第五講昆蟲病毒

第五講昆蟲病毒自從1898年貝杰林克（Beijerinck）首次提出“病毒”的概念以來，已經(jīng)過去100多年時間。病毒的種類由最初的幾十種、幾百種，發(fā)展到今天的4000多種

1935年，美國生化學家斯坦利（Stanley）發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒的侵染性能被胃蛋白酶破壞，

一、病毒的特征形態(tài)微小，結構簡單的非細胞結構生物，一種病毒只含有一種核酸核酸蛋白質(zhì)－外殼核衣殼＋封套病毒粒子衣殼粒特征：個體微?。杭{米核酸：單（雙）鏈DNA，單（雙）鏈RNA，蛋白：保護核酸，與侵染有關，含有酶，破壞細胞膜結構封套：可以是細胞質(zhì)膜，也可以是核膜，可以被重組復制：病毒的繁殖方式為復制病毒是專性細胞內(nèi)寄生生物煙草花葉病毒噬菌體昆蟲核型多角體病毒二、病毒分類植物病毒專門寄生在植物細胞里的病毒。動物病毒專門寄生在人或動物細胞里的病毒。細菌病毒（噬菌體）專門寄生在細菌細胞里面的病毒。三、病毒的復制過程四、昆蟲病毒1昆蟲病毒病昆蟲感病后，行動遲緩，取食量降低，后期死亡，一般蟲體倒掛在植物體上昆蟲病毒的特點：昆蟲病毒一般都在細胞內(nèi)形成蛋白質(zhì)包含體家蠶膿病的多角體，就是包涵體的一種。包涵體內(nèi)的病毒粒子只有當它們從包涵體中釋放出來以后，才有侵染宿主細胞的能力。包涵體具有保護病毒免受不良環(huán)境影響的作用。除了形成包涵體的病毒外，還有許多不形成包涵體的昆蟲病毒。

2歷史與現(xiàn)狀1149年我國記載有家蠶高節(jié)病、腫腳病等，膿??；1918年Acqua證明為病毒病1913年White證實了蜜蜂的囊孵病為病毒?。?/p>

Glaser等發(fā)現(xiàn)舞毒蛾的一種病毒病1980年記載了800種昆蟲的1200多種病毒病，到目前有2000種病毒病昆蟲病毒的應用始于1940‘s第一個成功例子，是1949年加拿大偶然引進歐洲云杉葉蜂NPV，流行病，控制害蟲在經(jīng)濟閾值以下。

40-60年代主要應用細菌防治，70年代才利用病毒。俄:黃葉蜂NPV、甘藍夜盜蛾、舞毒蛾、美國白蛾、天幕毛蟲等。捷:美國白蛾GV法:松帶蛾CPV日:1974年注冊了赤松毛蟲CPV，直升飛機噴灑。還對茶小卷葉蛾、茶卷葉蛾GV進行研究利用。埃及、中:斜紋夜蛾NPV新西蘭:牧草蝙蝠蛾WNPV

斐濟:獨角仙病毒我國，始于60年代，先是調(diào)查、收集，70年代后做了大量工作。1971年，棉鈴蟲NPV在美國成為第一個商品化制劑，1987年我國也將此病毒投入商品化生產(chǎn)。美國加強了對舞毒蛾、黃杉毒蛾、苜蓿尺蠖等NPV的研究。從防治對象來看，可分為二個階段:40年代到60年代，食葉性森林害蟲；70年代后，農(nóng)業(yè)害蟲。國際上:至少有60多株進入大田應用或示范，約20多株制成殺蟲劑，僅就俄羅斯而言，1990年已有14種病毒殺蟲劑，其中有7種年總產(chǎn)量為60多噸，防治面積150萬公頃。從病毒生產(chǎn)方式，二個階段:40年代到60年代，野外采集；人工飼養(yǎng)蟲到殺蟲劑。北京、廣東(斜紋夜蛾NPV)、武漢、華東(棉鈴蟲NPV)都進行過卓有成效的工作。我國有20株進入大田應用或示范，7株制成制劑，先后建立5座工廠，一種新的生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)。湖北武大綠洲生物技術有限公司：武漢大學，海南綠舟、圣威德投資有限公司

河南濟源生物科技有限公司W(wǎng)1-78GV:武漢大學研制，在全國不同經(jīng)緯度的20多個省市，防效80-96％，油桐尺蠖NPV:(科學院病毒所):8省20多個地區(qū)，2500畝次，86.97-94.82％。

棉鈴蟲NPV:1985。飛防，40-60萬畝

斜紋夜蛾NPV:廣州，20-30條/畝+100斤水+0.01％洗衣粉，北京。

舞毒蛾NPV:遼寧、黑龍江。

馬尾松毛蟲NPV、CPV:廣東?！案＝ㄒ惶枴?省茶科所。6000畝，70-95％每畝減少農(nóng)藥費用20-50元，為我省發(fā)展無農(nóng)藥污染優(yōu)質(zhì)茶葉，擴大茶葉出口創(chuàng)造條件。尤其是昆蟲濃核病毒(DNV)不斷被發(fā)現(xiàn)。我國在短短12年內(nèi)就發(fā)現(xiàn)了3種DNV，它毒力強，潛伏期短，易流行，但研究甚少，值得探討?；煊?棉鈴蟲NPV+西維因；舞毒蛾NPV+DDT；8010+GV。我國至70年代發(fā)現(xiàn)56株病毒。80年代立項，至1991年已從188種昆蟲中分離到291株，其中110株為國際首次發(fā)現(xiàn)，按ICTV分類，它們分屬4個科:桿狀、痘、細小、呼腸孤和尚未分類的小型球狀RNA病毒。出版了《中國昆蟲病毒圖譜》(1986)，目前有200-250種，2004年，報道有近2000種，病毒資源的調(diào)查是研究開發(fā)昆蟲病毒生防的先導，是建立我國病毒資源庫的基礎，今后應繼續(xù)采集、分離與鑒定。全球注冊的病毒殺蟲劑30多個，中國9個，美國6個，歐共體10個，俄羅斯11個五、病毒生物農(nóng)藥的優(yōu)點①選擇性好，僅能寄生一種或少數(shù)同科同屬親緣相近的昆蟲種類，不損傷天敵，不易引起生態(tài)平衡的破壞。②傳播性強:很快擴散蔓延，造成流行病，能垂直傳播，造成區(qū)域流行病。③持久性久:“利在當代，功在千秋”包涵體可抵抗不良環(huán)境，具有非常好的穩(wěn)定性，是自然環(huán)境中的一部分，能起長期控制作用。④經(jīng)濟效益高:劑量低，使用簡便。⑤安全性六、常見昆蟲病毒與分類1）雙鏈DNA：桿狀病毒科、痘病毒科、多分病毒科、泡囊病毒科和虹彩病毒科；2）單鏈DNA病毒中的細小病毒科；3）雙鏈RNA病毒，其中有呼腸孤病毒科、二分RNA病毒科；4）單鏈RNA病毒，其中有微RNA病毒科、野田村病毒科和T四病毒科；5）DNA和RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒，包括前病毒科和變位病毒科

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒可用于防治十字花科蔬菜等多種作物甜菜夜蛾。

斜紋夜蛾核型多角體病毒可用于防治十字花科蔬菜等多種作物斜紋夜蛾。

棉鈴蟲核型多角體病毒可用于防治為害多種作物的棉鈴蟲。

荼足蠖核型多角體病毒可用于防治茶樹茶尺蠖。

油桐足蠖核型多角體病毒可用于防治茶樹茶尺蠖。

小菜蛾顆粒體病毒可用于防治十字花科蔬菜小菜蛾。

幕青蟲顆粒體病毒可用于防治十字花科蔬菜菜青蟲。

草原毛蟲核多角體病毒可用于防治草原毛蟲。七、昆蟲病毒的新方向1病毒－昆蟲細胞培養(yǎng)體系2病毒的分子生物學：抗凋亡，基因圖譜3昆蟲病毒表達載體4應用研究CANCERTHERAPY:AssociateProfessorWangShu(extremeleft)withgraduatestudentsMrRamVinodRoyandMrYangJingyeresearchoninsectvirusasvectors.AssociateProfessorWang'sresearchhasshowninvitroandinvivo,thatthebaculovirusisanexcellentvectorforcarryingtherapeuticgenesintothebrain--enablingthetherapeuticgenestoreachtheirtargetstoeliminatetumourcells.SystemicspreadofanRNAinsectvirusinplantsexpressingplantviralmovementproteingenesProc.Natl.Acad.Sci.USA87,434–438

Flockhousevirus(FHV),asingle-strandedRNAinsectvirus,haspreviouslybeenreportedtocrossthekingdombarrierandreplicateinbarleyprotoplastsandininoculatedleavesofseveralplantspecies。昆蟲病毒增效蛋白來源于昆蟲病毒，曾被稱之為病毒促進因子、病毒增強因子(viralenhancingfactor)、增強因子(enhancin)或病毒增強素(synergisticfactor)，現(xiàn)統(tǒng)稱增效蛋白(enhancingprotein)。Tanada(1959)首次發(fā)現(xiàn)美洲粘蟲(Pseudaletia

unipuncta,Pu)顆粒體病毒(granulosisvirus，GV)對其核型多角體病毒(nuclearpolyhedrosisvirus，NPV)存在增效作用。

增效蛋白是由病毒基因編碼的一種磷脂蛋白。目前研究認為，增效蛋白主要通過二種方式達到增效作用：一是發(fā)揮金屬蛋白酶的活性,降解昆蟲中腸圍食膜上的腸粘蛋白和糖蛋白,從而破壞圍食膜的物理屏障,使病毒粒子更易進入中腸細胞,增加病毒的相對感染量;二是改變中腸圍食膜的通透性和孔徑大小,使毒力蛋白和病毒粒子更易通過圍食膜,感染宿主昆蟲重組病毒殺蟲劑

隨著分子生物學技術的迅猛發(fā)展，對昆蟲病毒的遺傳改良的研究成為昆蟲病毒殺蟲劑研究的熱點，一是嵌入對昆蟲有特異性的毒素基因。如Bt毒素基因、利尿激素基因、保幼激素酯酶基因和螨、蝎、蜘蛛及蜂毒的神經(jīng)毒素基因；二是通過對野生型病毒基因組中的egt基因進行缺失改造來改善殺蟲效果和殺蟲時間；三是在昆蟲病毒中嵌入增效蛋白基因，以增強病毒的感染性，達到增效的目的。

昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)具有安全性高，對外源基因克隆容量大，重組病毒易于篩選，具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)和高效表達外源基因的能力等特點，現(xiàn)已成為基因工程四大表達系統(tǒng)

對病毒的基因研究,主要集中在引入可編碼具有殺蟲作用的神經(jīng)毒素、利尿激素、羽化激素、蝎子毒素、肽或酶的NPV病毒基因,在不影響病毒本身功能的條件下增強其毒力;或刪除能延長被侵染幼蟲生命的基因等以加快毒殺速度和擴大寄主范圍。主要包括以下幾種：①插入神經(jīng)毒素、激素和酶基因；②異源重組昆蟲病毒；③修飾昆蟲病毒本身基因。當前被認為最有應用前景的是神經(jīng)毒素工程病毒,包括蝎子、螨類和蜘蛛的神經(jīng)毒素。這類毒素可迅速將昆蟲麻痹,使之停止取食和為害作物,而昆蟲病毒可以繼續(xù)增殖,殺死寄主。利用植物病毒進行抗病育種以黃瓜花葉病毒（CMV）和地黃花葉病毒（ReMV）的MP基因為研究對象,通過對MP基因不同區(qū)域的改造、植物表達載體的構建以及對煙草和番茄的遺傳轉(zhuǎn)化，探索了CMV和MeMVMP基因介導抗病性的可能性，復制酶即特異性依賴于病毒RNA的RNA多聚酶。是病毒基因組編碼的自身復制不可缺少的部分，特異地合成病毒的正負鏈RNA，改造后的復制酶失去活性中心，從而抑制病毒的繁殖利用衛(wèi)星病毒：競爭復制酶反義RNA：3′-末端序列互補的反義RNA

核酶：一種高效特異的RNA內(nèi)切酶，其結構包括一個幾乎完全相同的17個高度保守核苷酸序列，其中有3對堿基配對形成的莖和環(huán)結構，整個結構很象一個錘頭，具自我切割的活性，錘頭結構是自身切割活性的結構基礎。

RNA干擾（RNAinterference,RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。2006年諾貝爾獎醫(yī)學/生理學獎獲得者之一Andrew

Z.

Fire領導完成Andrew

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FireCraigC.Mello1998年2月正式在《自然》雜志上發(fā)表論文，公布了有關RNA干擾機制的發(fā)現(xiàn)。病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內(nèi)，并利用宿主細胞進行轉(zhuǎn)錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（大約21～23bp），即siRNA。siRNA在細胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC與外