實(shí)驗(yàn)1-大腸桿菌的培養(yǎng)和分離2013-9-11emma

定義:結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物，包括病毒、原核生物(細(xì)菌、放線菌、藍(lán)細(xì)菌、支原體、衣原體)、原生生物(最簡(jiǎn)單的真核生物)和某些真菌（酵母菌、霉菌）。

微生物顯微鏡功能（1）放線菌和霉菌中提取抗生素（2）酵母菌發(fā)酵釀酒（3）乳酸菌發(fā)酵制作泡菜（4）醋酸菌發(fā)酵制作醋（5）紅曲霉和毛霉發(fā)酵制作腐乳（6）微生物用于治理環(huán)境細(xì)菌：是單細(xì)胞的原核生物。結(jié)構(gòu)組成：細(xì)胞壁（肽聚糖）、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，擬核分裂方式：二分裂（產(chǎn)生子細(xì)胞）菌落(子細(xì)胞群體)單菌落：由單個(gè)細(xì)菌（或其他微生物）在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)繁殖到一定程度；形成肉眼可見有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)等特征的子細(xì)胞的群落。

不同微生物形成的菌落具有不同的特征（形態(tài)、突起、邊緣），是鑒定菌種的重要依據(jù)。酵母菌放線菌霉菌大腸桿菌大腸桿菌（E.coli）分布：人和哺乳動(dòng)物腸道，此外還廣泛分布于水、污水、土壤、谷類、乳制品等當(dāng)中。大腸桿菌在人體的_____中一般對(duì)人體無害，但任何大腸桿菌如果進(jìn)入__________都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌是_______工程中被廣泛采用的工具。腸道泌尿系統(tǒng)基因革蘭氏______（填陰或陽）性菌陰代謝類型：異養(yǎng)，兼性厭氧型生長(zhǎng)適宜溫度：質(zhì)粒、EcoRⅠ限制酶、E.coli-DNA連接酶、受體細(xì)胞37℃左右實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的培養(yǎng)和分離1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作2.進(jìn)行大腸桿菌的分離,用固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康腖B液體（固體）培養(yǎng)基一、配制培養(yǎng)基培養(yǎng)基：是由人工方法配制而成的，專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)液。水、碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子(生長(zhǎng)因子即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)1、成分區(qū)別于動(dòng)物培養(yǎng)與植物培養(yǎng)：不加激素固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基的區(qū)別：瓊脂成分作用主要來源碳源主要作能源物質(zhì)無機(jī)碳(CO2)或有機(jī)碳(糖類)氮源合成含N類化合物N2，NH3，銨，硝酸鹽尿素，牛肉膏，蛋白胨無機(jī)鹽調(diào)節(jié)滲透壓等水生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)促生長(zhǎng)維生素，AA，堿基等如NaCl一、配制培養(yǎng)基不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方實(shí)例：“細(xì)菌喜葷，霉菌喜素”

細(xì)菌培養(yǎng)基要用蛋白胨和酵母提取物來配制，還要加入一定的氯化鈉，以維持一定的滲透壓；霉菌培養(yǎng)基一般用無機(jī)物配制或添加蔗糖的豆芽汁調(diào)節(jié)pH真菌：5～6細(xì)菌：6.5～

7.5溶解計(jì)算稱量調(diào)pH分裝加塞，包扎滅菌2、過程勿沾到瓶口或者壁上，易污染，則作廢二、包器材封口膜通空氣不通細(xì)菌牛皮紙或報(bào)紙加蓋后幾個(gè)包在一起接種環(huán)包牛皮紙P20①分裝：注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，因此在將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到三角瓶或試管中時(shí)必須用__________。②加塞：試管用塑料蓋或________；三角瓶口用_______或_________封口,再用_________或報(bào)紙封口。③包扎：用________或報(bào)紙三角漏斗棉花塞封口膜6層紗布牛皮紙牛皮紙250ml裝50ml三、滅菌定義：以化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物（包括芽孢(休眠體)和孢子（真菌、放線菌生殖細(xì)胞））方法1：高壓蒸汽滅菌：100kPa、121℃下維持15min（培養(yǎng)基、無菌水、玻璃器皿等滅菌。P20），滅菌前排出鍋內(nèi)冷空氣，因?yàn)榭諝馀蛎泬捍笥谒魵馀蛎泬海_(dá)不到水蒸氣的溫度。滅菌鍋壓力與大氣壓相同時(shí)打開鍋蓋滅菌后，通常將實(shí)驗(yàn)用具放進(jìn)60～80℃的烘箱中烘干，除去滅菌時(shí)的水分，防止污染(P20)方法2：干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。玻璃器皿等耐熱器具惡劣環(huán)境下四、超凈臺(tái)操作

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止________污染（培養(yǎng)基和操作者）的方法。雜菌1、紫外消毒（針對(duì)空氣）：實(shí)驗(yàn)用具放在超凈臺(tái)上，打開超凈臺(tái)的紫外燈和過濾風(fēng)（人離開）30min左右，培養(yǎng)基冷卻至60℃，關(guān)閉紫外。2、酒精消毒：用鑷子取出酒精棉擦拭超凈臺(tái)桌面，并擦拭雙手。3、開始實(shí)驗(yàn)_________必須無菌（滅菌）_________也必須要無菌（滅菌）_________時(shí)不帶入雜菌（滅菌、消毒各種器具培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移菌種滅菌與消毒的區(qū)別滅菌與消毒的區(qū)別消毒：使用較溫和理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對(duì)人體有害的微生物的過程。不能殺死芽孢和孢子。（對(duì)被消毒物體基本無害）滅菌：使用強(qiáng)烈的理化因素消滅物體內(nèi)外所有微生物，包括芽孢和孢子。（細(xì)菌蛋白質(zhì)變性達(dá)到滅菌目的）例題：請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。無菌操作消毒滅菌①高壓蒸汽滅菌②干熱滅菌③灼燒滅菌①紫外線消毒法（使蛋白質(zhì)變性，還能損傷②化學(xué)藥劑消毒法（酒精）③煮沸消毒法400~500℃70%DNA結(jié)構(gòu)④巴氏消毒法四、超凈臺(tái)操作倒平板制斜面：冰箱4℃保存單菌落在酒精燈火焰旁，以右手無名指及小指夾持封口膜，右手其他三個(gè)手指拿著三角瓶；左手拿著培養(yǎng)皿，并打開上蓋的一邊，將三角瓶中培養(yǎng)基（10~20ml）倒在培養(yǎng)皿里，將其放于水平位置，輕輕晃動(dòng)，使培養(yǎng)基鋪滿底部，凝固形成平面。倒置放置既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多,不容易進(jìn)入雜菌，同時(shí)能用來做純細(xì)菌的長(zhǎng)期保存。

思考題：A、操作過程中避免帶入雜菌的方法有哪些？1、滅菌后的培養(yǎng)基、器具置于超凈臺(tái)上，并打開超凈臺(tái)的紫外燈和過濾風(fēng)，滅菌30分鐘。2、用鑷子夾出灑精棉球擦拭桌面和實(shí)驗(yàn)者雙手。3、整個(gè)操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行4、打開后或加塞前試管口、三角瓶口灼燒滅菌。B、培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60后才倒平板，你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度呢？可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。思考題C、在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。D、如何檢查培養(yǎng)基是否受雜菌的污染？將未接種的培養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)，若無菌落產(chǎn)生則未受雜菌污染。四、超凈臺(tái)操作接種擴(kuò)大培養(yǎng)從大腸桿菌斜面→錐形瓶中的液體培養(yǎng)基接種好后在37度搖床振蕩培養(yǎng)12h注意事項(xiàng):1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.四、超凈臺(tái)操作劃線分離法原理：通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。由于劃線過程中接種環(huán)上的菌液逐漸減少，因此最后部分的細(xì)菌間距加大。獲得單菌落首尾注意事項(xiàng):1.接種環(huán)灼燒滅菌后要冷卻，避免溫度高殺死菌種1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次,不能劃破培養(yǎng)基.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)37℃，12~24h第一區(qū)域第二區(qū)域第三區(qū)域第四區(qū)域第五區(qū)域注意1:不能出現(xiàn)線條的重疊注意2:第二次或隨后幾次的操作總是從上一次劃線的末端開始注意3:最后一個(gè)區(qū)域不能與第一個(gè)區(qū)域相連

灼燒接種環(huán)冷卻

劃線（第一區(qū)域）蘸取菌液灼燒接種環(huán)冷卻

劃線（第二區(qū)域）灼燒接種環(huán)冷卻

劃線（第三區(qū)域）灼燒接種環(huán)冷卻

劃線（第四區(qū)域）灼燒接種環(huán)冷卻

劃線（第五區(qū)域）灼燒接種環(huán)平板倒置放置培養(yǎng)第一次灼燒每次劃線之前灼燒劃線結(jié)束灼燒目的避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上的殘留菌種殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境或感染操作者在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。單菌落分離的標(biāo)志？劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個(gè)菌落為什么要倒置培養(yǎng)？既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成細(xì)菌隨水?dāng)U散污染，難以分成單菌落，達(dá)不到分離的目的1、系列稀釋操作四、超凈臺(tái)操作涂布分離法2、涂布平板操作玻璃刮刀細(xì)菌的分離方法劃線分離法和涂布分離法。

種類:作用:單菌落的分離是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。

劃線分離法，簡(jiǎn)單方便；涂布分離法，單菌落更易分開，但操作復(fù)雜些單菌落培養(yǎng)試管斜面培養(yǎng)基密閉效果比平面的好很多,不容易進(jìn)入雜菌，同時(shí)能用來做純細(xì)菌的長(zhǎng)期保存。

在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37℃培養(yǎng)24h后，置于4℃冰箱中保存分析與討論:1、如何操作才可以盡量避免被雜菌污染？（1）膽大心細(xì)，操作快捷（2）注意滅菌操作原則，滅菌要徹底，盡量降低環(huán)境污染幾率，手和實(shí)驗(yàn)服要保持清潔，合理地減少操作時(shí)間，對(duì)污染源的改善要考慮周到（3）注意微生物的生長(zhǎng)條件，如pH、滲透壓、溫度等。細(xì)菌喜中性偏堿性環(huán)境，喜蛋白質(zhì)豐富的物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，喜37℃的溫度；而霉菌喜中性偏酸性環(huán)境，喜糖類豐富的物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，喜25-30℃的溫度。不僅考慮培養(yǎng)基成分，也要考慮理化性質(zhì)：pH、滲透壓、溫度、氧氣等分析與討論:2、在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染？（1）從菌落的形態(tài)看，是否濕潤(rùn)、透明、黏稠，呈何種顏色等，是區(qū)別細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌的關(guān)鍵指標(biāo)（2）用顯微鏡鏡檢觀察其形態(tài)、大小，看是否有菌絲、孢子、芽孢等，這也是區(qū)別細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌的關(guān)鍵指標(biāo)（3）上述方法較難區(qū)分同類的不同菌種，這時(shí)就需要借助化學(xué)方法和進(jìn)一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法，觀察孢子形態(tài)、孢子著生方式、菌絲生長(zhǎng)方式、有無鞭毛、芽孢、毒素及特異生理生化性質(zhì)等分析與討論:3、實(shí)驗(yàn)完成后，接觸過細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理？完成實(shí)驗(yàn)后，所有接觸過細(xì)菌的器皿都必須先經(jīng)過高壓滅菌后再洗滌，特別是培養(yǎng)基有可能被有害菌體污染，在培養(yǎng)繁殖后，大量有害菌體會(huì)影響人畜健康，也會(huì)污染環(huán)境，因此必須高壓滅菌。使用后的廢棄物也要經(jīng)過高壓滅菌后再丟棄。對(duì)于取樣器的取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌30min，再永清水洗凈，仍可再用。封口膜也可重復(fù)使用。分析與討論:4、如果分離的是轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌，如何保證不被普通的大腸桿菌所污染？轉(zhuǎn)基因用的質(zhì)粒，不是細(xì)菌中原有的質(zhì)粒，而是通過改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，如抗氨芐青霉素基因。轉(zhuǎn)基因載體（質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌后，能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而未被轉(zhuǎn)化的就不能生長(zhǎng)，其它沒有抗氨芐青霉素基因的雜菌也不能生長(zhǎng)，這種設(shè)計(jì)保證了轉(zhuǎn)基因工程菌的純潔性。在獲得轉(zhuǎn)基因工程菌后，如果為了選擇高表達(dá)量菌株等進(jìn)行分離，也可使用含抗生素的培養(yǎng)基，這就保證了轉(zhuǎn)基因工程菌不被普通（無抗性基因）的大腸桿菌所污染。請(qǐng)回答下列酵母菌有關(guān)的問題：

（1）從生態(tài)系統(tǒng)的成分上看，酵母菌屬于

，它的同化作用類型是

。（2）培養(yǎng)酵母菌時(shí)，為防止雜菌污染需要對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行

。（3）酵母菌菌種A能耐高溫，但產(chǎn)酒精率較低，而菌種B不耐高溫，產(chǎn)酒精率卻較高。利用細(xì)胞工程課獲得耐高溫、產(chǎn)酒精率高的融合子酵母菌（目的菌種），利用A、B兩菌種對(duì)某一藥物抗藥性的差異，可對(duì)融合子進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將含有融合子的培養(yǎng)液利用

方法接種到含有相關(guān)藥物的基本培養(yǎng)基上。下表為A、B兩菌種在幾種藥物的作用下，生長(zhǎng)狀況的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于A種不能獨(dú)立在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，所以，據(jù)表可以判斷，加入

（藥物），可以篩選出融合子。 注：“+”可以良