沉淀反應(yīng)本科

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)REVIEWQUESTION

Thespecificityofthereactionofantigenwithantibodyisusuallyhighlydependentupon

1)molecularweightoftheantigen2)chargeoftheantibody3)immunoglobulinisotype4)conformationofthereactants免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)沉淀反應(yīng)（precipitationreaction)毛旭虎醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室二OO六年二月免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)可溶性抗原+相應(yīng)抗體

肉眼可見的沉淀免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)液（毒素）與相應(yīng)抗血清混合出現(xiàn)沉淀1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加于其中，發(fā)現(xiàn)沉淀反應(yīng)可在凝膠中進(jìn)行1946年Oudin報(bào)告了試管免疫擴(kuò)散技術(shù)1965年Mancini提出單向免疫擴(kuò)散技術(shù)，使定性免疫試驗(yàn)向定量化發(fā)展免疫濁度法的出現(xiàn)，使沉淀反應(yīng)達(dá)到快速、微量、自動化的新階段。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)根據(jù)沉淀反應(yīng)的介質(zhì)和檢測方法的不同,沉淀反應(yīng)可分為:液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)凝膠內(nèi)的沉淀反應(yīng)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)第一節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)根據(jù)沉淀現(xiàn)象的不同，液體內(nèi)沉淀又可分為三類：絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)一、絮狀沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)是一項(xiàng)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)技術(shù)。曾用于測定梅毒抗體的Kahn試驗(yàn)是絮狀沉淀的代表試驗(yàn)，現(xiàn)今已被更簡便而敏感的USR或RPR方法替代。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(一)原理抗原溶液與相應(yīng)抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原與抗體結(jié)合出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。絮狀沉淀易受抗原與抗體比例的影響，由此可作為最適比測定的基本方法。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(二)操作步驟1.抗原稀釋法(1)將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。(2)各管加入一定濃度的適量抗血清。(3)振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。(4)產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)2.抗體稀釋法

本法采用抗原量恒定與不同倍比稀釋度的抗體反應(yīng)，出現(xiàn)沉淀物最多的管為抗體最適比例管。3.方陣滴定法

抗原和抗體同時(shí)稀釋，亦稱棋盤(checkerboard)滴定法，是前二法的結(jié)合，可一次完成抗原和抗體的滴定并找出抗原、抗體的最適比。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(三)方法評價(jià)

絮狀沉淀試驗(yàn)方法簡單，設(shè)備要求低，敏感度較低，受抗原抗體比例影響非常明顯，目前多用以測定抗原抗體反應(yīng)的最適比。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)二、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀(ringprecipitation)試驗(yàn)是由Ascoli于1902年建立的一種經(jīng)典的血清學(xué)定性試驗(yàn)。用非常簡便的技術(shù)了解待測血清內(nèi)是否存在某種抗原或抗體。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(一)原理把抗原溶液小心地加于已含抗體溶液的細(xì)試管液面上。當(dāng)對應(yīng)的抗原與抗體相遇，在界面處形成清晰的乳白色沉淀環(huán)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(二)操作步驟1.用毛細(xì)滴管吸取抗血清加于沉淀管(內(nèi)徑約1.5~2mm)底部，避免產(chǎn)生氣泡。2.將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。3.置沉淀管于室溫下使其反應(yīng)，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(三)方法評價(jià)

該試驗(yàn)是經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)之一，簡便、快速、實(shí)用。故用于鑒定血跡和診斷炭疽(Ascoli試驗(yàn))。只能定性，不能定量、敏感性較低(3~20mg/L)，對含有多個(gè)抗原抗體對的反應(yīng)系統(tǒng)缺乏分辨力。方法難以推廣。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)三、免疫濁度試驗(yàn)經(jīng)典的免疫沉淀試驗(yàn)是抗原和相應(yīng)抗體在反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)判定結(jié)果，方法存在耗時(shí)、敏感度低(10~100mg/L)和不能自動化等缺點(diǎn)。70年代以來，根據(jù)抗原和抗體所在液相內(nèi)快速結(jié)合并產(chǎn)生濁度的原理，建立了免疫比濁法。臨床常用3種微量免疫技術(shù)，即透射比濁法(transmissionturbidimetry)、散射比濁法(nephelometry)和免疫膠乳比濁法(immunolatexturbidimetry)，借助多種自動化分析儀器來完成。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(一)透射比濁法1.原理抗原抗體在一定緩沖液中形成免疫復(fù)合物(IC)，當(dāng)光線透過反應(yīng)溶液時(shí)，由于溶液內(nèi)復(fù)合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復(fù)合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和復(fù)合物的量成正比，當(dāng)抗體量固定時(shí)，與待檢抗原量成正比。用抗原標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可測出待檢抗原含量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)2.操作步驟(1)用稀釋緩沖液將待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品按規(guī)定稀釋，取一定量加至測定管中。(2)加最適工作濃度(用方陣法預(yù)先滴定)的抗體，孵育一定時(shí)間，測定吸光度(A)值。(3)以不同濃度抗原含量為橫軸，吸光度為縱軸，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可得待檢抗原量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)3.方法評價(jià)

敏感度高于單相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)5~10倍，批內(nèi)、批間重復(fù)性較好，變異系數(shù)<10%，操作簡便快速，1h可報(bào)告結(jié)果。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(二)散射比濁法散射光系指一定波長的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復(fù)合物，光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，這種偏轉(zhuǎn)的角度可因光線波長和顆粒大小不同而有所區(qū)別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量呈正比，即待測抗原越多，形成復(fù)合物越多，散射光強(qiáng)度越強(qiáng)。又可分為速率散射比濁法(ratenephelome-try)和終點(diǎn)散射比濁法(endpointnephelometry)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)1.速率散射比濁法(1)原理：是一種抗原抗體結(jié)合動態(tài)測定法。所謂速率是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)過程中，在單位時(shí)間內(nèi)兩者結(jié)合的速度。速率法是測定最大反應(yīng)速率，即在抗原抗體反應(yīng)達(dá)最高峰時(shí)，通常為數(shù)十秒鐘，測定其復(fù)合物形成的量。峰值的高低在抗體過量情況下與抗原的量成正比。峰值出現(xiàn)的時(shí)間與抗體的濃度及其親和力直接相關(guān)。不同抗原含量其速率峰值不同，通過微電腦處理，求出抗原含量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(2)操作步驟：1)用稀釋液將待檢抗原稀釋成一定濃度。2)將稀釋待檢抗原和不同濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品加至試管內(nèi)，再加入一定量抗體，立即比濁，記錄速率單位(RU)。3)以抗原標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，RU值為縱坐標(biāo)，于普通坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測抗原RU值，查出相應(yīng)抗原含量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(3)方法評價(jià)：

檢測不必等到抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡，大大節(jié)約反應(yīng)時(shí)間，每小時(shí)可檢測數(shù)十份標(biāo)本；敏感度高，最小檢出量達(dá)μg/L水平。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)2.終點(diǎn)散射比濁法(1)原理：讓抗原抗體作用一定時(shí)間，使其反應(yīng)達(dá)到平衡后，測定其復(fù)合物的量。復(fù)合物的濁度不再受時(shí)間的影響，但反應(yīng)復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前(大約反應(yīng)數(shù)十分鐘)進(jìn)行濁度測定。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(2)操作步驟1)用稀釋液稀釋待檢抗原和抗原標(biāo)準(zhǔn)品。2)取一定量稀釋待檢抗原液和不同濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液加至試管中，加抗體充分混勻，孵育一定時(shí)間，比濁。3)以抗原標(biāo)準(zhǔn)品量為橫坐標(biāo)，濁度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待檢抗原的濁度值，查出抗原含量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(3)方法評價(jià)：

敏感度達(dá)mg/L水平，可自動化，但反應(yīng)時(shí)間較長免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(三)免疫膠乳比濁法1.原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，則發(fā)生凝集，單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光線可透過，當(dāng)兩個(gè)膠乳凝集時(shí)，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)2.操作步驟1)用稀釋液將待測抗原和抗原標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。2)將抗體致敏膠乳溶液和待測抗原、不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)一段時(shí)間，測吸光度值。3)以抗原標(biāo)準(zhǔn)品量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出待測抗原量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)3.方法評價(jià)

敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應(yīng)液中無PEG沉淀劑的影響，個(gè)體IC對結(jié)果影響也小，所以結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設(shè)備，一般分光光度計(jì)、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)第二節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)(gelphaseprecipitation)主要是指瓊脂糖擴(kuò)散或稱凝膠擴(kuò)散(geldiffusion)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c方法不同，可將固相內(nèi)沉淀驗(yàn)分為3類：①雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(doublegeldiffusiontest)，②單相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(singlegeldiffusiontest)，③凝膠免疫電泳(gelimmuno-electrophoresis)。這是一項(xiàng)凝膠內(nèi)電泳加擴(kuò)散技術(shù)，專門一章介紹。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)一、單相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(一)原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測的抗原物質(zhì)在凝膠中自由擴(kuò)散，與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(二)操作步驟1.將抗體和0.9%瓊脂糖50~56℃混合，即刻傾注成平板。2.待凝固后在瓊脂板上打孔，孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液。3.置37℃，讓其向四周自由擴(kuò)散，24~48h后可見其孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)沉淀環(huán)的直徑與待檢標(biāo)本內(nèi)含量不是直線關(guān)系，有兩種計(jì)算方法：(1)Mancini曲線：適用于大分子抗原，擴(kuò)散時(shí)間>48h，使用普通坐標(biāo)紙作圖，擴(kuò)散環(huán)直徑平方和濃度呈線性關(guān)系。(2)Fehcy曲線：適用于較小分子抗原，擴(kuò)散時(shí)間較短，使用半對數(shù)坐標(biāo)紙作圖，抗原量的對數(shù)和擴(kuò)散圈直徑之間呈線性關(guān)系。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)

(三)方法評價(jià)

單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是一種穩(wěn)定、簡便、毋需特殊設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室均可使用的常規(guī)方法，試驗(yàn)的重復(fù)性和線性均好。敏感度為1.25mg/L。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(四)影響因素1.抗原分子量抗原分子量大，擴(kuò)散慢，沉淀環(huán)較??；抗原分子量小，擴(kuò)散快，沉淀環(huán)相對較大。要求待檢血清和抗原標(biāo)準(zhǔn)品在血清學(xué)上具有均一性，否則可能出現(xiàn)結(jié)果偏高或偏低。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)

2.抗體種類

實(shí)驗(yàn)證明兔抗血清優(yōu)于馬、羊抗血清，兔抗血清可測抗原0.1~1IU/ml，馬抗血清為1~10IU/ml，羊?yàn)?.4~4IU/ml，為提高實(shí)驗(yàn)敏感度，應(yīng)首選敏感度高的抗血清。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)

3.抗體稀釋度

抗體濃度大，沉淀環(huán)小，則敏感度低；抗體濃度小，沉淀環(huán)增大，不同濃度抗原間的差別較顯著，敏感度高。但沉淀環(huán)過大，常造成邊緣糊不清，致使測量誤差也增大。因此要求在沉淀環(huán)清晰的基礎(chǔ)上加大稀釋度以提高敏感度。下圖為抗體分別以1:25、1:50、1:75、1:100稀釋，所形成的4條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)

4.擴(kuò)散時(shí)間

抗原達(dá)到擴(kuò)散終點(diǎn)后，其沉淀環(huán)直徑才與抗原含量呈一定關(guān)系?？乖吭礁?，達(dá)到一定關(guān)系所用擴(kuò)散時(shí)間越長。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)5.擴(kuò)散溫度

在4~37℃范圍內(nèi)，提高溫度加快擴(kuò)散速度，縮短反應(yīng)時(shí)間。但有的沉淀環(huán)僅在低溫下形成，溫度高反而消失。在同一次試驗(yàn)的孵育過程中，要防止溫度急劇變化，以免出現(xiàn)雙圈。6.瓊脂板厚度

瓊脂板厚度增加，沉淀環(huán)面積相應(yīng)縮小。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)二、雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(一)原理將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應(yīng)孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇，在比例合適時(shí)形成可見的白色沉淀線。沉淀線的特征與抗原抗體的濃度、純度和擴(kuò)散速率等有關(guān)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)

(二)操作步驟1.融化瓊脂，澆板每張載玻片約4ml。2.凝固，打孔孔徑3mm，孔間距3~5mm，孔型有雙孔型、三角孔型、雙排孔型和梅花孔型。3.加樣在相對孔內(nèi)加抗原或抗體。4.孵育使抗原抗體自由擴(kuò)散，在兩孔之間抗原抗體相遇，在比例適時(shí)形成可見的沉淀線。沉淀線的數(shù)目、形態(tài)和位置與抗原和抗體的純度、濃度和擴(kuò)散速度有關(guān)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(三)雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的應(yīng)用1.檢測未知抗原或抗體