分子診斷學(xué)5學(xué)分-蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）中山一院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部陳培松Whichistheoriginoflife？一、背景二、基本概念（掌握）三、特點(diǎn)四、內(nèi)容和技術(shù)五、應(yīng)用——omics？一、產(chǎn)生背景1.20世紀(jì)中后期，生命科學(xué)研究進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代。2.隨著人類基因組全序列測(cè)定，但基因本身不足以解讀復(fù)雜的生命現(xiàn)象。生命科學(xué)跨入了后基因組時(shí)代。Genome基因組研究是靜態(tài)研究，序列信息并不能告訴人們哪些基因在何時(shí)何地以何種程度表達(dá)，而生命的精確機(jī)制很大程度上正是基于這類基因的精確調(diào)控。TranscriptomemRNA豐度與蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性差。mRNA自身存在貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解、翻譯調(diào)控及產(chǎn)物的翻譯后加工，難以準(zhǔn)確地反映基因的最終產(chǎn)物基因功能的真正執(zhí)行體——蛋白質(zhì)的質(zhì)與量。蛋白質(zhì)存在復(fù)雜的翻譯后修飾（磷酸化、糖基化、乙?；?。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用等也無(wú)法從mRNA水平來(lái)判斷ProteomeDNAmRNAProtein蛋白質(zhì)組（proteome）是指特定細(xì)胞、組織、乃至機(jī)體作為一個(gè)生命單元中所有蛋白的合集，即生命體中攜帶的基因信息在某一時(shí)間段所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是對(duì)在特定時(shí)間和環(huán)境下所表達(dá)的群體蛋白質(zhì)研究的一門(mén)學(xué)問(wèn)二.概念

蛋白質(zhì)組(Proteome)一詞最早由澳大利亞學(xué)者Ｗｉｌｋｉｎｓ等于1994年提出。同基因組學(xué)一樣,蛋白質(zhì)組學(xué)不是一個(gè)封閉的、概念化的、穩(wěn)定的知識(shí)體系,而是一個(gè)領(lǐng)域。它旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式,其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的定性鑒定、定量檢測(cè)、細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用研究等,最終揭示蛋白質(zhì)功能,是基因組ＤＮＡ序列與基因功能之間的橋梁。三.蛋白質(zhì)組學(xué)研究的特點(diǎn)（1）整體性生命活動(dòng)依賴于各種蛋白的協(xié)調(diào)合作（2）揭示生命的動(dòng)態(tài)性過(guò)程同一細(xì)胞，在不同時(shí)期、不同條件下，蛋白質(zhì)組也是在不斷改變的。在病理或治療過(guò)程中，細(xì)胞蛋白質(zhì)的組成及其變化與正常生理過(guò)程的也不同。（3）體現(xiàn)生命現(xiàn)象的復(fù)雜性基因表達(dá)的精密多層次調(diào)控Glucocorticoidreceptor（GR）,

CodingGene：NR3C1四.蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容及技術(shù)表達(dá)蛋白組學(xué)（2-D電泳）結(jié)構(gòu)蛋白組學(xué)（晶體結(jié)構(gòu)分析）功能蛋白組學(xué)（EMSA,COIP等）五、蛋白質(zhì)組研究的相關(guān)技術(shù)（一）蛋白質(zhì)的分離

1.二維凝膠電泳（twodimensionalelectrophoresis，2-DE）。

2.操作（1）等電聚焦凝膠電泳（2）SDS電泳（3）圖像分析

（二）2-D膠上蛋白質(zhì)鑒定和測(cè)序（1）早期Westernblot鑒定（2）質(zhì)譜技術(shù)MS是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量、電荷比值差異來(lái)確定相對(duì)分子質(zhì)量的技術(shù)。電噴霧離子化（eletrosprayionozation，ESI）和基質(zhì)輔助的激光解吸離子化（MALDI）。（3）Edman降解法鑒定（4）蛋白質(zhì)組信息學(xué)WesternBlottingImmunalBlotting印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。→Northern印跡法→Western印跡法免疫標(biāo)記技術(shù)ElisaWesternBlottingImmunohistochemistryInsituhybridization蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印十二烷基磺酸鈉―聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）固相免疫測(cè)定SDS在緩沖液中添加SDS的電泳系統(tǒng)稱為SDS(十二烷基硫酸鈉）膠片電泳SDS是一種離子性的界面活性劑,帶強(qiáng)的負(fù)價(jià)，可以使蛋白本身帶的電荷忽略不計(jì)決定不同蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素轉(zhuǎn)印/印記蛋白質(zhì)印跡法首先是要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）或者PVDF膜上三明治封閉印跡首先用蛋白溶液（如10％的BSA/脫脂奶粉）→一抗特異性的結(jié)合抗原（一抗孵育）二抗孵育適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體。處理后，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。顯色/發(fā)光印跡用酶連二抗處理后，再用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚恚?dāng)酶催化底物生成有顏色的產(chǎn)物時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生可見(jiàn)的區(qū)帶，指示所要研究的蛋白質(zhì)的位置。比較蛋白的差異性表達(dá)（三）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析1.實(shí)際測(cè)定具體蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)：X-射線單晶衍射分析（晶體結(jié)構(gòu)分析）、多維核磁共振波譜分析、電鏡二維晶體三維重構(gòu)術(shù)（電子晶體學(xué)）。

X-射線單晶衍射分析：最成熟和最有力的方法。局限性：晶體2.通過(guò)氨基酸序列知識(shí)去辨識(shí)和推引出其決定的三維結(jié)構(gòu)（1）用分子力學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)的方法，根據(jù)理化的基本原理，從理論上計(jì)算蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。（2）通過(guò)對(duì)已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，找出一級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系，總結(jié)出規(guī)律，用于新蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

1.研究蛋白質(zhì)組的高通量方法。分別收集細(xì)胞不同區(qū)域內(nèi)蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行2-D電泳和蛋白質(zhì)鑒定。2.將胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察蛋白質(zhì)移位。（四）研究蛋白質(zhì)胞內(nèi)分布及移位的方法（1）凝膠滯后實(shí)驗(yàn)（gelretardation）（2）DNAaseI足紋分析（DNAaseIfootprinting）（3）核酸—蛋白質(zhì)雜交實(shí)驗(yàn)（五）蛋白質(zhì)—核酸相互作用的研究凝膠滯后實(shí)驗(yàn)（gelretardation）凝膠滯后實(shí)驗(yàn)（gelretardation）DNAaseI足紋分析（DNAaseIfootprinting）核酸—蛋白質(zhì)雜交實(shí)驗(yàn)（southwesternblot）（六）蛋白質(zhì)之間的相互作用蛋白質(zhì)相互作用的基本形式（1）分子和亞基的聚合（2）蛋白分子雜交（3）分子識(shí)別（4）分子自我裝備（5）多酶聚合體蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)方法生化方法

●共純化、共沉淀，在不同基質(zhì)上進(jìn)行色譜層析●蛋白質(zhì)親和色譜

基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)改基質(zhì)時(shí)，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來(lái)2.免疫的方法免疫共沉淀（COIP）3.酵母雙雜交系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：（1）蛋白質(zhì)不必純化（2）在活體內(nèi)進(jìn)行，能真實(shí)模擬在體的情況（3）可以檢測(cè)短暫或者微弱的相互作用（4）可以用于分析不同功能的蛋白缺點(diǎn)：（1）定位于核內(nèi)（2）假陽(yáng)性（3）需要進(jìn)一步確證蛋白質(zhì)組學(xué)研究的應(yīng)用1.用于尋找疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)：標(biāo)志物。2.用于微生物蛋白組研究，徹底闡明病原微生物的致病機(jī)理并尋找全新的藥物作用靶點(diǎn)。3.蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)將成為藥物設(shè)計(jì)的路標(biāo)。4.對(duì)不同生物的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較性研究，可以對(duì)生物進(jìn)化途徑提供參考，對(duì)多細(xì)胞生物的起源提供線索。5.追蹤胞內(nèi)信號(hào)分子的移位，闡明目標(biāo)蛋白質(zhì)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的位置。Screenthedifferentiallyexpressedproteins2-DElectrophoresisScreenthedifferentially

expressedproteinspotsproteinextractCollectspecimenscancerNCMBiomarkerfordiagnosistreatmentandprognosisMS(ESI-MS-MS)identificationUnknownknown