煮沸，直至瓊脂糖完全溶解；(3)按照每20ml膠加入1μlGoldview/20ml；(4)凝膠溶液冷卻至50℃左右，倒入電泳膠盤，避免出現(xiàn)氣泡，室溫放置，至膠凝固；(5)小心拔出梳子，將膠盤放到有1×TAE緩沖液的水平電泳槽中；(6)樣品中加入1/5體積的6×loadingbuffer，混勻，用移液器小心加到點樣孔中，以穩(wěn)定電壓(4-5V/cm)電泳；6×加樣指示劑配方:0.25%溴酚藍;40%(W/V)蔗糖水溶液；(7)取出凝膠，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，如有必要，拍照記錄。瓊脂糖凝膠電泳：RibosomalRNASequences核糖體RNA序列與進化（1）具有重要且恒定的生理功能；（2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系統(tǒng)發(fā)育上具有適當?shù)谋Ｊ匦裕唬?）分子量大小適中，在細胞中含量大(約占細胞中RNA的90%)（4）高度保守、中度保守和高度變化的序列區(qū)域，適用于進化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。小核糖體亞單位RNA（16SrRNA，18SrRNA）16SrRNA的系統(tǒng)發(fā)育分析1AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGC61GGTAAGGCTCCTTCGGGAGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAATCTG121CCCTCCACTTTGGGATAAGCCTCGGAAACGAGGTCTAATACCGAATACGACCACTTCCTG181CATGGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTTCGGTGGGGGATGTGCTCGCGGCCTATCAGCTTGT241TGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCC301ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGAC361AATGGGCGGAAGCCTGATCCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAA421CCTCTTTCAGCGGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCCAACT481ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA541AAGGGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGGGAGTGAAAACACCGGGCTTAACTCGGTGCTT601GCTTTCGATACGGGCAGACTAGAGGTATTCAGGGGAGAACGGAATTCCTGGTGTAGCGGT661GAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGGAATATCCTG721ACGCTGAGGAGCGAAAGTGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCG781TAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGATCCATTCCACGGGTTCCGTGCCGCAGCTAACGCAT841TAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC901CCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGT961TTGACATACACCGGAAAGCTGCAGAGATGTAGCCCCTTTTAGTCGGTGTACAGGTGGTGC1021ATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC1081TCGTCCTATGTTGCCAGCAAGCCTTCGGGTGTTGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTC1141AACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCAC1201GCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATCCCGTGAGGGGGAGCGAATCCCAAAA1261AGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGT1321AATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGG