通過單克隆抗體技術(shù)識(shí)別肉的種類以及加熱肉品終點(diǎn)溫度的確認(rèn)

通過單克隆抗體技術(shù)處理加熱過的肌肉蛋白質(zhì)來識(shí)別肉的種類以及加熱肉品終點(diǎn)溫度的確定

Y-H.P.Hsieh,F.C.Chen,和N.djurdjevic

Auburn大學(xué)食品科學(xué)和營養(yǎng)系

AuburnAlabana36849

肉制品的質(zhì)量和安全已引起消費(fèi)者以及管理機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注。在生肉制品質(zhì)量控制，加強(qiáng)食物安全和分類管理方面酶連免疫吸附技術(shù)(ELISA)被認(rèn)為是一種十分有效和適合的檢測(cè)分析方法，為了定量的確定加熱產(chǎn)品中攙雜肉的全部種類,在ELAISA技術(shù)中,許多單抗體已經(jīng)被逐漸探索應(yīng)用。在作用于加熱處理過的肌肉蛋白質(zhì)的過程中，單抗體技術(shù)已經(jīng)得到發(fā)展.隨著加熱終點(diǎn)溫度的增ELISA反應(yīng)的程度也隨之增加，可以用MABS(單克隆抗體技術(shù))來檢測(cè)肉品中特定的肉種類。因此,MABS可以用作決定預(yù)煮肉品的最大內(nèi)部加熱溫度，以此來確保產(chǎn)品的安全性.在本節(jié)中主要介紹了現(xiàn)行的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作過程,特點(diǎn)以及MABS的應(yīng)用。1．

介紹

因?yàn)榻?jīng)濟(jì)的損失，食物過敏及宗教信仰方面的因素，肉品中攙雜不明肉類在很大程度上欺騙了消費(fèi)者。聯(lián)邦法律要求肉制品必須貼上標(biāo)簽以證明包含肉的種類。在許多國家已報(bào)道了肉類替代現(xiàn)象，例如在英國馬肉被用作牛肉羊肉。馬肉和袋鼠肉在加拿大發(fā)現(xiàn)被用作出口的牛肉。豬肉被用作牛肉和羊肉出口到中東地區(qū)。隨著食品企業(yè)中機(jī)械去骨肉使用量的增加，最近,人們已越發(fā)的關(guān)注多種加工過程和預(yù)煮肉類以及分割肉產(chǎn)品。美國農(nóng)業(yè)部食品安全和檢測(cè)服務(wù)局（USDFA-FSIS）的管理?xiàng)l例中對(duì)使用機(jī)械分割肉做了如下的規(guī)定：只要求使用一類肉的肉制品中不要包含任何別的種類的機(jī)械分割肉。然而，由于不正當(dāng)?shù)慕灰缀腿珖越?jīng)濟(jì)欺騙現(xiàn)象的存在，國內(nèi)零售市場(chǎng)中在魚及陸生動(dòng)物肉類產(chǎn)品中混入不知名的雜肉已成為一種普遍現(xiàn)象。研究表明煮制品比原料制品存在更高的攙雜現(xiàn)象，在一種產(chǎn)品中加入多種不知名的肉類也是一個(gè)十分普遍的現(xiàn)象。肉類應(yīng)被煮制足夠的時(shí)間，有利于人類的消化吸收，也可以確保消滅其中的病原微生物。在食用鮮肉和禽類制品時(shí)不正當(dāng)?shù)呐胝{(diào)被認(rèn)為是引起傳染疾病的一個(gè)主要因素。USDA-FSIS已特別規(guī)定肉制品加熱過程的指導(dǎo)方針,對(duì)于每種肉應(yīng)有多種預(yù)煮制品。例如，未干制的禽類制品中心溫度必須加熱到71.1℃，而干制的禽類制品也必須加熱到68.3℃來殺死沙門氏菌.為了確保消除大腸桿菌O157，烤牛肉的PH值.應(yīng)控制在7左右加熱溫度68.3℃。別的制品PH值為7，加熱溫度為71.7℃。鮮豬肉加熱時(shí)內(nèi)部溫度應(yīng)達(dá)到76.7℃，而且殺死旋毛蟲溫度應(yīng)至少比此溫度再高17℃。然而，一旦肉品中攙雜了別的不知名肉類，由于不知名肉類的存在對(duì)于特定種類的最低內(nèi)部加熱溫度也就失效了。為了阻止肉類的攙雜和減少由于不足夠加熱過程引起的食物傳染疾病的危害，對(duì)于管理監(jiān)督部門來講,采用可靠分析方法來執(zhí)行肉類管理程序是十分必要的。最理想的方法具有特定，反應(yīng)靈敏，快速，經(jīng)濟(jì)性，高檢測(cè)率的特點(diǎn)，并且能夠提供量性的結(jié)果。盡管在每一種條件下單一的方法并不一定能夠滿足所有的要求，但選擇ELISA用于肉類的檢測(cè)可以滿足最多的要求。多克隆抗（PABS）和單克隆抗體（MABS）技術(shù)都已用在ELISA中，MABS比PABS有更多的優(yōu)點(diǎn)：連續(xù)使用，穩(wěn)定的特性和免疫試劑相近性。在免疫分析中使用MABS可以提供獨(dú)一無二的試劑，并且可以減少分析的費(fèi)用，MABS已被用在原料肉種類的鑒定。因?yàn)樽饔糜谡顟B(tài)下蛋白質(zhì)的抗體在大多情況下不能識(shí)別加熱處理后肉中的蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)室中使用MABS來檢測(cè)加熱肉品中攙雜的肉的種類。在全部加熱處理過的肉品混合物中MABS可以對(duì)目標(biāo)品種的含量就行定量檢測(cè)，而且可以決定預(yù)煮肉的最大中心加熱溫度。我們主要討論MABS的實(shí)驗(yàn)操作過程特性和它的應(yīng)用.在本章中也對(duì)這兩種領(lǐng)域內(nèi)的現(xiàn)行方法進(jìn)行了大概的評(píng)價(jià)2攙雜肉品種類的確認(rèn)\

2.1非免疫學(xué)方法

在過去的二十年中，許多用于確認(rèn)肉品種類的非免疫方法例如電泳和色譜層析已經(jīng)有了很大的發(fā)展。對(duì)于蛋白質(zhì)的分離電泳技術(shù)是十分有效的，不同的肌肉蛋白質(zhì)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）經(jīng)常產(chǎn)生相同的蛋白類型，所以在肉種類確認(rèn)方面它的可信度十分的小。等吸附技術(shù)基于蛋白質(zhì)不同的等電點(diǎn)可以把蛋白質(zhì)依據(jù)不同種類而分開，這種技術(shù)被廣泛用于確認(rèn)魚肉的的種類類，也也可以以用于于區(qū)分分不同同種類類的原原料肉肉。但但是，，當(dāng)混混合肉肉中存存在多多種肉肉或蛋蛋白添添加劑劑時(shí),很難難解釋釋其檢檢測(cè)結(jié)結(jié)果。。色譜譜法如如氣相相色譜譜,液液體色色譜和和高精精度色色譜已已經(jīng)被被廣泛泛用于于肉種種類的的確認(rèn)認(rèn)，這這種方方法是是基于于對(duì)肉肉樣中中脂肪肪酸成成分，，組氨氨基酸酸或蛋蛋白質(zhì)質(zhì)形狀狀的檢檢驗(yàn)來來實(shí)現(xiàn)現(xiàn)的。。這些些方法法可以以區(qū)分分不同同個(gè)體體肉的的種類類，但但是由由于色色譜類類型復(fù)復(fù)雜度度的增增加，，這些些方法法在檢檢測(cè)復(fù)復(fù)合肉肉品中中摻雜雜肉的的種類類時(shí)會(huì)會(huì)失效。。隨著分分子生生物學(xué)學(xué)技術(shù)術(shù)的高高速發(fā)發(fā)展，，包括括DNA雜交交技術(shù)術(shù)，聚聚合酶酶鏈反反應(yīng)應(yīng)和碎碎片分分析技技術(shù)已已對(duì)法法醫(yī)學(xué)學(xué)產(chǎn)生生了革革命命性的的變革革，對(duì)對(duì)于食食品科科學(xué)也也是如如此。。DNA雜雜交技技術(shù)已已被用用于多多中肉肉類品品種的的確確認(rèn),下一一步準(zhǔn)準(zhǔn)備也也進(jìn)行行基因因組DNA或克克隆隆DNA同同目標(biāo)標(biāo)DNA的的雜交交，同同時(shí)用用顏色色或自自行x射線線照相相技術(shù)術(shù)進(jìn)行行檢測(cè)測(cè)工作作。這這些方方法在在用于于煮制制肉類類品種種確確認(rèn)方方面面是獨(dú)獨(dú)特的的并且且十分分有用用,但但是是在確確認(rèn)聯(lián)聯(lián)系密密切肉肉類時(shí)時(shí)效效果不不好下下一步步準(zhǔn)備備顯示示牛，，綿綿羊，，山羊羊基因組組DNA水水平上上的的相互互交叉叉反應(yīng)應(yīng)。通通過混混合未未標(biāo)記記DNA修修飾DNA雜雜交可可以減減少交交叉反反應(yīng)，，從從而而可以以從交交叉雜雜交種種類中中區(qū)分分綿羊羊和山山羊，，大約約有10﹪的的區(qū)別別限限度。。綿羊羊和山山羊肉肉類類的區(qū)區(qū)分是是使用用直接接連續(xù)續(xù)技術(shù)術(shù)來對(duì)對(duì)比核核苷苷酸的的次序序而實(shí)實(shí)現(xiàn)的的，同同時(shí)時(shí)也分分析了了限制制核苷苷酸內(nèi)內(nèi)切酶酶聚合合酶鏈鏈反應(yīng)應(yīng)的產(chǎn)產(chǎn)物，，由由于費(fèi)費(fèi)用高高和操操作的的復(fù)雜雜性，，這些些基于于DNA水水平平的技技術(shù)未未被常常規(guī)分分析方方法所所采納納。2.2免免疫學(xué)方法法免疫學(xué)方法法是基于特特定抗體－－抗原反應(yīng)應(yīng)，它適用用于分析復(fù)復(fù)雜混合物物中的成分分，同時(shí)此此成分有最最低的檢測(cè)測(cè)量。從本本世紀(jì)開始始，免疫技技術(shù)已被用用于動(dòng)物肉肉類品種的的確認(rèn)。免免疫技術(shù)的的先進(jìn)之處處在于它可可以在很大大程度是提提高檢測(cè)的的敏感性和和結(jié)果的準(zhǔn)準(zhǔn)確性。沉沉淀環(huán)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)是免疫分分析方法的的一個(gè)簡(jiǎn)單單形式，它它的原理是是在實(shí)驗(yàn)管管中抗血清清和肉的抗抗原相匯處處可產(chǎn)生可可見的環(huán)。血血凝抑制實(shí)實(shí)驗(yàn)是基于于阻止抗原原血清清和它它的同類抗抗原之間積積極的反應(yīng)應(yīng)，而此同同種類抗原原被同種外外來羊的紅紅血細(xì)胞所所包裹。瓊瓊脂膠體免免疫擴(kuò)散，，雙層免疫疫擴(kuò)散技術(shù)術(shù)起源于Ouchyeriony(1948)的描述述，同時(shí)也也涉及抗血血清和抗原原在半固體體瓊脂膠體中的擴(kuò)擴(kuò)散。經(jīng)過過隔夜培養(yǎng)養(yǎng)后在抗體體和它對(duì)應(yīng)應(yīng)的抗原相相匯處形成成一個(gè)可見見的不透光光的帶。USDA-FSIS肉類檢查查員對(duì)這種種技術(shù)做了了一定的修修繕，使用用標(biāo)定的試試劑紙片和和提前準(zhǔn)備備的瓊脂平平板使此種種技術(shù)在檢測(cè)測(cè)原料肉的的種類時(shí)更更加便利.由于瓊脂脂凝膠免疫疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)驗(yàn)靈敏性易易變化，培培養(yǎng)的時(shí)間間長(zhǎng)，并且且非肉的成成分干擾大大，所以限限制了它在在完整鮮肉肉分析中的的應(yīng)用。免免疫分析經(jīng)經(jīng)常用在臨臨床處置中中，但是一一項(xiàng)研究指指出,用I標(biāo)記免免疫試劑檢檢測(cè)出牛牛肉中存在在5﹪的其其他成分分。由于于放射免免疫分析技技術(shù)要用有有害的放射射材料，并并且要用閃閃爍計(jì)數(shù)器器，所以限限制了它在在日常檢驗(yàn)和檢測(cè)測(cè)肉種類中中的應(yīng)用。。ELISA由于下面面的優(yōu)點(diǎn)而而在肉種類類的確認(rèn)中得得到了十分分廣泛的應(yīng)應(yīng)用：不用用太貴的科科學(xué)儀器，，易于操作作，免疫試試劑用量小小，可應(yīng)用用于大數(shù)量量，寬領(lǐng)域域的檢測(cè)。。經(jīng)常應(yīng)用用的有三種種類型:間間接ELISA競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)，ELISA,夾夾心ELISA。間間接ELISA,先把抗原原吸入一個(gè)個(gè)微量平板板上，之后后相反動(dòng)物物的抗體與與抗原結(jié)合合吸附在固固體層上，，通過二者者與隨后加加入的反免免疫球蛋白白的結(jié)合，，通過外來來添加酶而而形成的顏顏色.它可可以檢測(cè)到到抗原與抗抗體的結(jié)合合物。競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)ELISA技技術(shù)是基基于提取樣樣品中有限限的抗體，而自由由抗原和與與固體相結(jié)結(jié)合的抗抗原與抗體體競(jìng)爭(zhēng)相結(jié)結(jié)合。固體體相抗原原結(jié)合的特特定種類抗抗原的限制制數(shù)同液體體相中的的抗原數(shù)成成正比。夾夾心ELISA使使用固固體相上的的抗體作作為結(jié)合抗抗體。另一一種抗體體用作檢測(cè)測(cè)抗體。所所以，這便便形成了了一個(gè)夾心心，抗原位位于中間，，抗體在抗抗原分子子的兩側(cè)。。在表1中中對(duì)不同類類型ELISA用各各種肉的的抗原對(duì)原原料肉的確確認(rèn)進(jìn)行了了總結(jié)。最最近，單抗抗體技術(shù)也也應(yīng)用在ELISA中來對(duì)原原料肉進(jìn)行行確認(rèn)，ELISA也用于煮煮制肉品種種類的確認(rèn)認(rèn)中。2.3抗抗體的來來源在使用酶免免疫測(cè)定來來確認(rèn)肉的的種類成功功的發(fā)展的的過程中，，最重要的的是特定種種類的抗體體，不同種種動(dòng)物需要要不同的免免疫試劑。。傳統(tǒng)的來來講，在ELISA中應(yīng)用的的單抗體體來自免疫疫動(dòng)物的血血清。多克克隆抗體技技術(shù)在自然然界中是外外源的，亞亞群和特定定種類抗原原或相反種種類抗原相相結(jié)合。因因此可以十十分容易的的觀測(cè)到血血清和相關(guān)關(guān)種類抗原原的交叉反反應(yīng)。在檢檢測(cè)程度標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)發(fā)展過程中中，一組抗抗體親和力力和結(jié)合特性的變化化也引起了了人們的關(guān)關(guān)注。同多多克隆抗體體技術(shù)相反反，單克隆隆抗體技術(shù)術(shù)的來源－－單細(xì)胞鏈鏈在自然界界中是是同源的。。它們來自自融化得抗抗體分泌物物Blymphocytes,而這種種分泌物又又來自患有有骨髓瘤的的免疫老鼠鼠。融化的的產(chǎn)物叫雜雜交細(xì)胞，，可以在培培養(yǎng)基中生生長(zhǎng)，并且且可以繼續(xù)續(xù)的分泌抗抗體。經(jīng)過過仔細(xì)的鏡鏡檢和亞克克隆后，可可以挑選出出穩(wěn)定的雜雜交細(xì)胞鏈鏈，它可以以分泌出針針對(duì)某一特特定抗原的的抗體，而而且產(chǎn)生抗抗體十分頻頻繁。采用用單抗體的的方法來對(duì)對(duì)肉的種類進(jìn)進(jìn)行免疫分分析時(shí)，應(yīng)應(yīng)保證連續(xù)續(xù)供應(yīng)統(tǒng)一一的免疫試試劑，也應(yīng)應(yīng)減少標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)分析程序序。2.4抗抗原的選擇擇大多數(shù)對(duì)于于原料肉種種類的免疫疫檢測(cè)方法法都采用多多克隆方法法來處理整整個(gè)血清清或血清清蛋白。因因?yàn)檠宓暗鞍椎拇嬖谠诳赡苁潜乇仨毜模〖∪饨M織中中殘余的血血漿成分會(huì)會(huì)發(fā)生變化化，那么便便意味著肌肌肉組織的的存在，進(jìn)進(jìn)而可以得得出結(jié)論：：用這些多多克隆技術(shù)術(shù)來定量的的估計(jì)攙雜雜物的量是是不可靠的的。肌肉蛋蛋白質(zhì)的存存在是顯著著的,預(yù)示示了雞肉組織存在的的可能性比比血清蛋白白存在的可可能性要大大。對(duì)于肉肉種類的多多克隆技術(shù)術(shù)已用于可可溶性粗蛋蛋白的分析析中或凈化化肌肉成成分，例如如肌鈣蛋白白和肌紅蛋蛋白。這些些檢測(cè)方方法的優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)在于容易易獲得提取取樣品，更更重要的一一點(diǎn)在于對(duì)對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)測(cè)方法的改改進(jìn)與發(fā)展展。不溶性性肌肉蛋白白如連接蛋蛋白也可可以用于單單抗體的分分析方法中中，來確認(rèn)認(rèn)原料禽肉肉的種類。。然而不溶溶性蛋白的的提取需需要特殊的的步驟。這這些方法毫毫無疑問問的可以應(yīng)應(yīng)用于法律律事件的檢檢測(cè)中，但但不適用于常常規(guī)檢驗(yàn)分分析或產(chǎn)地地檢驗(yàn)。因?yàn)橥ㄟ^加加熱處理后后，大多的的蛋白質(zhì)變變性并且成成為不可溶溶的，所所以使用抗抗體來處置置本源蛋白白質(zhì)的方法法不可以以用于加熱熱處理過的的肉類。對(duì)對(duì)于加熱熱的肉類的的確認(rèn)也應(yīng)應(yīng)用熱穩(wěn)定定蛋白。在在解決特特定種類熱熱穩(wěn)定性組組成方面已已做了十十分大的努努力。用IEF方法法，Jones和和Mortiner(1985)說明明了來自自腎上腺和和肌肉組織織的BE抗抗原蛋白具具有熱穩(wěn)定定性。但但是不同類類型BE抗抗原的特性性是顯著不不同的，Sherikar使使用SDS-聚丙稀酰胺凝凝膠電泳的的方法檢測(cè)測(cè)了不同同種類的BE抗原，，并且得出出結(jié)論在BE蛋白中中肌鈣蛋白白T屬屬于特定定種類蛋白白部分。沒沒有經(jīng)經(jīng)過加加熱處理的的從肌肌肉組織織中分離的的具有抗熱熱性的糖糖蛋白白應(yīng)用于多多克隆抗體體技術(shù)中。。這些抗體體已應(yīng)用于于夾心ELISA中中用于鑒別別加熱和罐罐裝肉類食食物中。。這些方法法在商業(yè)檢檢測(cè)中是十十分有效的的，并并且也應(yīng)用用于USDA對(duì)加熱熱肉品種類類確認(rèn)的調(diào)調(diào)查中。大大多對(duì)于加加熱肉品種種類的確確認(rèn)中大大都使用多多克隆抗體體技術(shù)方法法.最近在在我們實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室中對(duì)單單克隆抗體體技術(shù)確認(rèn)認(rèn)加熱肉種種類的研究究中也取得得了一定定的進(jìn)進(jìn)展。用用于加熱處處理肉類蛋蛋白鑒別的的單克隆抗抗體技術(shù)也也可用于原原料肉的鑒鑒別中中，因?yàn)樵谠跍?zhǔn)備檢測(cè)測(cè)樣品時(shí)這這些原料肉肉可以十分分容易的被被加熱處理理。3單克隆隆抗體技術(shù)術(shù)用于加熱熱處理肌肉肉蛋白的確確認(rèn)

3.1單克克隆抗體介介紹用于熱穩(wěn)定定性或抗熱熱性蛋白的的不同抗原原已經(jīng)用于于發(fā)展抗體體技術(shù)來確確認(rèn)加熱肉肉品的種類類。熱穩(wěn)定定性這一個(gè)個(gè)詞在字典典中被十分分清晰的定定義，大多多情況下，，它指經(jīng)過過加熱處理理的肉類浸浸提物中保保持可溶性性和抗抗原性的完完整蛋白或或蛋白碎片片。如果果一種特定定分析蛋白白已知應(yīng)用用于一種特特定的種類類確認(rèn),那那么在免疫疫分析技術(shù)術(shù)中使用提純蛋蛋白可以增增加對(duì)于特特定種類抗抗原決定基基的免疫反反應(yīng)機(jī)會(huì)。。然而對(duì)于于雜交瘤的的分泌物并并不一定完完全需要提提純蛋白作作為抗原，，由于在挑挑選適宜特特定種類蛋蛋白主要方方面缺少足足夠多的知知識(shí)技術(shù)，，所以在單克克隆抗體技技術(shù)中我們們使用加熱熱處理過的的可溶性粗粗肌肉蛋白白作為免疫疫源。在加加熱之后，，純的肉類類蛋白質(zhì)顯顯著減少，，這樣在提提取物中只只有熱穩(wěn)定定性或熱抗抗性的部分分蛋白質(zhì)仍仍保持可溶溶性。對(duì)期期望的特性性應(yīng)用MABS（（單克隆抗抗體技術(shù)））檢測(cè)時(shí)應(yīng)選擇雜雜交克隆分分泌物，而而且必須要要經(jīng)過仔細(xì)細(xì)的鏡檢和和亞克隆。。對(duì)于準(zhǔn)備備抗原有兩兩種方法:1)用蒸蒸餾水或鹽鹽水對(duì)粗瘦瘦肉進(jìn)行攪攪拌，過濾濾物可以作作為免疫原原。2）瘦肉混混于0.15MNACL中，，沸水加熱熱并且離心心.上層液液121℃℃30分鐘鐘高溫滅菌菌過濾，用用90﹪乙乙醇進(jìn)行萃萃取，沉淀淀，干燥物物溶于鹽溶溶液中備用用。來自免免疫老鼠的的脾細(xì)胞與與骨髓瘤細(xì)細(xì)胞融合后后可作為雜雜交產(chǎn)物。。在我們的的實(shí)驗(yàn)室中中，遵守守由Kohler和和Milstern描述的一一般程序，，那便是在在隨后的步驟中中要進(jìn)行行必要的的修飾。。ELISA鏡鏡檢是用用于經(jīng)過過選擇實(shí)實(shí)驗(yàn)的與與抗原原對(duì)應(yīng)應(yīng)的克隆隆體，同同時(shí)用異異種的浸浸提物和和別的的食物蛋蛋白通過過交叉反反應(yīng)來穩(wěn)穩(wěn)定雜交交物。。雜交產(chǎn)產(chǎn)物具有有我們所所期望的的特性，，之之后通過過限定性性稀釋程程序?qū)χ寺≈林辽賰蓛纱我垣@獲得穩(wěn)定定的單克克隆細(xì)胞胞鏈。SDS和免免疫點(diǎn)點(diǎn)技術(shù)用用于確認(rèn)認(rèn)每每種單克克隆隆肉類浸浸提物種種抗原的的成分。。3.2單單克隆隆抗體的的特點(diǎn)目前為止止，五種種免疫球球蛋白單單克隆抗抗體技術(shù)術(shù)在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)中已用用于摻雜雜肉種類類的檢檢測(cè)。單單克隆抗抗體2F8同五五種經(jīng)過過加熱的的哺乳動(dòng)動(dòng)物肉發(fā)發(fā)生十十分強(qiáng)烈烈的反應(yīng)應(yīng)，但但不同任任何加熱熱的禽肉肉發(fā)生反反應(yīng)。3E12同禽肉肉反應(yīng)應(yīng)，5D2主要要用于雞雞和火雞雞的鑒別別中。9C6只只特定于于雞，5H9只只用于豬豬肉。第第一組組四四種單克克隆抗體體技術(shù)用用于經(jīng)水水或鹽水水浸提提過的經(jīng)經(jīng)過加熱熱處理的的肌肉蛋蛋白，它它們同同特別的加加熱肉提提取物發(fā)發(fā)生了強(qiáng)強(qiáng)烈的反反應(yīng)，但但不同原原料肉和和加熱處處理后的的肉相作作用。免免疫印跡跡結(jié)果表表明所有有的單克克隆抗體體同加熱熱處理肉肉提取物物中兩條條或更多多條蛋白白帶發(fā)生生反應(yīng)，，除了5H9以以外，但但它可檢檢測(cè)豬豬肉浸提提物中中單一帶帶。5H9也同同原料豬豬肉浸提提物的三三個(gè)蛋白白帶發(fā)生生反應(yīng)，，帶有24KD的蛋白白質(zhì)可以以被確認(rèn)認(rèn)為豬豬肉特特定定的熱穩(wěn)穩(wěn)定肌肉肉蛋白。。所有的單單克隆抗抗體也發(fā)發(fā)展成對(duì)對(duì)骨骼肌肌具有特特定的反反應(yīng)。表表3說明明了5H9對(duì)于于不同豬豬肉組織織和食物物蛋白的的免疫反反應(yīng)，也也同時(shí)說明明了5D2的特特性反應(yīng)應(yīng).這些些單克隆隆抗體對(duì)對(duì)于特定定骨骼肌肌而具有有的特點(diǎn)點(diǎn)不同于于別的已已報(bào)道的的結(jié)果，，別的報(bào)報(bào)道講已已觀察到這些些抗體對(duì)對(duì)器官，，心肌，，或平滑滑肌的交叉反反應(yīng)?；谔囟ǘ∪獾牡膯慰寺÷】贵w分分析可以以對(duì)樣品品中瘦肉肉進(jìn)行定定量分析析檢測(cè)。對(duì)對(duì)于定量量分析來來講抗原原均勻的的分布在在不同動(dòng)動(dòng)物的半半天肌肉肉組織中中是十分分重要的，，所以抗抗原的量量決定于于同樣品品中一定定目標(biāo)肌肌肉組織織的分析析反應(yīng)，，而不用用考慮肌肌肉切面面的位置置。單克克隆抗體體5H9用于于定量檢檢測(cè)牛肉肉制品中中不同切切面的豬豬肉含量量。無論論是使用用間接非非競(jìng)爭(zhēng)還還是競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)性ELISA技術(shù)，，都表示示在肉不不同的切切面整整個(gè)浸提提物蛋白白濃度和和豬肌肉肉組織得得測(cè)定數(shù)數(shù)量水平平?jīng)]有不不同。這這些結(jié)果果暗示，，由單克克隆抗體體5H9所檢測(cè)測(cè)得抗原原組成對(duì)對(duì)于制制造商十十分的適適用，它它可用于于定量檢檢測(cè)肉樣樣中豬瘦瘦肉。表4確確認(rèn)加加熱肉種種類時(shí)作作用于加加熱處理理蛋白質(zhì)質(zhì)的單克克隆抗體體的鑒別別特性單克隆抗體類型亞型鑒別種類抗原蛋白質(zhì)分子重量（kD)2F8IgG2b牛肉，豬肉，羊肉，馬肉，鹿肉

18.5－26.53E12IgG1雞肉，火雞肉，鴨肉

22－345D2IgG1雞肉，火雞肉

22－359C6IgG1雞肉

120，33.55H9IgG1豬肉

243.3摻摻雜肉類類的檢測(cè)測(cè)如表5所所示，間間接ELISA反應(yīng)的的吸光度度或者競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA反應(yīng)應(yīng)所表達(dá)達(dá)的抑制制百分率率和牛肉肉中豬肉肉的百分分量對(duì)數(shù)數(shù)之間存存在線形形關(guān)系。。表6所所展示的的是使用用間接和和競(jìng)爭(zhēng)ELISA應(yīng)用用單克隆隆抗體5D2來來定量檢檢測(cè)豬肉肉中雞肉肉含量的的藥劑反反應(yīng)水平平曲線,應(yīng)用間間接和競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA系統(tǒng)統(tǒng)來檢測(cè)測(cè)我們的的單克隆隆抗體可可以得到到一致的的結(jié)果，，說明這這些單克克隆抗體體在肉制制品的快快速檢測(cè)測(cè)或者摻摻雜肉種種類的確確認(rèn)方面面是十分分有效的的。檢樣摻雜違規(guī)規(guī)程度的判斷斷受限于分析析方法所能達(dá)達(dá)到的最低檢檢測(cè)水平，應(yīng)應(yīng)用傳統(tǒng)的瓊瓊脂膠體檢測(cè)測(cè)方法，它的的最低檢測(cè)量量通常在5－－10﹪。ELISA的的應(yīng)用已經(jīng)提提高了檢測(cè)能能力，但不能能檢測(cè)肉樣中中含量十分低低的摻雜肉類類。采用了了我們的分析析程序，這些些分析方法對(duì)對(duì)于摻雜種種類含量的檢檢測(cè)能力在0.5－1﹪﹪之間,可可以同大多的的已報(bào)道的用用于肉種類類確認(rèn)的ELISA方法法相比。對(duì)于于實(shí)際應(yīng)用來來講，摻雜雜肉1﹪的檢檢測(cè)能力力對(duì)于官官方的常規(guī)分分析檢測(cè)已足足夠?，F(xiàn)在確認(rèn)肉種種類的商業(yè)ELISA方方法一次只能能對(duì)單一的種種類進(jìn)行定量量檢測(cè)。如果果把之應(yīng)用到到管理當(dāng)中，，使用這些ELISA方方法來檢測(cè)測(cè)大量樣品中中復(fù)雜的肉種種類是十分費(fèi)費(fèi)時(shí)的而且花花費(fèi)十分大，，如果用單一一檢測(cè)方法來來區(qū)分不同肉肉的種類會(huì)更更昂貴更費(fèi)力。例例如應(yīng)用單克克隆抗體2F8來檢測(cè)加加熱家禽肉制制品中普通的的哺乳動(dòng)物肉肉的種類，應(yīng)用用單克隆抗體體3E12對(duì)對(duì)加熱的牛肉肉或豬肉中的的禽肉進(jìn)行單單一檢測(cè)，為為了進(jìn)一步的確確認(rèn)，從最初初的檢測(cè)中得得到的明確的樣品品，接下來可可以用單種類類的分析方法法進(jìn)行來確認(rèn)認(rèn)存在的特定定種類。3.4未來來的發(fā)展單種類的單克克隆抗體技術(shù)術(shù)的發(fā)展比多多種類的發(fā)展展更難，主要要因?yàn)閷?duì)于特特定種類抗原原確認(rèn)所檢測(cè)測(cè)的天然蛋白白抗原比動(dòng)物物學(xué)相關(guān)種類類的檢測(cè)蛋白白抗原更更稀少。對(duì)對(duì)于包括特定定種類抗體的的肌肉蛋白的的確認(rèn)可以為為單種類單克克隆抗體的有有效產(chǎn)物提供供有價(jià)值的信信息。豬類中中24kd熱熱穩(wěn)定肌肉蛋蛋白的發(fā)現(xiàn)可可以促進(jìn)單一一體的應(yīng)用，，來確認(rèn)特特定種類肌肌肉蛋白同同別的種類相相似或一致。對(duì)于于恢復(fù)多種類類的抗原有很很多影響因素素，例如PH值，鹽含量量，加熱方法法，而且為了了獲得準(zhǔn)確的的定量結(jié)果也也應(yīng)對(duì)基質(zhì)進(jìn)進(jìn)行仔細(xì)的研研究。與此同同時(shí)也應(yīng)大力力推進(jìn)基于單單一體的傳感感和別的免疫疫測(cè)定方法和和發(fā)展，例如如用一步分析析可以用于確確認(rèn)攙雜的水水平。4加熱終點(diǎn)溫溫度的確認(rèn)4.1非非免疫方法美國農(nóng)業(yè)部使使用基于減少少蛋白溶解性性或是酶活性性的各種方法法來驗(yàn)證肉制制品是否加熱熱到所需的最最低終點(diǎn)溫度度。依據(jù)產(chǎn)物物的類型和所所需的終點(diǎn)加加熱溫度來選選擇使用的方方法?，F(xiàn)行的的方法包括凝凝結(jié)實(shí)驗(yàn)，作作用于加熱溫溫度低于65℃的牛肉和和豬肉產(chǎn)品，，酸性磷酸鹽鹽反應(yīng)方法作作用于灌裝漢漢堡，后蝤肉肉和午餐肉.牛過氧化氫氫酶實(shí)驗(yàn)作用用于數(shù)量十分分少的烘烤和和加熱牛肉，但這些方法法自身由于其其經(jīng)驗(yàn)主義和和主觀主義而而受到批評(píng)。。在提高現(xiàn)有有方法方面已已做了十分多多的嘗試而且且已形成了新新的方法可以以更準(zhǔn)確的確確定加熱終點(diǎn)點(diǎn)溫度。許多多技術(shù)，例如如電泳法，色色譜法，微分分掃描測(cè)熱計(jì)計(jì)以及近紅外外線光譜法也也在嘗試著應(yīng)應(yīng)用在加熱終終點(diǎn)溫度確定定過程中。大大部分這些方方法主要的影影響因素是解解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果果的困難性,加熱終點(diǎn)點(diǎn)溫度相對(duì)精確確的估計(jì)，并且需要高高尖的設(shè)備，，操作人員要要進(jìn)行培訓(xùn)。。Callins等認(rèn)為為乳酸脫氫酶酶在豬肉和和牛肉加熱終終點(diǎn)溫度確定定中可作為分分析檢測(cè)指標(biāo)標(biāo)，因?yàn)槊傅牡幕钚酝訜釤嶂薪K點(diǎn)溫度度和攙雜肉的的加熱終點(diǎn)溫溫度呈反比例例的關(guān)系。另另外，許多方方法對(duì)內(nèi)源酶酶的剩余放射射性進(jìn)行檢測(cè)測(cè)，如磷酸激激酶，丙酮酸酸激酶，轉(zhuǎn)氨氨酶，氨基葡葡糖酶和磷酸酸丙糖異構(gòu)酶酶，同時(shí)這些些檢測(cè)方法也也被推薦用于于準(zhǔn)確的控制制肉制品的加加熱過程。4.2免疫疫方法

4.2.1乳乳酸脫氫酶的的抗體禽類制品所需需的加熱終點(diǎn)點(diǎn)溫度.火雞雞胸脯肉足足夠加熱過程程的指標(biāo)建議議是乳酸替代代了檢測(cè)酶活活性ELISA應(yīng)用單單克隆和多克克隆抗體檢測(cè)測(cè)本源乳酸脫脫氫酶的方法法已運(yùn)用到定定量測(cè)定減少少酶的濃度，，進(jìn)而可以確確定火雞和牛牛肉制品的終終點(diǎn)加熱溫度度，這個(gè)方法法可以區(qū)分1℃以下和71.1℃以以上加工的火火雞胸脯肉的的乳酸脫氫酶酶的濃度，這這正是非干制制脫氫酶，它它最合理的濃度為0.3㎎/kg肉.其結(jié)結(jié)果不受鹽含含量，產(chǎn)品包包裝尺寸，，煙熏時(shí)間表表或是加熱過過程之前肉肉經(jīng)過冷凍貯貯藏的影響。。然而，這種種方法在區(qū)分分加熱68.9℃和和71.1℃火雞大腿腿肉時(shí)效果果不好。因因?yàn)樵陔u胸脯脯和大腿肉中中存在的酶有有不同的熱穩(wěn)穩(wěn)定性。因?yàn)闉榧∪忸愋秃秃唾A存條件會(huì)會(huì)影響個(gè)體酶酶的數(shù)量和穩(wěn)穩(wěn)定性，所以以大多方法會(huì)會(huì)在使用時(shí)遇遇到困難，這這些方法基于于特殊酶的濃濃度或活性性來實(shí)現(xiàn)的的，而分布布在肌肉組組織中個(gè)體體酶時(shí)變化化的。4.2肌肌肉蛋白質(zhì)質(zhì)的單克隆隆抗體基于監(jiān)控平平均分布的的肌肉蛋白白質(zhì)反應(yīng)的的方法，可可以更好的的確定加熱熱終點(diǎn)溫度度。同加熱熱肉品反應(yīng)應(yīng)的單克隆隆抗體指示示在不同溫溫度下同加加熱肉肉品產(chǎn)生的的不同反應(yīng)應(yīng)，這一觀觀察結(jié)果暗暗示了使用用單克隆抗抗體來檢測(cè)測(cè)肌肉蛋白白質(zhì)熱變性性而作為肉肉制品足夠夠加熱過程程的指示指指標(biāo)的潛在在性，因?yàn)闉樵诖朔椒ǚㄖ惺褂玫牡腗ABS便是為了了應(yīng)用于加加熱處理的的肌肉蛋白白質(zhì)。我我們應(yīng)用ELISA技術(shù)分別別使用單克克隆抗體2f8和單單克隆抗體體5d2來來研究不同同內(nèi)部加熱熱溫度的牛牛肉和雞肉肉。如如表7所示示，當(dāng)樣品品加熱到60℃或更更低時(shí)和可可溶牛肉蛋蛋白質(zhì)浸提提物相結(jié)合合的單克隆隆抗體2f8是十分分少的。當(dāng)當(dāng)加加熱溫度從從60℃升升到66℃℃時(shí)ELISA反應(yīng)應(yīng)只有輕微的增增強(qiáng)。在表表7a可以以看到牛肉肉加熱在60－66℃和80℃之間時(shí)時(shí)免疫方法法顯著的增增加。在60－66℃范圍內(nèi)內(nèi)ELISA反應(yīng)和和加熱樣品品溫度是線線形關(guān)系，從而而這種方法法可以預(yù)測(cè)測(cè)加熱牛肉肉的加熱終終點(diǎn)溫度并并且在樣樣品中有有95﹪的的可信度，，誤差為±±1℃。在在加熱雞胸胸脯肉中也也觀測(cè)到了了單克隆抗抗體5D2的相同對(duì)對(duì)應(yīng)溫度但但同之呈線線性系的溫溫度范圍為為60－74℃.同一定定酶或蛋白白質(zhì)可溶性性減少或活活性削減典典型測(cè)定相相比這種方方法有更好好的應(yīng)用性性，因?yàn)樗梢酝ㄟ^過