細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)1第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)

2一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy

普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）3普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)分辨率（即分辨極限,D）是指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離.習(xí)慣說(shuō)的分辨率高則是指該分辨極限小；人眼的分辨率：100m，光學(xué)顯微鏡的最大分別率：0.2m.放大倍數(shù):光學(xué)顯微鏡在用空氣作介質(zhì)時(shí),最大放大倍數(shù)為1000倍,用油鏡時(shí)為1400倍.4熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）原理與應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

5激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)激光共聚焦掃描顯微鏡用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像。經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。圖1圖26laserconfocalscanningmicroscope,LCSM7LCSMImageofaXenopus

Melanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)http:///8暗視野顯微鏡

darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野背景是黑的，物體邊緣是亮的?？捎^察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。9把透過(guò)標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處:環(huán)形光闌：位于光源與聚光器之間。相位板：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。這種顯微鏡最大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）由P．Zernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。圖相差顯微鏡10用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本11二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識(shí)電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）1932年德國(guó)學(xué)者M(jìn)axKnolls和ErnstRuska用波長(zhǎng)比光短得多的電子作光源,發(fā)明了第一臺(tái)電子顯微鏡，大大提高了顯微鏡的分辨率，開拓了超微世界。12電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領(lǐng)

光

源

透

鏡

真

空

成像原理

人眼

100m

可見光

光學(xué)顯微鏡

0.2m

可見光

(波長(zhǎng)400～700nm)

利用樣本對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化

0.1m

紫外光

玻璃透鏡

不要求真空

電子顯微鏡

接近0.1nm

電子束

(波長(zhǎng)0.01～0.9nm)電磁透鏡

1.33×10-5～1.33×10-3Pa

利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差

13電鏡與光鏡光路圖比較光源聚光鏡樣品物鏡目鏡直接成像電源聚光鏡樣品物鏡目鏡熒光屏上觀察圖象電源透鏡透鏡樣品熒光屏上觀察圖象射線掃描器光學(xué)顯微鏡透射電鏡掃描電鏡14電子顯微鏡的基本構(gòu)造15透射電子顯微鏡TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM16主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）圖

染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu) 冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）技術(shù)示意圖 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來(lái)觀察膜斷裂面 的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合 而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技 術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)——主要研究生物大分子空間結(jié) 構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。17電鏡樣品的制備18負(fù)染色技術(shù)用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria

1920掃描電鏡（SEM）原理與應(yīng)用：

掃描電子顯微鏡于20世紀(jì)60年代問(wèn)世，用來(lái)觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。工作原理是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說(shuō)與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)來(lái)控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問(wèn)題。圖1圖2圖3圖421Scanningelectronmicroscope（SEM）22人類血細(xì)胞SEM照片圖片來(lái)自http:///23酵母24人類精子25三、掃描隧道顯微鏡原理：量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)特點(diǎn)：（1）分辨本領(lǐng)高，（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，

縱分辨率可達(dá)0.001nm）； （2）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作； （3）非破壞性測(cè)量樣品的完整外貌。用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具26STMimageofaDNAmolecule27第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

離心分離技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)28一、離心分離技術(shù)

用途：

離心是研究如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體等細(xì)胞器，以及各種大分子基本手段。一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)速為10000-25000r/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速超過(guò)25000r/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)80000r/min，離心力超過(guò)500Kg。

差速離心密度梯度離心

29（一）、差速離心在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。30（二）、密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。31速度沉降主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。32二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。331.Schiff反應(yīng)：分子中的醛基可使Schiff試劑中的無(wú)色品紅變?yōu)樽霞t色。這種反應(yīng)通常用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）.DNA的福爾根反應(yīng)2.脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。3.茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。4.金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應(yīng)過(guò)程中生成有色沉淀，借以辨認(rèn)所檢查的物質(zhì)或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。34三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術(shù)：根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，并標(biāo)上標(biāo)記熒光素，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。蛋白電泳(SDS）與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)免疫電鏡技術(shù)：能有效提高樣品的分辨率，在超微結(jié)構(gòu)水平上研究特異蛋白抗原的定位。免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過(guò)對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等35四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性光鏡水平的原位雜交技術(shù):同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針電鏡水平的原位雜交技術(shù):生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）在體外將目標(biāo)DNA大量擴(kuò)增,以便分析.

36人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片37五、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。步驟：前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）

———放射自顯影38六．定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)

流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

39其主要工作原理是：經(jīng)熒光染色的單細(xì)胞懸液被高壓壓入流動(dòng)室內(nèi)，在PBS或生理鹽水等殼液(SheathFluid)的包裹和推動(dòng)下形成單細(xì)胞狀態(tài)，并以每分鐘5000—10000個(gè)細(xì)胞的高速度從流動(dòng)室內(nèi)噴出。在與細(xì)胞束呈90°角的方向，受到來(lái)自氬離子激光器的激光束照射而激發(fā)熒光。通過(guò)各種物鏡及濾光片將從不同角度收集的熒光投射到光電倍管并轉(zhuǎn)換為各種強(qiáng)弱不等的電脈沖信號(hào)顯示出來(lái)。這些信號(hào)輸?shù)诫娮佑?jì)算機(jī)中貯存，經(jīng)處理和分析便可得到多種信息參數(shù)。進(jìn)行細(xì)胞分類時(shí)，根據(jù)需要對(duì)含細(xì)胞的水滴選擇性充電，在帶有高電壓的偏轉(zhuǎn)板作用下，帶正電荷的水滴落入左方收集管內(nèi)，帶負(fù)電荷的水滴落入右方收集管內(nèi)，不帶電荷的水滴進(jìn)入中間的收集管。分類主要根據(jù)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，即單細(xì)胞DNA含量。圖40流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)41細(xì)胞顯微分光光度術(shù)

原理：細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。例如，核酸的吸收波長(zhǎng)為260nm，而蛋白質(zhì)的則為280nm。有的成分經(jīng)組織化學(xué)染色后，對(duì)可見光有特定的吸收光譜。

應(yīng)用：根據(jù)細(xì)胞成分所具有的這種特性，可利用顯微分光光度計(jì)對(duì)某些成分進(jìn)行定位、定性，甚至定量測(cè)定。

42第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞工程43一、細(xì)胞的培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞

繼代培養(yǎng)細(xì)胞

細(xì)胞株

細(xì)胞系

植物細(xì)胞

類型： 原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細(xì)胞培養(yǎng)）

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）非細(xì)胞體系44原代培養(yǎng)（primaryculture）：也叫初代培養(yǎng)，指直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)（subculture）的細(xì)胞，便不再稱為原代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。傳代（passage）：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞的“一代”，不表示細(xì)胞分裂一次，而是指培養(yǎng)細(xì)胞從接種到再次轉(zhuǎn)移培養(yǎng)的過(guò)程。在一次傳代培養(yǎng)中，細(xì)胞能倍增3-6次。45細(xì)胞系（cellline）：原代培養(yǎng)物成功傳代后，則稱之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為有限細(xì)胞系（finitecellline）；已獲無(wú)限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系（infinitecellline）。無(wú)限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無(wú)異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性。