氨基酸紙層析

實驗三

氨基酸紙層析

學時：31/15/20231

1、通過氨基酸的分離，學習并掌握紙層析的原理和操作技術(shù)；2、掌握分配層析法；3、掌握影響分配系數(shù)的因素。一、實驗目的：1/15/20232層析技術(shù)(chromatography色譜技術(shù))一、發(fā)展史：層析分離技術(shù)在20世紀初就已得到應用：1903年用于植物色素的分離,各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”1931年用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體；1944年出現(xiàn)了以濾紙作為支持物的紙層析；20世紀六十年代末出現(xiàn)了高效液相色譜(HPLC)。1/15/20233二、定義

層析技術(shù)是根據(jù)被分離的混合物中各組分的理化性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中進行分配。

層析的基本概念1/15/20234固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液）。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。

層析的基本概念1/15/20235三、層析技術(shù)的種類1、按流動相的狀態(tài)分類：

（1）液相層析（色譜）（2）氣相層析（色譜）；2、按固定相的使用形式分類：

（1）柱層析（2）紙層析（3）薄層層析；3、按分離過程所主要依據(jù)的物理化學性質(zhì)分類：

（1）吸附層析（2）分配層析（3）離子交換層析（4）凝膠層析（5）親和層析等。1/15/20236紙層析法：是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上羥基具有親水性，因此吸附水作為固定相，通常把有機溶劑作為流動相。

將樣品點在濾紙上，進行展層，樣品中的各種氨基酸在兩相溶劑中不斷進行分配。由于它們的分配系數(shù)不同，不同氨基酸隨流動相移動的速率就不同，于是就將這些氨基酸分離開來，形成距原點不等的層析點二、實驗原理:1/15/20237分配層析法：

利用物質(zhì)在兩種或兩種以上不同的混合溶劑中的分配系數(shù)不同，而達到分離目的的一種實驗方法。在一定條件下，一種物質(zhì)在某種溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)α是一個常數(shù)。

溶質(zhì)在固定相的濃度(Cs)分配系數(shù)α=

溶質(zhì)在流動相的濃度（Cl)1/15/20238溶劑系統(tǒng)：正丁醇：甲酸：水=15：3：2

固定相：水和濾紙纖維素有較強的親和力，因而其擴散作用降低形成固定相;

流動相：有機溶劑和濾紙親和力弱，所以在濾紙毛細管中自由流動，形成流動相。由于混合液中各種氨基酸的α值不同，所以移動速率（即遷移率Rf值）就不同，從而達到分離的目的。1/15/20239

移動速率(比移值)：

原點到層析點中心的距離

Rf=

原點到溶劑前沿的距離1/15/2023101、實驗材料：

谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標準品2、儀器：

(1)毛細管(2)電熱吹風機(3)層析缸(4)層析濾紙(5)小型玻璃噴霧器(6)鉛筆、直尺等。3、試劑：(1)氨基酸標準溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、組氨酸標準品。(2)溶劑系統(tǒng)：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（體積比）搖勻；(3)顯色劑：0.25%的茚三酮丙酮溶液。三、實驗材料、儀器和試劑：1/15/202311①層析濾紙的準備

用鉛筆在層析濾紙上距離一端2cm處劃線并標記點樣位置。

②點樣(少量多次)

用毛細管平口端蘸取少量樣品溶液，點樣于濾紙的相應位置，要求樣品斑點直徑不超過0.3cm，干燥后再點樣，重復3次。

③展層

將濾紙放入層析缸，使濾紙浸入液面以下，但不要使液面沒過點樣線。展層50-60分鐘。(縫線，圓筒狀0.5cm縫隙）

④顯色

濾紙吹干，用噴霧器把茚三酮溶液均勻細致地噴灑在濾紙有效面上，吹干。1/15/2023121、樣品的準備：

稱取谷氨酸、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸標準品各1mg混合溶于10%異丙醇中，0.01M。

2、濾紙的準備：

取一長方形濾紙，在濾紙橫向?qū)膬蛇?，距邊?cm處，各畫兩條平行線，一條作前沿標志，一條作點樣線，在點線上每隔2cm畫一個“+”作為點樣位置，共5個點。四、實驗步驟：

1/15/2023131/15/202314

3、點樣：

用毛細管點樣，中間點混合氨基酸，兩側(cè)點四種標準氨基酸；每個，每點一次用晾干后再點下次，點樣點的直徑應控制在2mm左點樣點重復點5次右，點樣完畢用大頭針將濾紙做成筒形，點樣面向外。

1/15/2023151/15/2023161/15/2023174、展層：

向?qū)游龈字屑尤雽游鋈軇好娌灰^點樣線，（高約1.5cm，約50ml溶劑）將濾紙點樣點朝下放入層析溶劑中，將層析缸密閉，待溶劑到達標志線后取出冷風吹干。5、顯色：

用噴霧器將0.25％茚三酮顯色劑均勻噴在濾紙上，熱風（加快反應）反應吹干顯色。1/15/202318五、實驗結(jié)果與計算：

1、用鉛筆將層析色譜輪廓和中心點描出來；2、測量原點至色譜中心和至溶劑前沿的距離，計算各種已知氨基酸和未知氨基酸的Rf值。3、分析混合樣品中未知氨基酸的組分。

1/15/2023191/15/202320Rf=X/Y1/15/202321用鉛筆描出色斑輪廓，找出中心點。如果斑點形狀不規(guī)則或出現(xiàn)明顯的“拖尾”，則圈出顏色集中均勻的部分。計算各色斑的Rf值,對照標準樣品，確定混合樣品中氨基酸組成。1/15/202322Rf=原點到層析中心的距離(a)原點到溶劑前沿的距離(b)影響Rf值的因素：

濾紙質(zhì)地和水飽和程度物質(zhì)極性溶劑純度、pH和含水量層析溫度和時間

ab1/15/202323氨基酸雙向紙層析1/15/202324影響Rf值的主要因素：Rf決定于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比。由于在同一實驗條件下，兩相體積比是一常數(shù)，所以主要決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)分配系數(shù)不同，Rf也就不同。（1）物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性：物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同極性不同，在兩相中的溶解度也就不同，物質(zhì)的極性決定了物質(zhì)在水和有機溶劑之間的分配系數(shù)，極性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之,Rf則較大。1/15/202325（2）層析溶劑：首先，溶劑的純度要高。其次，溶劑系統(tǒng)選擇應考慮被分離的物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的Rf在0.05～0.85。再次，溶劑系統(tǒng)必須新鮮配制，如正丁醇-甲酸-水系統(tǒng)久放易引起酯化。（3）pH值：

溶劑、濾紙和樣品的pH值都會影響物質(zhì)的解離，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使Rf改變；

1/15/202326（4）濾紙：層析濾紙由高純度棉花制成，要求濾紙要清潔，質(zhì)地均一，厚薄一致，纖維松緊度適中，具有一定的機械強度，要被溶劑所飽和。不同型號的濾紙，其厚薄程度、纖維松緊度各不相同，因此，濾紙纖維結(jié)合水的量不一樣，兩相的體積比也就不同，Rf也不同；另外，濾紙的雜質(zhì)也會影響Rf，必要時進行預處理（可用0.01～0.4M的HCl處理除去金屬離子）.

1/15/202327（5）室驗室的溫度和時間:

溫度影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，即影響分配系數(shù)；也影響濾紙纖維的水合作用從而影響固定相的體積；也影響溶劑系統(tǒng)的含水量，即影響流動相的組分比例。層析必須在恒溫條件下進行。

1/15/202328（6）展開方式：

上行法Rf小；下行法（層析