自-實時熒光定量PCR掃盲

實時熒光定量ＰCR原理和實驗無論是對遺傳病（如地中海貧血和血友?。魅静∪绺窝缀桶滩』蚰[瘤進行基因診斷,還是研究藥物對基因表達水平的影響或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果定量PR技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量PCR技術(shù)的最新進展是實時熒光定量。該技術(shù)借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物一方面提高了靈敏度另一方面還可以做到PCＲ每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)建立實時擴增曲線準確地確定CT值從而根據(jù)CT值確定起始ＤＮA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的ＤＮA定量。這是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。?根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對定量和絕對定量兩種。典型的相對定量如比較經(jīng)過不同方式處理的兩個樣本中基因表達水平的高低變化,得到的結(jié)果是百分比;絕對定量則需要使用標準曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMａn探針和SBＲＧreenI熒光染料兩種方法。比較而言探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴格所得數(shù)據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉實驗設(shè)計更為簡便。在選擇實驗方案時要根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯?shù)據(jù)精度的要求來決定。定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統(tǒng)計學(xué)要求并對數(shù)據(jù)進行嚴格的校正以消除偶然誤差。因此重復(fù)實驗和設(shè)立內(nèi)對照非常重要。由于各種各樣的客觀原因,這一點在實踐中往往被輕視或忽視，需要著重強調(diào)。當(dāng)然，與定性實驗一樣，定量PCR也要設(shè)立陰性和陽性對照,以監(jiān)控試劑和實驗操作方面可能出現(xiàn)的問題。1為什么終點定量不準確??我們都知道理論上PCR是一個指數(shù)增長的過程，但是實際的CＲ擴增曲線并不是標準的指數(shù)曲線，而是Ｓ形曲線。這是因為隨著ＰCＲ循環(huán)的增多擴增規(guī)模迅速增大,TaｑdNP、引物甚至DNＡ模板等各種ＰCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后CR就進入了平臺期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用不同的PCR反應(yīng)體系進入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化難以精確控制。所以即使是重復(fù)實驗，各種條件基本一致最后得到的DNA拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動很大(圖1）。 ?圖１同一個樣本重復(fù)96次PCR的擴增曲線傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素摻入標記后的光密度掃描等，測定的都是PR的終產(chǎn)物，而不是起始ＤNA拷貝數(shù)。由于PCＲ的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始ＤNA拷貝數(shù)。?對于絕大多數(shù)實驗,比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測等，需要測定的都是PCR放大之前標本中的DNA原始拷貝數(shù)，經(jīng)過PCR擴增以后的DA拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實情況。在這種情況下就不能采用終點定量，而要根據(jù)CT值確定DNA起始拷貝的數(shù)量。?2為什么CT值與起始模板拷貝數(shù)成線性關(guān)系??CT值的定義是ＰCＲ擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。從圖1的重復(fù)實驗中可以直觀地看到，盡管平臺期ＤＮＡ拷貝數(shù)波動很大,CＴ值卻是相對固定的。如果用不同濃度的ＤNA作PCＲ，可以看出DNA濃度越高，CT值越小。DNＡ濃度每增加1倍,CT值減小1個循環(huán)。CT值與模板DA的起始拷貝數(shù)成反比。?這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴格證明。為使表達式簡便以下推導(dǎo)忽略PCＲ效率等細節(jié)。如果考慮這些因素可以在方程上增加修正項。這些修正項的增加并不改變方程的線性性質(zhì)?！愕?，我們有Rn=RO(1+EX也就是說第ｎPCR循環(huán)時的熒光信號強度Ｒn)等于背景信號強度(RB)加上每個分子的熒光強度即單位熒光強度，RS)與分子數(shù)目的乘積。當(dāng)循環(huán)次數(shù)n = ＣT時，則有RT=RB＋XＯ（1+EX）CTRS。兩邊取對數(shù)，得log(ＲT -RB)= ｌogX0 +CＴｌoｇ（１+ Ｅx)+logR ｓ。整理此式,CTｌｏg(１＋Ex） = － logＸ0+log(RT- logs。所以對于每一個特定的PＣR反應(yīng)來說，EＸ、RT、RB和ＲＳ都是常數(shù),所以CＴ值與ｌｏgX0成反比，也就是說，CT值與起始模板拷貝數(shù)(X０)的對數(shù)成反比，起始DNＡ濃度每增加１倍，CＴ值減小1個循環(huán)。根據(jù)CＴ值的定量是精確和嚴格的，而傳統(tǒng)的終點定量則比較粗放。? 如果讀者有興趣的話，也可以假設(shè)PCR 的效率（即Ex)為10０%,從上式推算出定量ＰＣＲ標準曲線的最佳斜率和ＣT值的最佳范圍。3 ?怎樣確定CT值？實驗操作中,CT 值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時所對應(yīng)的PCR 循環(huán)次數(shù)(圖2)?！盎€上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號強度標準偏差的１０倍。閾值所在的橫線與ＰCＲ擴增曲線的交點所指的ＰCR循環(huán)次數(shù)就是CT值。基線范圍的定義是從第3個循環(huán)起到CT值前3個循環(huán)止,其終點要根據(jù)每次實驗的具體數(shù)據(jù)調(diào)整，一般取第3到第15個循環(huán)之間。早于3個循環(huán)時，熒光信號很弱，扣除背景后的校正信號往往波動比較大,不是真正的基線高度；而在ＣＴ值前3個循環(huán)之內(nèi)，大多數(shù)情況下熒光信號已經(jīng)開始增強,超過了基線高度，都不宜當(dāng)作基線來處理。圖2CT值和閾值顯然,CＴ值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實驗的質(zhì)量,CT值是一個完全客觀的參數(shù)。ＣＴ值越小,模板ＤNA 的起始拷貝數(shù)越多；CＴ值越大，模板DＮA的起始拷貝數(shù)越少。正常的CT值范圍在1８－３0之間,過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。? 4熒光信號和定量數(shù)據(jù)的歸一化? 雖然大多數(shù)定量ＰＣR 儀都會自動扣除本底,但是仍然需要注意熒光信號強度和定量數(shù)據(jù)的歸一化校正，以便不同樣本之間的實驗數(shù)據(jù)可以嚴格地相互比較。? 由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發(fā)效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號必須進行歸一化校正,以消除這些因素對定量結(jié)果的影響這種校正可以通過在反應(yīng)體系中添加額外的熒光染料來實現(xiàn)，一般采用紅色ROX 熒光，稱為陽性參比信號ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號的強度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)。目標基因和對照基因的信號除以陽性參比信號以后,即Ｒn ＝R / RROＸ，就可以在同樣的起點上進行比較和各種計算。? ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異（圖3)。?圖3ROX 熒光校正（左)和不校正(右)對實驗數(shù)據(jù)的影響歸一后的熒光信號再扣除本底，就得到DRnn=Rn,樣本-Rn，空白。DRn是最后構(gòu)R實時擴增曲線的縱坐標。無論絕對定量還是相對定量，在得到實驗結(jié)果后，還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問題。在實驗操作中,取樣都是以體積或重量為單位的,但是同樣體積或重量的樣本所來源的細胞數(shù)目并不一樣，所以拷貝/μL或拷貝/ｎg的定量數(shù)據(jù)相互之間實際上并不可比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝／細胞或拷貝/基因組為單位后，才可進行嚴格意義上的比較。?這種校正可以通過適當(dāng)?shù)膮⒈葋硗瓿伞⒈纫话氵x用bactiｎGAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小其定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組的數(shù)量。校正方法為:[DNA]樣本/［DNCDCT=樣本-CT,PC。因為CT值與起始DA拷貝數(shù)的對數(shù)是反比關(guān)系可以證明這兩種計算方法在數(shù)學(xué)上是等價的。?為了減少誤差目標基因和參比基因最好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時進行定量測定,所以這種對照稱為陽性內(nèi)對照(InternaｌPｏｓｉtiveConｔrolP)。要進行IPC歸一化校正，定量PＣＲ儀必須具備多色檢測能力最好是４色。否則目標基因和參比基因只能分兩管作定量就不成其為內(nèi)標了。5污染的預(yù)防和熱啟動為保證定量的準確性要預(yù)防非特異性ＰCＲ擴增和污染。常用的措施有使用UG酶(Uracil-N-Glyｃｏｓylａsｅ和熱啟動。ＵNG酶的作用原理是降解含有dU的雙鏈或單鏈DＮ5°C激活，9°C滅活。由于商用PCR試劑盒均以dTP取代dTTPCR產(chǎn)物都是含有dDNAR開始前增加50°C的保溫步驟，ＵNＧ酶即可將已有的PCR產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染。普通的Tａq酶即使在室溫下也有一定的活性,如果不采取措施,在加入PCＲ試劑的過程中、正式PＣR開始前就會完成少量PCR擴增,增加了背景,影響定量精度。而金牌Ｔaq酶經(jīng)過特殊修飾，常溫下其活性部位被封閉,沒有活性；只有經(jīng)過95°C 10 ｍin的熱啟動以后，封閉被解除,才能開始DNA鏈延伸,這樣就最大限度地減少了雜訊的生成。6 ?標準曲線、重復(fù)實驗和陰性、陽性對照定量實驗,誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實驗,對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理,可以將誤差降低到最小。所以定量實驗的每個樣本至少要重復(fù)3次以上,嚴格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù)６～８次,以滿足小樣本統(tǒng)計的要求。? 如果作絕對定量,則標準曲線需要在5 個點以上。標準曲線使用的標準品是濃度已知的DNA樣本可以自己制備，也可以購買商品化的試劑盒。其PCR反應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與未知樣本的一致以便在同一反應(yīng)板上同時定量。?陰性對照中不加模板DNA,而以水或緩沖液代替用于檢驗是否存在PCR污染。陽性對照則用于檢驗PCR試劑和實驗操作上可能出現(xiàn)的問題。如果實驗中設(shè)立了ＩPC,PＣ既可以用來校正數(shù)據(jù)也可以起到陽性對照的作用。7TaｑMan探針技術(shù)原理?TａqMａn探針法是高度特異的定量ＰCR技術(shù)，其核心是利用Tａq酶的３外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數(shù)量。?在TaqMan探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有報告基團（Reporter,R)FAMVIC等′端標記有熒光淬滅基團(Quencheｒ,Q)AMＲＡ等。當(dāng)探針完整的時候報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3′→′外切核酸酶活性就會將探針切斷報告基團遠離淬滅基團其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號（)。所以，每經(jīng)過一個PCR循環(huán)熒光信號也和目的片段一樣有一個同步指數(shù)增長的過程。信號的強度就代表了模板DNＡ的拷貝數(shù)。?信號產(chǎn)生機制

圖4 ＴaｑMaｎ探針的熒光TａqMan探針根據(jù)其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種：普通的TaｑMan探針和TaqManMMGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團on-Flｕoｒｅｓcentuｅｎcher)，本身不產(chǎn)生熒光可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MB(MｉnoｒＧroovｅBinder)修飾基團圖5),可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的TmMGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短既降低了合成成本也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。因為在模板的DA堿基組成不理想的情況下短的探針比長的更容易設(shè)計。實驗證明,TaqManMGB探針對于富含Ａ/T的模板可以區(qū)分得更為理想。??圖５TａqaｎMB探針8SBRGrｅenI熒光染料技術(shù)原理SBＲGｒeenI是一種只與DA雙鏈結(jié)合的熒光染料圖6）DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光；從DA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SGｒeen熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當(dāng)SRrｅeｎ染料與DNＡ雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DA變性時，SYGreｅn染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中引物退火并形成ＰＣR產(chǎn)物。４、聚合完成后，SYRGreeｎ染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合定量ＰCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。?圖 ６ SＹBRGreenI 熒光染料與DＮA雙鏈的結(jié)合SＹ BRGreenI 熒光染料能與所有的ＤＮA雙鏈相結(jié)合對DNA模板沒有 選 擇性,所以特異性不如TaｑMaｎ探針要想用熒光染料法得到比較好 的 定量結(jié)果,對PCR 引物設(shè)計的特異性和PＣR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。 在此前提下,本法是一種成本低廉的選擇。9 定量PCR儀簡介目前在國內(nèi)使用得比較多的熒光實時定量PCR 儀有美國應(yīng)用生物系 統(tǒng) 公司(Apｐｌied Biｏsyｓteｍs，ABI)的7０00、５7０0、790０、0 ０型和羅氏公司的Lightycler等。下面以ABI最新推出的700型為 例作簡單介紹。7 00型熒光定量PCＲ儀設(shè)計滿足臨床檢驗、醫(yī)學(xué)研究和基礎(chǔ)實驗的要 求，面向低通量至中等通量的用戶。隨機配置的定量ＰCR引物和探針設(shè)計軟件PrimｅrExｐress非常有用，因為到目前為止還沒有其他軟件有能力設(shè)計定量PCR所需的TaqMaｎ探針。?７０００型有實時動態(tài)（Real-Time)和終點讀板(PlateReaｄ)兩種運行模式。實時動態(tài)模式用于定量，測定DＮＡ或RＮＡ拷貝數(shù)。７00０型可以動態(tài)顯示ＰＣR擴增曲線的生成，定量的線性范圍大于７個數(shù)量級,區(qū)分5000和1000０個拷貝的ＤＮＡ模板可信度達９9.7%。終點讀板模式用于基因型鑒定、點突變檢測和單核苷酸多態(tài)性（SNP)分析等。當(dāng)然,7０00型也可以作為普通ＰCR儀使用。AＢＩ已經(jīng)發(fā)布1２萬個商品化的定量PＣＲ試劑盒，覆蓋人類全部4萬個基因,平均每個基因3個檢測試劑盒,為運用70007700790０型開展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。?７000型最大特色是具備多色檢測能力，熒光檢測的波長范圍為53０～590nｍ,能夠有效地分辨FAMＴＭ／SYBR？GｒeｅnIVICTＭ/ JOETMTRTM和RTM等熒光染料。多色熒光檢測技術(shù)為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽性內(nèi)對照的陰/陽性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時對多個目標基因進行定量可以大大提高精度并節(jié)約成本。7000 型支持兩種定量化學(xué):ＴａqＭａn熒光探針和SYBR Grｅｅｎ I熒光染料其熔曲線(DｉsｓocｉationCu ｒvｅ）功能用于判斷ＰＣＲ擴增反應(yīng)是否特異，有無雜帶生成。進一步閱讀材料基本方法［1]Liｅ,Y．Ｓ.andC. Ｊ., Ｐetrｏpouｌos."Advancesin quａntiｔatｉｖePCRt ｅchnolｏgｙ: 5′nucleas ｅassaｙs．"Curr ＯpiｎＢioteｃhnｏl ９43-48. 1９9８.[2］ Orlaｎdo, C.， Ｐ.，Pｉnzanｉ, and M., Ｐａzzaｇli. "Devｅlopmentsinquan ｔitａt(yī)ivｅ PCR." ＣlinCｈem Ｌａb Mｅd ３6:2５5-26９． 1９98.絕對定量[３]Becｋer Ｋ., Ｄ.PａnandC ．Ｂ.Whｉtｌey．199９. Rｅal-ｔime ｑuaｎtitatiｖe polｙｍｅrａse chain ｒｅaction tｏassessgeｎｅtｒansfｅｒ．Hum.GeｎeTher．10:2５59－256６,１9９9.[4]ｄｅＫok,J.B.,Hendriks，J.C.,ｖａnＳｏlinge,W．Ｗ．,Ｗｉｌｌemｓ,Ｈ.L.,Ｍenｓinｋ,E.J.，aｎｄSwiｎkelｓ,D.W.Useofreaｌ-time ｑuａｎtitative ＰCR to com ｐaｒｅ DNＡ isola ｔion meｔhｏds.Clin．44(10)：２2０１-2204,1 ９98．[5]WanｇＸ.，X.Li,R. Ｗ. Ｃurrie,R.N.Willeｔte,F．C. Ｂaroｎe andG.Z.F ｅuｅrstein. Apｐlｉcatioｎ ofreal-timepolymera ｓｅｃｈａiｎ reaｃｔion tｏｑuantiｔａt(yī)e indｕcｅd ｅxpressｉoｎoｆｉnteｒｌeukｉｎ-1ｂｅta mＲNAi